陳平，鐘琦，李祖飛，陳學(xué)軍，張洋，黃志剛

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院，北京100730)

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喉鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP-11、COL11A1 mRNA的表達(dá)變化及其意義

陳平，鐘琦，李祖飛，陳學(xué)軍，張洋，黃志剛

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院，北京100730)

目的觀察喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)組織中基質(zhì)金屬蛋白酶11(MMP-11)及COL11A1基因的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 行手術(shù)治療的LSCC患者45例，術(shù)中留取LSCC組織及癌旁正常組織，采用real-time PCR檢測(cè)MMP-11 mRNA及COL11A1 mRNA，分析MMP-11、COL11A1 mRNA與LSCC臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 LSCC組織、癌旁正常組織中MMP-11 mRNA表達(dá)上調(diào)分別為39、13例，COL11A1 mRNA表達(dá)上調(diào)分別為45、41例。LSCC組織、癌旁正常組織中MMP-11 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.226±0.143、0.892±0.036，COL11A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.842±0.218、1.493±0.063，兩種組織相比，P均<0.05。LSCC組織中MMP-11 mRNA與COL11A1 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.648，P<0.05)。不同年齡、TNM分期患者腫瘤組織中MMP-11 mRNA表達(dá)上調(diào)情況相比，P均<0.05。不同臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的LSCC患者腫瘤組織中COL11A1 mRNA表達(dá)上調(diào)情況相比，P均<0.05。MMP-11 mRNA表達(dá)上調(diào)組5年生存率為55.5%，MMP-11 mRNA表達(dá)下調(diào)組為83.3%，兩組相比，P<0.05。COL11A1 mRNA表達(dá)上調(diào)組5年生存率為53.7%，COL11A1 mRNA表達(dá)下調(diào)組為80.0%，兩組相比，P<0.05。結(jié)論 LSCC組織中MMP-11、COL11A1 mRNA表達(dá)均上調(diào)，二者可能協(xié)同參與了LSCC的發(fā)生與發(fā)展。

喉癌；鱗狀細(xì)胞；基質(zhì)金屬蛋白酶11基因；COL11A1基因

喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，標(biāo)化死亡率約為1.1/10萬(wàn)。局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是LSCC患者生存率低的主要原因[1]。許多基因的異常表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。腫瘤細(xì)胞在侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中要突破細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)這一天然屏障，而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解ECM最主要的酶[3]。MMP-11是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其在早期乳腺癌[4]、結(jié)腸癌[5]、肺癌[6]等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)。MMP-11能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與轉(zhuǎn)錄因子SP1能夠結(jié)合到MMP-11近端啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的GC盒從而上調(diào)MMP-11基因的表達(dá)有關(guān)[7]。最新研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子SP1能夠正調(diào)節(jié)COL11A1基因的近端啟動(dòng)子活動(dòng)[8]。COL11A1基因編碼膠原Ⅺ的α1鏈，COL11A1基因突變可導(dǎo)致Ⅱ型Stickler綜合征[9]、骨關(guān)節(jié)炎[10]等疾病。膠原Ⅺ通過(guò)活化局部粘著斑激酶(FAK)導(dǎo)致E-鈣黏蛋白(E-cadherin)黏連復(fù)合物解聚，抑制細(xì)胞之間黏附，影響組織的完整性從而有利于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[11]。但是關(guān)于MMP-11及COL11A1與LSCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前少有報(bào)道。為此，本研究觀察了LSCC組織中MMP-11、COL11A1 mRNA的表達(dá)變化，探討兩者表達(dá)與LSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系，分析二者在LSCC發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料2009年10月～2013年9月于北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院手術(shù)的LSCC患者45例。經(jīng)組織病理檢查確診為鱗狀細(xì)胞癌，未接受放化療，無(wú)其他腫瘤病史，參與研究前均簽署知情同意書(shū)。患者均為男性，年齡41～72歲，早期(TNM分期Ⅰ～Ⅱ期)19例、晚期(Ⅲ～Ⅳ期)26例，高分化12例、中分化28例、低分化5例，聲門(mén)上型24例、聲門(mén)型19例、聲門(mén)下型2例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。取患者手術(shù)切除的LSCC組織及癌旁正常組織(距離腫瘤組織>1 cm)，一部分立即置于液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。

1.2LSCC組織中MMP-11、COL11A1 mRNA檢測(cè)用TRIzol通用型RNA快速提取試劑盒提取組織標(biāo)本中的總RNA，使用M-MLV-轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，2×Ex TaqMix試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH mRNA作為內(nèi)參，上游引物序列為5′- CACCCTTTCTTGACAAAACCT-3′，下游引物序列為5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGA-3′；MMP-11 mRNA上游引物序列為5′-TGAGTGCCCGCAACCG-3′，下游引物序列為5′-GGCGTCACATCGCTCCATA-3′；COL11A1 mRNA上游引物序列為5′-GGAGCAAAAGGGGATGGG-3′，下游引物序列為5′-TTGGAGGACAAGATTGGTAAAGG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量，>1為表達(dá)上調(diào)，<1為表達(dá)下調(diào)。

2　結(jié)果

2.1LSCC組織中MMP-11、COL11A1 mRNA表達(dá)變化LSCC組織、癌旁正常組織中MMP-11 mRNA表達(dá)上調(diào)分別為39、13例，COL11A1 mRNA表達(dá)上調(diào)分別為45、41例。LSCC組織、癌旁正常組織中MMP-11 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.226±0.143、0.892±0.036，COL11A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.842±0.218、1.493±0.063，兩種組織相比，P均<0.05。LSCC組織中MMP-11 mRNA與COL11A1 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.648，P<0.05)。

2.2MMP-11、COL11A1 mRNA表達(dá)與LSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系不同年齡、TNM分期患者腫瘤組織中MMP-11 mRNA表達(dá)上調(diào)情況相比，P均<0.05。不同臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的LSCC患者腫瘤組織中COL11A1 mRNA表達(dá)上調(diào)情況相比，P均<0.05。

2.3MMP-11、COL11A1 mRNA表達(dá)與LSCC患者預(yù)后的關(guān)系隨訪截至2016年3月，45例患者均無(wú)失訪，死亡16例。至隨訪結(jié)束時(shí)，MMP-11 mRNA表達(dá)上調(diào)組有15例死亡、生存時(shí)間為(33.6±2.3)個(gè)月，而MMP-11 mRNA表達(dá)下調(diào)組僅有1例死亡、生存時(shí)間為(60.6±3.7)個(gè)月。COL11A1表達(dá)上調(diào)組有15例死亡、生存時(shí)間為(33.5±2.4)個(gè)月，而COL11A1表達(dá)下調(diào)組僅有1例死亡、生存時(shí)間為(58.1±3.7)個(gè)月。MMP-11 mRNA表達(dá)上調(diào)組5年生存率為55.5%，MMP-11 mRNA表達(dá)下調(diào)組為83.3%，兩組相比，P<0.05。COL11A1 mRNA表達(dá)上調(diào)組5年生存率為53.7%，COL11A1 mRNA表達(dá)下調(diào)組為80.0%，兩組相比，P<0.05。

表1　 MMP-11、COL11A1 mRNA表達(dá)與LSCC臨床病理參素的關(guān)系(例)

注：與年齡>60歲者相比，*P<0.05；與Ⅰ～Ⅱ期者相比，#P<0.05；與高分化者相比，△P<0.05；與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，☆P<0.05。

3　討論

在呼吸道腫瘤中，LSCC的發(fā)病率僅次于肺癌，并且容易發(fā)生局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[1]。惡性腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移可分為幾個(gè)步驟:細(xì)胞黏附性改變、基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)降解、新生血管形成及腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。

MMP-11是腫瘤細(xì)胞主動(dòng)配體，在腫瘤侵襲、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[12,13]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MMP-11在肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[4～6]。在頭頸腫瘤中也發(fā)現(xiàn)MMP-11過(guò)表達(dá)，但對(duì)于MMP-11與頭頸腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系尚無(wú)定論[14]。本研究結(jié)果顯示，MMP-11 mRNA在LSCC組織中呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，此外，隨患者年齡、腫瘤分期增加，MMP-11表達(dá)逐漸增高，說(shuō)明MMP-11的異常表達(dá)可能與LSCC的發(fā)展有關(guān)。

膠原Ⅺ是較小的纖維狀膠原，最常見(jiàn)于軟骨中，是一個(gè)由定位于不同的染色體上α1、α2、α3鏈組成的異源三聚體，膠原Ⅺ合成為原膠原并且蛋白水解產(chǎn)生成熟的三聚體[8]。COL11A1基因位于染色體1p21區(qū)域，編碼Ⅺ型膠原α1亞基，而Ⅺ型膠原遍布體內(nèi)各種器官和組織，是細(xì)胞外基質(zhì)中的框架結(jié)構(gòu)[15]。COL11A1基因編碼的膠原Ⅺ的α1鏈基因突變與許多肌肉骨骼疾病有關(guān)，如Stickler綜合征[9]、骨關(guān)節(jié)炎[10]等。COL11A1基因在頭頸腫瘤組織中也有過(guò)表達(dá)的相關(guān)報(bào)道，但作用機(jī)制仍有待研究[16]。因此，有學(xué)者[17]推測(cè)COL11A1基因過(guò)表達(dá)在腫瘤的形成和進(jìn)展中都起重要作用。本研究結(jié)果顯示，COL11A1 mRNA在LSCC組織中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)狀態(tài)，并與LSCC臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示COL11A1 mRNA基因過(guò)表達(dá)可能是腫瘤早期侵襲的標(biāo)志[18]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，MMP-11 mRNA與COL11A1 mRNA在LSCC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，推測(cè)MMP-11、COL11A1的作用機(jī)制與共同受Sp1的調(diào)控有關(guān)。生存分析結(jié)果顯示，MMP-11 mRNA表達(dá)上調(diào)組、COL11A1 mRNA表達(dá)上調(diào)組患者的生存率均低于表達(dá)下調(diào)組，提示MMP-11與COL11A1基因高表達(dá)可能與LSCC的不良預(yù)后有關(guān)。Sp1在上皮細(xì)胞G1期中的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程[10]。MMP-11上游-25 bp和-68 bp處存在GC-盒(GCBox)，而轉(zhuǎn)錄因子Sp1通過(guò)GCbox正調(diào)控腫瘤組織中MMP-11的表達(dá)[10]；同時(shí)，雖然COL11A1基因上游缺少GCBox，但Sp1可與九核蛋白結(jié)合區(qū)域相結(jié)合從而增強(qiáng)COL11A1基因的轉(zhuǎn)錄[8]。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，MMP-11 mRNA、COL11A1 mRNA在LSCC組織中呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，二者可能協(xié)同參與了LSCC的發(fā)病和進(jìn)展。然而，本研究納入病例數(shù)較少，且均為男性患者，上述結(jié)論仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] Haddad RI, Shin DM. Recent advances in head and neck cancer[J]. N Engl J Med, 2008,359(11):1143-1154.

[2] Arantes LM, De Carvalho AC, Melendez ME, et al. Methylation as a biomarker for head and neck cancer[J]. Oral Oncol, 2014,50(6):587-592.

[3] Singh D, Srivastava SK, Chaudhuri TK, et al. Multifaceted role of matrix metalloproteinases (MMPs)[J]. Front Mol Biosci, 2014,2:19.

[4] Ren F, Tang R, Zhang X, et al. Overexpression of MMP family members functions as prognostic biomarker for breast cancer patients: a sstematic review and meta-analysis[J]. PLoS One, 2015,10(8):e0135544.

[5] Cini C, Wolthuis A, D′Hoore A. Peritoneal fluid cytokines and matrix-metalloproteinases as early markers of anastomotic leakage in colorectal anastomosis. A literature review and meta-analysis[J]. Colorectal Dis, 2013, 15(9):1070-1077.

[6] Hadler-Olsen E, Winberg JO, Uhlin-Hansen L. Matrix metalloproteinases in cancer: their value as diagnostic and prognostic markers and therapeutic targets[J]. Tumour Biol, 2013,34(4):2041-2051.

[7] Barrasa JI, Olmo N, Santiago-Gómez A, et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate MMP11 gene expression through Sp1/Smad complexes in human colon adenocarcinoma cells[J]. Biochim Biophys Acta, 2012,1823(2):570-581.

[8] Watanabe K, Hida M, Sasaki T, et al. Sp1 upregulates the proximal promoter activity of the mouse collagen alpha1(XI) gene(Col11a1) in chondrocytes[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2015,52(2):235-242.

[9] Richards AJ, Fincham GS, Mcninch A, et al. Original article: Alternative splicing modifies the effect of mutations in COL11A1 and results in recessive type 2 Stickler syndrome with profound hearing loss[J]. J Med Genet, 2013,50(11):765-771.

[10] Rodriguez-Fontenla C, Calaza M, Evangelou E, et al. Assessment of Osteoarthritis Candidate Genes in a Meta-Analysis of Nine Genome-Wide Association Studies[J]. Arthrit Rheumatol, 2014,66(4):940-949.

[11] Yoshioka H, Iyama K, Inoguchi K, et al. Developmental pattern of expression of the mouse alpha 1 (XI) collagen gene (Col11a1)[J]. Dev Dyn, 1995,204(1):41-47.

[12] Curran S, Murray GI. Matrix metalloproteinases: molecular aspects of their role in tumour invasion and metastasis[J]. Eur J Cancer, 2000,36(13):1621-1630.

[13] Boulay A, Masson R, Chenard MP, et al. High cancer cell death in syngeneic tumors developed in host mice deficient for the stromelysin-3 matrix metalloproteinase[J]. Cancer Res, 2001,61(5):2189-2193.

[14] Birkedal-Hansen B, Pavelic ZP, Gluckman JL, et al. Oral and Maxillofacial Pathology: MMP and TIMP gene expression in head and neck squamous cell carcinomas and adjacent tissues[J]. Oral Dis, 2000,6(6):376-382.

[15] Yoshioka H, Greenwel P, Inoguchi K. Structural and functional analysis of the promoter of the human alpha 1(XI)collagen gene[J]. J Biol Chem, 1995,270(1):418-424.

[16] Sok JC, Lee JA, Dasari S, et al. Collagen type XI α1 facilitates head and neck squamous cell cancer growth and invasion[J]. British J Cancer, 2013,109(12):3049-3056.

[17] Raglow Z, Thomas SM. Tumor matrix protein collagen XIα1 in cancer[J]. Cancer Lett, 2015,357(2):448-453.

[18] Anastassiou D, Rumjantseva V, Cheng W, et al. Human cancer cells express Slug-based epithelial-mesenchymal transition gene expression signature obtained in vivo[J]. BMC Cancer, 2010,11(11):529.

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黃志剛(E-mail: enthzg@trhos.com)

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