王偉，俞國峰，程夢(mèng)婷，趙蓉，劉珍

(溫州醫(yī)科大學(xué)，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江省遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州　325035)

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血壓的性別差異與小鼠腎臟鈉離子通道的關(guān)系

王偉，俞國峰，程夢(mèng)婷，趙蓉，劉珍*

(溫州醫(yī)科大學(xué)，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江省遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州325035)

目的研究雌雄小鼠的血壓、腎臟尿鈉排泄以及相關(guān)的腎臟鈉離子通道和信號(hào)通路，初步探討血壓的性別差異與腎臟鈉離子通道的關(guān)系。方法選取成年雌雄小鼠，用無創(chuàng)血壓儀檢測(cè)小鼠血壓，火焰分光光度計(jì)測(cè)量小鼠血、尿鈉離子濃度，Real-time PCR和Western-Blot檢測(cè)小鼠腎臟鈉氯同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NCC)、鈉鉀氯同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NKCC2)、上皮鈉離子通道(ENaC)的表達(dá)水平，以及上游的缺乏賴氨酸的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(WNK激酶)的mRNA水平。 結(jié)果雌鼠血壓低于雄鼠，尿鈉排泄高于雄鼠，NCC、NKCC2的mRNA和蛋白水平均明顯增加，ENaC無明顯差異，WNK4顯著升高，WNK1無差異。結(jié)論雌鼠血壓低于雄鼠可能是由雌鼠尿鈉排泄增加導(dǎo)致，WNK4-NCC/NKCC2信號(hào)通路參與其調(diào)控。

性別；血壓；鈉離子通道；WNK；小鼠

血壓存在兩性差異，女性在絕經(jīng)前的血壓和高血壓的患病率均低于男性，其具體機(jī)制尚未完全闡明[1,2]。血壓的調(diào)控受多種因素影響[3]，其中腎臟起著至關(guān)重要的作用[4,5]。已有報(bào)道，腎臟主要通過腎素血管緊張素醛固酮(RAAS)系統(tǒng)[6]調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)[7]以維持血壓平衡。大量的研究表明，性別與RAAS系統(tǒng)密切相關(guān)[8-12]。其中腎臟中參與血壓調(diào)節(jié)的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有鈉氯同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NCC)，鈉鉀氯同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NKCC2)以及上皮鈉離子通道(ENaC)等[13]。

近來研究發(fā)現(xiàn)，NCC/NKCC2受WNK- SPAK/OSR1-NCC/NKCC2信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[14-16]。WNK激酶是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族新成員，自2001年耶魯大學(xué)首次提出WNK突變會(huì)導(dǎo)致一種新型的家族性高血鉀高血壓(FHHt)后，WNK激酶對(duì)腎臟離子通道影響的研究成為熱點(diǎn)。

本研究通過分析雌、雄小鼠的血壓、腎臟鈉離子通道以及WNK信號(hào)通路的異同，以期發(fā)現(xiàn)它們之間的關(guān)聯(lián)，初步探討血壓的性別差異與腎臟鈉離子通道的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20～24周齡的SPF級(jí)C57BL/6J雌、雄小鼠各10只，體重20～25 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2012-0002]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(浙)2015-0009]進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)中涉及的動(dòng)物操作均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則。

1.2主要儀器及試劑

儀器：小鼠代謝籠購自北京佳源興業(yè)科技有限公司；小鼠無創(chuàng)血壓計(jì)(BP-98A)購自日本Softron公司；火焰分光光度計(jì)(PFP7)購自英國JENWAY公司；蛋白電泳儀(Bio-Rad 通用蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng))；蛋白印跡成像系統(tǒng)(Bio-Rad Chemi Doc MP)；Real-time PCR System(Bio-Rad：CFX96系統(tǒng))。

試劑：TRIzol?RNA分離試劑購自Life Technologies；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)；熒光定量試劑盒SYBR(Bio-Rad)；蛋白濃度定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific)。

抗體：兔抗鼠NCC (Stress Marq)；兔抗鼠NKCC2 (Stress Marq)；兔抗鼠WNK4 (Alpha Diagnostic)；兔抗鼠ENaC (Alonmone)；兔抗鼠β-actin (Beyotime)。

1.3血壓的測(cè)量

采用尾套法測(cè)量小鼠尾動(dòng)脈血壓。小鼠在訓(xùn)練3 d后每天固定時(shí)間測(cè)量至少20個(gè)循環(huán)，持續(xù)測(cè)量5～7 d的血壓。

1.4血鈉與尿鈉的檢測(cè)分析

血鈉：小鼠麻醉后眼眶靜脈取血，低速離心取上清，用火焰光度計(jì)檢測(cè)血清鈉水平。

尿鈉：小鼠置于代謝籠，期間供給常規(guī)飼料和自由飲水，待其穩(wěn)定后收集尿樣，用火焰光度計(jì)檢測(cè)尿鈉離子濃度。

1.5腎臟相關(guān)蛋白分子的檢測(cè)

1.5.1轉(zhuǎn)錄水平—Real-time PCR

小鼠麻醉后取腎臟，按照TRIzol試劑盒操作說明裂解分離提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，按照Real-time PCR儀器操作要求進(jìn)行熒光定量分析。其中所用的引物序列如下：

Renin (F:5’-ATGAAGGGGGTGTCTGTG-3’;R:5’-ATGTCGGGGGAGGGTGGGC-3’);

NCC (F:5’-GGGTTTGTGTCATGAGGAT-3’;R:5’-AGATGGTGCTAGCCTGCT-3’);

NKCC2 (F:5’-CCAGAGCGTTGTCTAAAGC-3’;R:5’-TGGGCAGCTGTCATCACTTA-3’);

WNK4 (F:5’-GCGGAGGAGGTGGCT-3’;R:5’-GCCACTGGCTGGTAGTCA-3’);

WNK1 (F:5’-GTCTGGACACCGAAACCAC-3’;R:5’-AGAAACTACTAGTAGTAGCAAAATCCT-3’);

Cyclophilin (F:5’-CGTGGCTCCGTTGTCTT-3;R:5’-TGACTTTAGGTCCCTTCTTCT-3’)。

1.5.2蛋白水平—Western-blot

小鼠麻醉后取腎臟，裂解提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。一抗均為兔抗鼠單克隆抗體，稀釋度為1:2000。為避免免疫印跡不同標(biāo)本蛋白量不同造成的影響，免疫印跡結(jié)果用β-actin進(jìn)行矯正。二抗均為山羊抗兔單克隆抗體，稀釋度為1:4000。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果

2.1血壓和鈉代謝

基礎(chǔ)狀態(tài)下，雌鼠血壓明顯低于雄鼠(F:117.6±0.54 vs M:110.0±0.67 mmHg,P< 0.05，圖1A)，伴隨雌鼠腎素mRNA水平升高50%(圖1B)。雖然雌、雄小鼠血鈉水平無明顯差異(圖1C)，但雌鼠尿鈉排泄明顯高于雄鼠(F:514.30±23.1 vs M:365.0±27.2 μmol/24 h，P< 0.05，圖1D)。這提示雌鼠血壓低于雄鼠可能是由雌鼠尿鈉排泄增加導(dǎo)致。

注: *P < 0.05；NSP>0.05，與雄鼠相比。圖1　雌雄小鼠的血壓、腎素、血鈉和尿鈉的分析Note. *P < 0.05；NSP>0.05，compared with M group.Fig.1　Analysis of blood pressure, renin, plasma sodium level and urinary sodium excretion in male and female mice

2.2腎臟鈉離子通道蛋白

在腎臟鈉分泌中起重要調(diào)控作用的鈉離子通道蛋白主要有遠(yuǎn)曲小管的鈉氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體(NCC)、髓袢升支粗段的鈉鉀氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體(NKCC2)和皮質(zhì)集合管處的上皮鈉離子通道蛋白(ENaC)。為研究雌、雄小鼠血壓與腎臟鈉離子通道的關(guān)系，我們檢測(cè)了上述通道的mRNA和蛋白水平表達(dá)量。

2.2.1NCC(sodium chloride cotransporter)鈉氯同向轉(zhuǎn)運(yùn)體

如圖2A所示，Western-blot結(jié)果顯示，與雄鼠相比，雌鼠NCC 蛋白表達(dá)量增加約80%，Real-time PCR顯示雌鼠NCC的mRNA水平比雄鼠增加70%(圖2B)。

2.2.2鈉鉀氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na-K-2Cl cotransporter-2, NKCC2)

如圖3A 的Western-blot結(jié)果顯示：相對(duì)于雄鼠，雌性小鼠NKCC2 蛋白表達(dá)量升高一倍。Real-time PCR顯示雌鼠NKCC2的mRNA水平高于雄鼠約60%(圖3B)。

2.2.3ENaC-β(epithelial sodium channel)上皮鈉離子通道蛋白

雌、雄小鼠ENaC轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A、4B)。

注：(A)蛋白印跡分析;(B)實(shí)時(shí)熒光定量分析;*P < 0.05，與雄鼠相比。圖2　雌雄小鼠腎臟NCC的表達(dá)Note. A: Western-blot ; B: Real-time PCR analysis；*P < 0.05，compared with M group.Fig.2　The expression of NCC in male and female mice

注：(A)蛋白印跡分析; (B)實(shí)時(shí)熒光定量分析;*P < 0.05，與雄鼠相比。圖3　雌雄小鼠腎臟NKCC2的表達(dá)Note.(A)Western-blot ; (B)Real-time PCR analysis；*P < 0.05，compared with M group.Fig.3　The expression of NKCC2 in male and female mice

注：(A)蛋白印跡分析; (B)實(shí)時(shí)熒光定量分析; NSP > 0.05，與雄鼠相比。圖4　雌雄小鼠腎臟ENaC-β的表達(dá)Note.(A)Western-blot ; (B)Real-time PCR analysis；NSP > 0.05，compared with M group.Fig.4　The expression of ENaC-β in male and female mice

2.3WNK激酶

通過檢測(cè)WNK 激酶家族中的WNK1和WNK4，發(fā)現(xiàn)雌鼠腎臟WNK4 轉(zhuǎn)錄水平高于雄鼠約50%(圖5A)，而WNK1在雌、雄小鼠之間無顯著差異(圖5B)。

注: *P < 0.05；NSP > 0.05，與雄鼠相比。圖5　實(shí)時(shí)熒光定量分析WNK4和WNK1 的mRNA水平Note. *P < 0.05；NSP > 0.05，compared with M group.Fig.5　Real-time PCR analysis of WNK4 and WNK1 mRNA expression

3　討論

大量研究表明，血壓存在著一定的性別差異，已發(fā)現(xiàn)與同齡男性相比，絕經(jīng)前女性的血壓較低，但具體機(jī)制尚未闡明。我們發(fā)現(xiàn)雌鼠的血壓低于雄鼠，雖然之前Swasti Tiwari[17]報(bào)道雌、雄小鼠血壓差別不明顯，可能是小鼠的背景不同，或是血壓測(cè)量方法不同導(dǎo)致。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)可維持血壓的平衡，我們的結(jié)果顯示，雌鼠腎素水平高于雄鼠，可能是血壓低導(dǎo)致的反饋性上升。

血壓的調(diào)控受多方面影響，其中腎臟鈉離子的重吸收對(duì)維持血壓的穩(wěn)定起著重要調(diào)控作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，雌鼠尿鈉排泄升高，這可能是導(dǎo)致雌鼠血壓下降的一個(gè)重要因素。尿鈉的排泄增加一般會(huì)伴隨著腎臟鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道的下降，但是我們的研究表明，NCC、NKCC2的表達(dá)量上升，這和雌鼠血壓下降、排鈉增多的結(jié)果相悖，其具體機(jī)制未知，可能是鈉排泄增加導(dǎo)致的NCC、NKCC2代償性上升[18-23]。

已有研究表明，WNK激酶與SPAK/OSR1形成的信號(hào)通路對(duì)NCC &NKCC2 起著重要的調(diào)控作用，Rojas-Vega[24]報(bào)道，雌鼠的SPAK/OSR1明顯高于雄鼠，我們的結(jié)果顯示，雌鼠WNK4的表達(dá)量明顯高于雄鼠,WNK1無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示W(wǎng)NK4-SPAK /OSR1-NCC/NKCC2信號(hào)通路可能參與雌雄小鼠血壓差異的調(diào)控。

綜上所述，不同性別小鼠之間存在血壓差異，這一差異與腎臟的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道 NCC /NKCC2 以及WNK4激酶信號(hào)通路密切相關(guān)，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究[25-27]。

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Relationship between gender difference of blood pressure and sodium ion channels in the kidney of mice

WANG Wei, YU Guo-feng, CHENG Meng-ting, ZHAO Rong, LIU Zhen*

(Wenzhou Medical University,School of Laboratory Medicine and Life Science,Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical,Wenzhou 325035,China)

ObjectiveStudy on the blood pressure, renal sodium excretion, related renal sodium ion channels and signaling pathways between male and female mice, to investigate the relationship between gender differences in blood pressure and renal sodium ion channel.MethodsBlood pressure of adult female and male mice was measured using tail-cuff sphygmomanometer. Plasma and urine electrolytes were performed using flame photometer.Protein levels of renal sodium transporters NCC, NKCC2, ENaC were determined by western blot, mRNA levels of these transporters and the upstream With No lysine (WNK) kinases were determined by Real-time PCR.ResultsThe blood pressure of female mice was significantly lower than that of male mice. Renal sodium excretion and mRNA levels of NCC&NKCC2 were increased significantly in female mice. No obvious difference was observed in ENaC. The mRNA level of WNK4 was increased while no change in WNK1.ConclusionsThe lower blood pressure of female mice may caused by increasing renal sodium excretion and WNK4-NCC/NKCC2 signaling pathway involved.

Gender; Blood pressure; Sodium ion channels; WNK; Mice

國家自然科學(xué)基金(81300709)；浙江省自然科學(xué)基金(LY13H070007)。

王偉(1986-)，男，研究生，專業(yè)：生物學(xué)。E-mail: aster2103@126.com。

劉珍(1975-)，女，教授，研究生導(dǎo)師，研究方向：腎臟生理學(xué)。E-mail: zhenliuus@163.com。

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0013-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.003

2016-03-30