劉菊菊，李書國，鄧娟娟，葉明，張丹，彭燕，朱正庭

(三峽大學第一臨床學醫(yī)學院&宜昌市中心人民醫(yī)院老年病科，湖北 宜昌　443003)

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高齡大鼠血管鈣化及血管壁骨橋蛋白、骨鈣素表達的研究

劉菊菊，李書國*，鄧娟娟，葉明，張丹，彭燕，朱正庭

(三峽大學第一臨床學醫(yī)學院&宜昌市中心人民醫(yī)院老年病科，湖北 宜昌443003)

目的 研究高齡大鼠血管鈣化的發(fā)生情況，以及骨橋蛋白(osteopontin, OPN)、骨鈣素(osteocalcin， OC)在高齡大鼠動脈血管壁表達的變化。方法選擇20只20月齡的SD大鼠為實驗組，20只3月齡的SD大鼠為對照組，取大鼠的主動脈條、心臟和腎組織備檢。HE染色觀察血管形態(tài)，Von Kossa染色判斷鈣鹽沉積程度，免疫組化和蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)測定血管壁OPN、OC的表達情況。結果實驗組大鼠血管平滑肌細胞排列紊亂，中膜層厚度增加，彈力板斷裂，血管纖維化程度增高；對照組大鼠血管內(nèi)膜內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞排列整齊，彈力板完整。實驗組大鼠的大動脈和微小動脈內(nèi)均可見鈣鹽沉積，對照組動脈未見鈣鹽沉積。實驗組大鼠血管壁OPN、OC的表達較對照組明顯上調(diào)(P< 0.05)。結論血管中膜鈣化可能是血管老化的病理表現(xiàn)，血管鈣化的形成可能與骨形成相關蛋白OPN和OC的表達上調(diào)有關。

血管鈣化；血管老化；骨橋蛋白；骨鈣素

隨著人口老年化的發(fā)展，血管老化的形成機制及血管老化相關疾病的防治正在成為人們研究的熱點。血管鈣化是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、慢性腎臟病和衰老等病理狀態(tài)的共同表現(xiàn)[1]。它的主要特征是動脈壁彈性降低和血流阻滯，最終可導致缺血性心臟病和腦卒中，是心腦血管疾病高發(fā)病率和高死亡率的重要原因之一。目前研究表明血管鈣化是一個與骨發(fā)育相似的主動的、高度可調(diào)的病理生理過程[2]。研究表明，衰老的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)向成骨樣細胞表型轉(zhuǎn)換在年齡相關的血管鈣化中起重要作用[3]。通過對衰老的微陣列分析得出基因調(diào)節(jié)的差別與血管鈣化有關，這些基因包括基質(zhì)Gla蛋白,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2),骨保護素(osteoprotegerin,OPG)，I型膠原及骨橋蛋白(osteopontin,OPN)，骨鈣素(osteocalcin， OC)等[4]。本項研究擬觀察自然衰老大鼠血管的鈣化情況，通過檢測大鼠血管壁OPN和OC表達，探討OPN和OC與大鼠衰老以及鈣化的關系。

1　材料和方法

1.1實驗動物

3月齡健康雄性SD大鼠共20只，體重230～250 g；20月齡高齡雄性大鼠20只，體重750～900 g，由三峽大學醫(yī)學院實驗動物中心[SYXK(鄂)2011-0061] [SCXK(鄂)2011-0012]提供，符合國家醫(yī)學動物使用標準[動物許可證號：42010200000381]。飼養(yǎng)條件：溫度(24±2)℃，濕度50%～70%，采用12 h:12 h晝夜間斷照明；大鼠自由進水，普通飲食，并按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2主要試劑

Von kossa染色試劑盒(谷歌生物技術有限公司);OPN多克隆抗體(福州邁新);OC多克隆抗體(SANTA CRUZ 生物技術公司);SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒(福州邁新)。

1.3實驗方法

1.3.1實驗動物分組、標本收集與處理

青年大鼠為對照組，高齡大鼠為實驗組。給予普通飼料喂養(yǎng)2周后，腹腔注射10%水合氯醛(0.3～0.4 mL/100g)麻醉大鼠。無菌條件下剪開胸、腹腔，采用4%的多聚甲醛灌注。灌注完成之后小心剝離出完整的主動脈(從主動脈根部至髂總動脈分叉處)，并取下大鼠的心臟和腎臟放入4%多聚甲醛溶液中備檢，常規(guī)石蠟包埋；一部分主動脈直接置于-80℃冰箱保存，以供Western-blot檢測。

1.3.2標本組織的病理形態(tài)學觀察

1.3.2.1蘇木精 — 伊紅染色(HE染色)

取出各組石蠟包埋切片，①二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水：二甲苯Ⅰ 20 min→二甲苯Ⅱ 15 min→二甲苯Ⅲ 10 min→無水乙醇Ⅰ 5 min→無水乙醇Ⅱ 3 min→95%酒精1 min→90%酒精1 min→80%酒精1 min→70%酒精1 min；②染色：蘇木精染核7 min→自來水洗2 min；③分化和漂洗：1%鹽酸酒精2～5s→自來水洗5～7 min；④：復染：1%水溶性伊紅2～4 min→自來水洗1 min；⑤：脫水和透明：95%酒精1 min→無水乙醇Ⅰ 1 min→無水乙醇Ⅱ 2 min→二甲苯Ⅱ 2 min；⑥封片：切片風干后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3.2.2馮庫薩染色(Von Kossa染色)

首先石蠟切片脫蠟脫水；之后在良好的日光下或紫外燈下用2%硝酸銀侵染20～60 min；隨后蒸餾水洗5 min；然后用5%的硫代硫酸鈉水溶液處理2 min；之后用自來水洗5 min；然后再用0.1%核固紅染液復染2～3 min；之后蒸餾水洗5～10 s；最后無水乙醇脫水，二甲苯透明，風干后中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3.3標本組織的免疫組織化學染色

取大鼠組織進行石蠟切片后，采用免疫組織化學三步法，OPN抗體為工作液、OC抗體采取1:30稀釋。整個過程按照試劑盒說明書進行。依次對切片進行脫蠟、梯度酒精水化、抗原修復、血清封閉、一抗孵育、二抗標記、DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明、干燥、封片等主要步驟。每批免疫組化均設有PBS代替的陰性對照。

1.3.4Western-blot

將主動脈剪碎后置于玻璃勻漿器中，每20 mg組織加入150～250 μL RIPA裂解液。充分裂解后，按BCA蛋白定量檢測試劑盒測定組織總蛋白含量。取適量各組總蛋白樣品與5×Sample Buffer混勻，100℃煮沸5 min，按蛋白定量25 μg/孔上樣，進行電泳、轉(zhuǎn)膜、麗春紅染色、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯影。膠片風干后經(jīng)電腦成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖像，以內(nèi)參β-actin的蛋白條帶灰度值作為對照，分析OPN、OC表達的相對量。

1.4統(tǒng)計學方法

2　結果

2.1組織病理形態(tài)學觀察

HE染色光鏡觀察，可見血管的基本結構。對照組血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞排列整齊，彈力板完整、無斷裂(如圖1-A)；實驗組血管內(nèi)皮細胞脫落，VSMCs增殖、排列紊亂、并向內(nèi)膜遷移，中膜層厚度增加，彈力板斷裂(如圖1-B)。

注：(A)對照組；(B)實驗組。圖1　各組大鼠主動脈HE染色(×40,bar=10 μm)Note.(A)control group;(B)experimental group. Fig.1　HE staining of rat，s thoracic aorta

2.2Von Kossa染色評估血管鈣化

各組大鼠的標本經(jīng)Von Kossa染色后，若有鈣鹽沉積，則該區(qū)域呈黑褐色，背景呈紅色。青年組大鼠血管未見明顯鈣鹽沉積，核染為粉紅色(如圖2-A1，A2，A3)；高齡組大鼠主動脈、冠狀動脈和腎臟內(nèi)的微小動脈均可見大量明顯的黑色鈣鹽沉積(如圖2-B1，B2，B3)。

注：(A)對照組；(B)實驗組；(1)胸主動脈；(2)冠狀動脈；(3)微動脈。圖2　各組標本Von Kossa染色(×40,bar=10 μm) Note.(A)control group；(B)experimental group；(1)thoracic aorta；(2)coronary；(3)arterioles.Fig.2　Von Kossa staining of the specimens

2.3各實驗組大鼠標本OPN免疫組化結果

OPN可表達于不同動物的不同組織中，在正常的骨組織和腎組織中均有表達，但正常的血管中OPN基本不表達或表達甚微，而在鈣化的血管中OPN的表達則會明顯增加，主要位于細胞質(zhì)或細胞核。本實驗免疫組化結果顯示，OPN在青年大鼠的胸主動脈、冠狀動脈和腎臟中的小動脈呈弱陽性表達(如圖3-A1，A2，A3)；在高齡大鼠的胸主動脈，冠狀動脈和腎臟的微小血管中均呈強陽性表達，可見血管壁的中膜和外膜處有大量棕黃色物質(zhì)沉積(如圖3-B1，B2，B3)。

注：(A)對照組；(B)實驗組；(1)胸主動脈；(2)冠狀動脈；(3)微動脈。圖3　各組OPN免疫組化染色(×40,bar=10 μm)Note.(A)control group；(B)experimental group；(1)thoracic aorta；(2)coronary；(3)arterioles.Fig.3　OPN immunohistochemical staining of the thoracic aorta

2.4各組大鼠標本OC免疫組化結果

OC是由成骨細胞和類似成骨細胞的鈣化血管細胞分泌的蛋白。本實驗免疫組化結果顯示，實驗組胸主動脈、心臟和腎臟的血管壁上VSMCs包漿內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒(如圖4-B1，B2，B3)，而對照組大鼠極少見(如圖4-A1，A2，A3)。

注：(A)對照組；(B)實驗組；(1)胸主動脈；(2)冠狀動脈；(3)微動脈。圖4　各組OC免疫組化染色(×40，bar=10 μm)Note.(A)control group；(B)experimental group；(1)thoracic aorta；(2)coronary；(3)arterioles.Fig.4　OC immunohistochemical staining of thoracic aorta

2.5各組大鼠動脈OPN、OC Western-blot檢測結果

用Western-blot 檢測各組大鼠主動脈組織OPN和OC蛋白的表達水平，用電腦成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶，以內(nèi)參β-actin條帶的灰度值作為對照，分析蛋白表達的相對量，結果如下圖5所示。實驗組大鼠主動脈OPN和OC蛋白的表達量較對照組明顯升高，其差異有統(tǒng)計學意義。

注：*P < 0.05，與對照比較。圖5　各組大鼠胸主動脈OPN和OC Western blot檢測結果Note. *P < 0.05，compared with the control group.Fig.5　OPN and OC Western blot results of thoracic aorta

2.6統(tǒng)計學分析

采用Spearman分析血管組織中OPN和OC蛋白表達的相關性得，r=0.641，P< 0.01，即高齡大鼠血管壁OPN和OC表達同時增加有相關性。采用2檢驗分析OPN和OC的表達與血管鈣化的關系，OPN與血管鈣化的2值為17.128，P<0.05；OC與血管鈣化的2值為14.169，P< 0.05，可見高齡大鼠血管壁鈣化與OPN和OC的表達增加有關。

3　討論

引起生物體衰老的原因幾乎涉及到每一個細胞和生物學過程。Lopez-Otin等[5]總結認為個體衰老可能與：基因損傷應答改變、端粒丟失、基因調(diào)節(jié)改變、蛋白質(zhì)平衡失調(diào)、營養(yǎng)信號通路改變、線粒體功能紊亂、細胞衰老、干細胞損耗以及炎癥等過程相關。隨著年齡的增長，這些因素相繼發(fā)生作用，器官和細胞老化程序進展。血管作為機體的主要器官之一，其衰老過程亦是整個機體衰老過程的關鍵因素。血管老化時心血管疾病危險因子增加，發(fā)病率和死亡率增高，血管鈣化的發(fā)生率也逐漸增加。

通過HE染色發(fā)現(xiàn)，青年組大鼠血管壁內(nèi)膜較薄，中膜VSMCs排列規(guī)則，結構完整；高齡大鼠的血管壁較青年大鼠而言其中膜明顯增厚，VSMCs增生、排列紊亂并向內(nèi)膜遷移，彈力板有斷裂，還可見內(nèi)皮細胞部分脫落。這提示年齡的增加會導致大鼠的動脈發(fā)生老化。VSMCs是組成血管中膜的主要細胞，其主要功能是維持血管張力，VSMCs的異常增殖和遷移是血管老化的主要病理變化[6]。VSMCs的增殖與遷移受到多種生長刺激因子和抑制因子的雙重調(diào)節(jié)，在正常情況下VSMCs的增值與凋亡維持平衡，血管老化時某些細胞因子通過刺激信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡使維持這一平衡的基因表達發(fā)生異常改變，VSMCs的增殖失控。生玉平等[7]通過對大鼠主動脈衰老進程的比較蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)老年組與成年組相比較，有49個差異蛋白點，其中有17個蛋白的差異在1.5倍以上，其中包含Profilin-1和PrelaminA。Profilin-1是一種低分子量的肌動蛋白結合蛋白，能夠參與調(diào)控肌動蛋白的聚合-解聚平衡，在血管細胞增殖及重塑中有著極為重要的作用。有研究表明[8]，Profilin-1能夠通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，參與血管老化過程。在高齡大鼠血管中，Profilin-1表達水平上調(diào)，激活MAPK，活化的MAPK可激活轉(zhuǎn)錄因子，增加VSMCs的DNA合成，促進其增殖、遷移，以及向成骨細胞轉(zhuǎn)化。Warren DT等[9]研究發(fā)現(xiàn)，PrelaminA在細胞內(nèi)的大量堆積會破壞了核染色體和DNA損傷修復途徑，干擾了細胞核的空間劃分，進而促進了VSMCs的衰老。

我們通過Von Kossa染色發(fā)現(xiàn)，高齡大鼠的大動脈(見圖-2B1)和微小動脈(見圖-2B2)均有鈣化，可見血管鈣化與血管老化一樣是系統(tǒng)性的過程，這可能與血管老化時，衰老的VSMCs向成骨細胞表型轉(zhuǎn)化有關。Johnson RC等[3]研究發(fā)現(xiàn)，VSMCs衰老時向成骨細胞表型轉(zhuǎn)換在年齡相關的血管鈣化中起著重要作用。該研究通過對衰老的血管平滑肌細胞和年輕的血管平滑肌細胞對比研究發(fā)現(xiàn)，在成骨細胞中高表達的基因如：核心結合蛋白因子2(runt-related transcription factor-2,RUNX-2)，堿性磷酸酶(ALP)和I型膠原等均在衰老的VSMCs中高表達。

OC是構成骨基質(zhì)的重要成分之一，絕大部分OC是由成骨細胞和類似成骨細胞的鈣化血管細胞分泌的，是成骨細胞最終分化的特異性標志[10]。有研究顯示[11]，OC的表達在成骨細胞的表型發(fā)育過程中呈階段特異性，只有在成骨細胞成熟的最后一個階段，即基質(zhì)礦化期開始之后，OC基因才被誘導表達。本研究的免疫組化結果顯示在高齡大鼠的血管中OC的表達較青年大鼠而言明顯上調(diào)，這進一步說明在血管老化的過程中VSMCs確實會向成骨細胞分化，并且非常成熟。OC與羥基磷灰石有很高的結合力[12]，這說明它能夠促進血管鈣化。

多項研究顯示[13,14]，OPN是骨形成過程中重要的細胞因子，也是血管鈣化的標志性蛋白。OPN是一種磷酸糖蛋白粘附分子，主要存在于富含礦物的牙齒和骨骼中，它可與破骨細胞表面的整合素ανβ3受體相結合，使局部的微環(huán)境酸化，礦物質(zhì)溶解，進而抑制羥基磷灰石結晶的生長。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，OPN可以通過其精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列與羥基磷灰石晶體表面結合阻止其增大，進而抑制血管鈣化的形成。體外實驗研究表明[16]，成骨細胞中OPN mRNA水平隨著鈣化的進展而進一步升高。Hofbauer等[17]通過對OPN-/-MGP-/-和OPN+/+MGP-/-的小鼠對比研究發(fā)現(xiàn)，OPN-/-MGP-/-小鼠模型的鈣化速度加快了，由此證明了OPN可以抑制血管鈣化。在本研究發(fā)現(xiàn)，高齡大鼠的血管中OPN表達明顯上調(diào)，這可能是由于血管老化引起血管鈣化的正反饋作用，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，通過對高齡大鼠血管鈣化以及相關蛋白的研究發(fā)現(xiàn)：高齡大鼠的血管壁中膜厚度增加，VSMCs增生、排列紊亂并向內(nèi)膜遷移，血管纖維化程度增高；血管老化時，VSMCs發(fā)生增殖、遷移及向成骨細胞轉(zhuǎn)化，OC的表達上調(diào)，促進血管中膜鈣化；老化血管的鈣化可以促進鈣化抑制因子OPN的表達。

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Research on the vascular calcification and the expressions of osteopontin and osteocalcin in the arterial wall of aged rats

LIU Ju-ju, LI Shu-guo*, DENG Juan-juan, YE Ming, ZHANG Dan, PENG Yan, ZHU Zheng-ting

(Department of Geriatrics,The First College of Clinical Medical Science, China Three Gorges University &Yichang Central People，s Hospital, Yichang, 43003, China)

Objective This study was designed to investigate the morphology of vascular calcification in aged rats and the expressions of osteopontin and osteocalcin in the arterial wall of old rats. Methods 20 20-month-old SD rats were recruited in experimental group and 20 3-month-old SD rats were recruited in control group. Aorta, heart and kidney of the rats were collected for assay. HE staining and Von Kossa staining were used to determine the vascular calcification. The expressions of OPN and OC in vascular wall were tested by Immuno- histochemistry and Western-blot. ResultsIn the experimental group, vascular smooth muscle cells are disordered arrangement, thickness of membrane layer is increased, elastic plate fracture and the vascular fibrosis is increased. In the control group, vascular endothelial cells and smooth muscle cells are arranged in neat, elastic plate is complete. In the experimental group, the large artery and small artery were observed the calcium salt deposits. In the control group，arteries were not observed calcium salt deposits. Compared with the control group, the expressions of OPN and OC were significantly increased in the experimental group (P< 0.05). ConclusionsVascular medial calcification may be pathological features of vascular aging. Vascular calcification may be related with the up - regulated expression of bone-associated protein OPN and OC.

Vascular calcification; Vascular aging; Osteopontin; Osteocalcin

劉菊菊(1991-)，女，碩士研究生，專業(yè)：內(nèi)科學。E-mail: 286051889@qq.com。

李書國(1969-)，男，碩士生導師， E-mail: alener508@126.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0054-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.010

2016-03-07