李航，龔寶勇，羅銀珠，吳玉娥，陳梅玲，陳銳，劉曉霖，王暉，黃韌，張鈺*

(1.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州　510663；2.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州　510006)

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耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型的建立

李航，龔寶勇1，羅銀珠1，吳玉娥1，陳梅玲1，陳銳1，劉曉霖1，王暉2，黃韌1，張鈺1*

(1.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510663；2.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州510006)

目的 為新藥篩選建立耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型。方法對(duì)免疫抑制ICR小鼠靜脈注射臨床耐氟康唑白色念珠菌CaR，通過(guò)臨床癥狀、生存情況、組織載菌量、組織病理、細(xì)胞因子分析以及藥物治療等方法對(duì)模型評(píng)價(jià)。結(jié)果CaR感染小鼠在接種后第1天出現(xiàn)死亡，相比臨床藥敏菌株CaS感染組，16 d觀察期內(nèi)動(dòng)物死亡率無(wú)顯著性差異(CaR, 90.7%; CaS, 86.2%,P=0.158)，但觀察早期CaR組死亡比CaS組快。感染第4天，不同組織均可檢測(cè)到念珠菌，并發(fā)現(xiàn)與CaS組相比，腎、腦組織載菌量具有顯著性差異。真菌引起的典型肉芽腫樣是腎、腦、心的主要組織病理學(xué)特征。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腎組織細(xì)胞因子，IL-1α、IL-6、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子變化顯著，與CaS組比較，IL-1α和IFN-γ顯著升高，TNF-α顯著下降。CaR和CaS感染小鼠給予10 mg/kg氟康唑治療，死亡率分別為83.3%、37.5%，具有顯著性差異。結(jié)論本研究成功建立了耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型，有望成為抗感染新藥研發(fā)的重要工具。

耐藥白色念珠菌；感染；模型

白色念珠菌是一種常見(jiàn)的二相性條件致病菌，平時(shí)以酵母相寄居在人體中，酵母相白色念珠菌一般不致病。由于艾滋病、癌癥放化療、器官移植等患者免疫功能低下或免疫功能受到抑制，酵母相白色念珠菌會(huì)由共生菌發(fā)芽增殖為菌絲相致病菌，此時(shí)白細(xì)胞對(duì)其吞噬率及殺滅率大幅降低，這導(dǎo)致臨床上白色念珠菌感染的比例大大提高[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全身性白色念珠菌感染有著高達(dá)31.8%的死亡率[2]，也是醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房第四大血液感染因素[3,4]。

氟康唑?yàn)榈谌蝾?lèi)抗真菌藥，自上市后憑借良好的臨床療效被廣泛應(yīng)用，但長(zhǎng)期大劑量使用導(dǎo)致院內(nèi)感染耐藥菌分離率越來(lái)越高，趙德軍等[5]檢測(cè)出院內(nèi)感染白色念珠菌的耐氟康唑菌株可達(dá)10.4%，劉宇[6]在院內(nèi)感染白色念珠菌感染中耐氟康唑菌株檢出率也有10.0%，可見(jiàn)院內(nèi)感染中白色念珠菌耐藥菌感染問(wèn)題日益嚴(yán)峻，這就亟需開(kāi)展及加強(qiáng)抗耐藥白色念珠菌藥物的研究。動(dòng)物模型作為疾病機(jī)理和藥物開(kāi)發(fā)研究的重要工具，建立耐藥念珠菌感染動(dòng)物模型對(duì)開(kāi)展耐藥菌株的藥物篩選具有重要意義。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)5～6周齡雌性ICR小鼠，體重24～26 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2013-0002]，飼養(yǎng)在廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所負(fù)壓屏障小鼠房[SCXK(粵)2012-0122]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(粵)2013-0002]。實(shí)驗(yàn)研究計(jì)劃通過(guò)廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所IACUC審查(編號(hào)：IACUC2012006)。

1.2供試菌株

臨床耐氟康唑菌株CaR、臨床藥敏菌株CaS[7]由中國(guó)科學(xué)院北京微生物研究所張立新研究員惠贈(zèng)，均置于-80℃冰箱保存。使用前利用活菌計(jì)數(shù)法確定菌液濃度。

1.3環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制

ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按體重(100 mg/kg)腹腔注射環(huán)磷酰胺(CY)，連續(xù)注射3 d。

1.4感染動(dòng)物生存實(shí)驗(yàn)

小鼠隨機(jī)分為兩組，分別尾靜脈注射濃度為5.0×105CFU/mL的CaR、CaS菌液0.2 mL/只。每天定時(shí)觀察感染小鼠臨床癥狀及生存情況，及時(shí)將死亡小鼠取出。記錄小鼠弓背、眼睛或鼻子出現(xiàn)分泌物、呼吸異常、離群等異常情況，當(dāng)小鼠出現(xiàn)不能行走、瀕臨死亡時(shí)進(jìn)行安樂(lè)死，記做第二天死亡。觀察16 d，統(tǒng)計(jì)小鼠生存情況。

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1組織載菌量檢測(cè)

在感染第2、4、6天，每組5只小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦組織取出后稱(chēng)重，加入1.0 mL無(wú)菌生理鹽水研磨至勻漿，確定適當(dāng)稀釋度，吸取0.2 mL勻漿液接種于YEPD培養(yǎng)基，計(jì)算各組織載菌量。

1.5.2組織病理診斷

在感染第4天，每組3只小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦組織取出后放入10%福爾馬林溶液中，制備病理切片，進(jìn)行HE染色和PAS染色。

1.5.3細(xì)胞因子檢測(cè)

將感染第4天小鼠腎組織勻漿液4℃低溫冷凍離心機(jī)3000 r/min離心10 min，取上清液做細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.6模型的藥效評(píng)價(jià)應(yīng)用

CaR組和CaS組小鼠尾靜脈注射5.0×105CFU/mL白色念珠菌0.2 mL/只，在感染后5 h給予小鼠按體重(10 mg/kg)灌胃給予臨床藥物氟康唑治療，連續(xù)給藥5 d。觀察16 d，統(tǒng)計(jì)小鼠生存情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1耐藥念珠菌感染小鼠臨床癥狀及生存情況

CaR組和CaS組小鼠感染白色念珠菌臨床癥狀基本一致，感染后體質(zhì)明顯虛弱、立毛嚴(yán)重，眼部出現(xiàn)分泌物，CaR組感染第一天出現(xiàn)死亡，而CaS組在感染第二天出現(xiàn)死亡。在感染早期，CaR感染小鼠死亡率比CaS感染高，中位生存期分別為3.3 d、6.8 d；感染后期小鼠出現(xiàn)身體傾斜、偏頭等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；尸體剖檢，可見(jiàn)感染小鼠腎腫大，表面有白色斑點(diǎn)，其它組織未見(jiàn)明顯病變。16 d觀察期內(nèi)，兩種菌株感染動(dòng)物死亡率分別為90.7%、86.2%，無(wú)顯著差異，結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。圖1　白色念珠菌感染小鼠生存曲線(n=29)Note.3 independent experiments.Fig.1　Survival curves of mice infected with Candida albicans

注： *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，與CaS組相比。圖2　組織載菌量(n=5)Note. *P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，Compared with the CaS group.Fig.2　Fungal burden in tissues

2.2指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1耐藥念珠菌感染小鼠組織載菌量變化

感染第2天CaR組小鼠各組織均可檢測(cè)到念珠菌，隨著感染時(shí)間的推移，各組織載菌量逐漸下降。其中，感染主要靶器官腎組織載菌量較高，大于107CFU/g組織，腦的載菌量在103～104CFU/g組織，明顯高于CaS感染，具有顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)圖2。 2.2.2感染小鼠組織病理變化

CaR組小鼠各組織均可檢測(cè)到念珠菌。組織病理檢測(cè)顯示，腎、心、腦等能觀察到典型的病理變化。其中，腎組織的病理變化最為嚴(yán)重，HE染色顯示，大部分腎小體結(jié)構(gòu)破壞，病灶周?chē)霈F(xiàn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管出血。心組織可觀察到病灶中出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴隨著細(xì)胞壞死，心肌纖維斷裂；大腦皮質(zhì)內(nèi)也能觀察到組織結(jié)構(gòu)的破壞，病灶中性粒細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)。以上組織PAS染色病理切片均顯示病灶區(qū)出現(xiàn)大量紅色深染的酵母型、菌絲型共生的白色念珠菌。

肺、脾、肝組織較少出現(xiàn)典型的組織結(jié)構(gòu)破壞，結(jié)果見(jiàn)圖3。

以上組織病理變化與CaS感染小鼠組織相比未見(jiàn)明顯變化。

注：(A、C、E、G、I、K)腎、心、腦、肺、脾、肝HE染色切片；(B、D、F、H、J、L)腎、心、腦、肺、脾、肝PAS染色切片。圖3　CaR組感染第4天小鼠組織切片(×20,bar=100 μm)Note.(A,C,E,G, I,K)H&E staining of kidney, heart, brain, lung, spleen, liver;(B,D,F,H,J,L)PAS staining of kidney, heart, brain, lung, spleen, liver.Fig.3　Infected mice of CaR group tissue sections at day 4 after infection

2.2.3耐藥念珠菌感染小鼠免疫因子的變化

我們利用流式細(xì)胞儀對(duì)感染第4天小鼠腎組織勻漿液上清液進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF-α、IL-1α、IFN-γ顯示明顯升高，表現(xiàn)典型的非特異免疫反應(yīng)。CaR組與CaS組比較，在感染第4天，IL-1α、IFN-γ顯示明顯升高，TNF-α明顯下降，具有顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)圖4。

注：**P < 0.01,***P < 0.001，與CaS組相比。圖4　感染小鼠第4天腎組織細(xì)胞因子含量(n=5)Note. **P < 0.01,***P < 0.001，Compared with the CaS group. Fig.4　Cytokine content of mice kidney at day 4 after infection

2.3耐藥念珠菌感染小鼠的藥效評(píng)價(jià)

CaR和CaS小鼠感染1.0×105CFU/只，給予10 mg/kg氟康唑藥物進(jìn)行治療，在16 d觀察期內(nèi)，CaS組生存率明顯升高，CaS組和CaR組動(dòng)物死亡率分別為37.5%、83.3%，具有顯著性差異(圖5)。

注：*P < 0.05，與CaS組相比。3次獨(dú)立試驗(yàn)。圖5　白色念珠菌感染小鼠給藥后生存曲線(n=29)Note. *P < 0.05，Compared with the CaS group.3 independent experiments.Fig.5　Survival curves of mice infected with Candida albicans after administration

3　討論

根據(jù)經(jīng)典白色念珠菌彌散性感染小鼠模型的建立方法[8]，腹腔注射環(huán)磷酰胺以降低小鼠體內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量[9]，模擬臨床免疫抑制及免疫功能低下患者；然后尾靜脈注射耐藥念珠菌CaR(1.0×105CFU/只)，成功建立了耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型。該模型以死亡為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在感染16 d內(nèi)，動(dòng)物死亡率約為90%。

CaR組與CaS組感染小鼠顯示相似的疾病特征，在感染的早期階段，雖然兩組感染小鼠的生存分析不能顯示顯著性差異，但CaR組小鼠中位生存時(shí)間3.3 d，明顯低于CaS組6.8 d；又因感染念珠菌小鼠的腎指數(shù)變化與其腎臟載菌量、病理變化呈正相關(guān)，腎指數(shù)能夠較準(zhǔn)確的反應(yīng)機(jī)體感染白念菌的程度[10]，在感染初期CaR組腎組織載菌量明顯高于CaS組，說(shuō)明CaR菌株毒力與CaS菌株相比較強(qiáng)。

該模型顯示出典型的彌散性感染特征。組織病理檢測(cè)顯示，腎、腦、心組織能觀察到典型的病灶，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。小鼠實(shí)質(zhì)組織感染第2天就能檢測(cè)到念珠菌，其中腎組織載菌量最高，隨著感染時(shí)間的推移，組織載菌量逐漸下降。說(shuō)明感染初期動(dòng)物感染最為嚴(yán)重，隨后機(jī)體進(jìn)行非特異性免疫，促炎因子IL-6，IL-1α，TNF-α、IFN-γ顯著升高，有效調(diào)控了機(jī)體的抗感染過(guò)程。兩組小鼠IL-1α、IFN-γ的顯著性差異由念珠菌感染程度不同引起，同時(shí)說(shuō)明IL-1α、IFN-γ在抗感染過(guò)程中起重要作用。

利用建立的耐藥念珠菌小鼠模型進(jìn)行氟康唑藥效評(píng)價(jià)，給予10 mg/kg的氟康唑，CaS組小鼠死亡率明顯減低，而CaR組小鼠死亡率較高，說(shuō)明CaR組小鼠不能獲得有效保護(hù)，耐藥模型對(duì)氟康唑表現(xiàn)出耐藥性。該模型的建立為我們提供了耐藥菌株體內(nèi)藥物篩選和致病機(jī)理研究的平臺(tái)，這為后期研究抗感染新藥提供體內(nèi)篩選模型工具。

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The establishment of the drug-resistant Candida albicans disseminated infected mice model

LI Hang1,GONG Bao-yong1,LUO Yin-zhu1, WU Yu-e1, CHEN Mei-ling1,CHEN Rui1, LIU Xiao-lin1, WANG Hui2, HUANG Ren1, ZHANG Yu1*

(1.GuangDong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals,Guangzhou 510663,China;2.College of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China)

Objective Establishing the drug-resistant Candida albicans disseminative infected mice model for new drug screening. Methods The disseminative infected mouse model was generated by intravenously injecting a clinical Drug-resistant Candida albicans strain (CaR) to immunosuppressive ICR mice. The features of model was evaluated by clinical symptom, survival condition, fungal burden in tissue, histopathology, cytokines assay and medication. ResultsAfter infected with CaR (0 day), the death of mice started at the first day, though, compared to clinical drug sensitive strain (CaS) infected group, the difference of mortality rate in 16-day observation period was not significant in two groups (CaR, 90.7%; CaS, 86.2%,P=0.158), mice in CaR group died faster than those in CaS group at the early stage; On the fourth day of infection, Candida albicans could be detected in the different tissues, and we found fungal burden in kidney and brain was a significant difference. The typical granuloma caused by fungal infection was the main histopathological feature observed in the kidney, brain and heart. Cytokines in renal tissue were detected by flow cytometry, The changes of IL-1α,IL-6,TNF-αand IFN-γin kidney were significant. Compared with CaS group, IL-1 and IFN-γ were significantly higher and TNF-αdecreased significantly in CaR group.The mice of groups CaR and CaS were treated with 10 mg/kg fluconazole, the mortality rates were 83.3% and 37.5%, which have a significant difference. ConclusionsIn this study, we successfully established a drug-resistant Candida albicans disseminative infected mice model which is potential tool for the development of new anti-infectious agent.

Drug-resistant Candida albicans; Infected;Model

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A010107018)。

李航(1988-)，男，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型。

張鈺(1970-)，女，研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型。E-mail: zhangyugzh@hotmail.com。

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0025-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.005

2015-10-26