米　佳，樸春麗，陳　曦，朱浩宇

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長(zhǎng)春 130021； 2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

苦酸通調(diào)方對(duì)自發(fā)性糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB和IKKβ mRNA表達(dá)的影響*

米佳1，樸春麗1，陳曦1，朱浩宇2

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長(zhǎng)春 130021； 2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的：觀察苦酸通調(diào)方對(duì)自發(fā)性糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB及IKKβ mRNA表達(dá)的影響。方法：將高脂飼料喂養(yǎng)的30只雄性SPF級(jí)ZDF大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、苦酸通調(diào)組、吡格列酮組3組，普通飼料喂養(yǎng)的雄性SPF級(jí)ZL大鼠為正常對(duì)照組，每組10只?？嗨嵬ㄕ{(diào)組根據(jù)大鼠體質(zhì)量以3.29 g /(kg·d)混懸液灌胃，吡格列酮組以1.07 μg/(g·d)灌胃，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃，1 d 1次,連續(xù)12周。采用RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβmRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：模型對(duì)照組、吡格列酮組、苦酸通調(diào)組大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA的表達(dá)高于正常對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，苦酸通調(diào)組和吡格列酮組NF-κB、IKKβ mRNA的表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。與吡格列酮組對(duì)比，苦酸通調(diào)NF-κB、IKKβ mRNA的表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：苦酸通調(diào)方在一定程度上能抑制糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA表達(dá)，這可能是苦酸通調(diào)方抑制炎癥信號(hào)通路的傳導(dǎo)而發(fā)揮其改善胰島素抵抗治療糖尿病的機(jī)制之一。

苦酸通調(diào)方；NF-κB；IKKβ；動(dòng)物；ZDF大鼠

糖尿病是一種由多種原因引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂綜合征[1]。近年來(lái)，我國(guó)糖尿病人數(shù)日益增多，而成人糖尿病人數(shù)已超過(guò)9200萬(wàn)，并且糖尿病前期患者約有1.48億[2]。根據(jù)預(yù)測(cè)，到2025年糖尿病患病率將達(dá)到5.4%[3]。隨著生活方式的改變、生活水平的提高，糖尿病以其較高的發(fā)病率成為嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的疾病之一。胰島素抵抗及胰島功能受損是2型糖尿病的兩個(gè)基本環(huán)節(jié)[4]。因此，深入研究能夠改善胰島素抵抗和胰島功能受損的藥物，對(duì)于防治糖尿病及其并發(fā)癥具有重要意義?？嗨嵬ㄕ{(diào)方以四氣五味藥性理論設(shè)立，以苦味藥為主，與酸味藥相配合，由《溫病條辨》所記載的連梅湯加大黃、干姜而成。本研究旨在結(jié)合中醫(yī)古今文獻(xiàn)，在前期研究[5]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討苦酸通調(diào)方對(duì)自發(fā)性糖尿病大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA的影響，探討本方治療2型糖尿病的作用機(jī)制，為糖尿病的中醫(yī)治療提供新的思路和方法。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物

清潔級(jí)9周齡雄性ZDF (Zucker diabetic fatty rat)大鼠42只(體質(zhì)量244～291 g)和同周齡雄性ZL(Zucker lean)大鼠10只(體質(zhì)量183～220 g)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證：SCXK(京)2012-0001。ZDF大鼠在普通飼料喂養(yǎng)1周后予高脂飼料Purina #5008(粗脂肪6.5%、粗蛋白23.5%)喂養(yǎng)，ZL大鼠予普通飼料#1022(粗蛋白≥18.0%、粗脂肪≥4.0%、粗纖維≤5.0%、水分≤8.0%)喂養(yǎng)，飼料購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2009-0008。實(shí)驗(yàn)前均予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，所有動(dòng)物自由獲取食物和水。

1.2藥品

苦酸通調(diào)方由黃連、烏梅、大黃、干姜4味中藥組成，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院顆粒藥房提供；吡格列酮，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20040631。

1.3模型的建立

將42只ZDF大鼠和10只ZL大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠2只。明暗周期為12/12 h，自由攝食、飲水。各組予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,ZL組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，ZDF組給予高脂飼料喂養(yǎng)。至12周時(shí)，共成糖尿病模型ZDF大鼠30只。

判斷造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠定期行糖耐量實(shí)驗(yàn)，禁食不禁水15 h，剪尾取血微量血糖儀測(cè)空腹血糖后，予300 g/L葡萄糖溶液按2 g/kg灌胃[6]。糖負(fù)荷后分別在0.5,1,1.5和2 h剪尾取血，用血糖儀測(cè)量血糖。當(dāng)血糖峰值高于16.7 mmol/L和糖負(fù)荷后2 h 高于11.1mmol/L時(shí)，可診斷為糖尿病。如具備上述任意1條時(shí)，為糖耐量減低。取診斷為糖尿病或者糖耐量減低的大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.4動(dòng)物分組與給藥

將造模成功的30只ZDF大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、苦酸通調(diào)組和吡格列酮組3組，每組10只；10只ZL大鼠為正常對(duì)照組。苦酸通調(diào)組根據(jù)大鼠體質(zhì)量以3.29 g /(kg·d)混懸液灌胃，吡格列酮組以1.07 μg/(g·d)灌胃，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃，1 d 1次,連續(xù)12周。用藥治療期間正常對(duì)照組大鼠飼以普通飼料，其他組飼以高脂飼料，自由進(jìn)食、飲水，每周稱(chēng)量體質(zhì)量以調(diào)整灌胃劑量。

1.5檢測(cè)指標(biāo)

采用RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA的表達(dá)水平。于治療第12周末灌胃結(jié)束后，禁食、不禁水12 h，乙醚麻醉大鼠，打開(kāi)腹腔，快速提取腹腔脂肪組織，分裝后迅速放入液氨罐，移至-80 ℃冰箱里凍存待用。

1.5.1大鼠腹腔脂肪組織總RNA的提取

采用Trizol法。①分別取超低溫凍結(jié)的正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、苦酸通調(diào)組、吡格列酮組的脂肪組織約100 mg，放于勻漿器后加1mL的Trizol 試劑，研磨至組織完全破碎后，室溫放置5 min，使樣品充分裂解。②將勻漿分別轉(zhuǎn)入1.5 mL的EP管中，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min后，4 ℃離心機(jī)設(shè)置12 000 r/min，離心10 min。③從離心機(jī)中取出EP管，吸取上層清液，緩慢轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL的EP管中。④緩慢向上清液中加入0.5 mL的異丙醇混勻，室溫放置10 min。⑤在12 000 r/min、4 ℃離心機(jī)中離心10 min后，棄去上清液，沿EP管管壁緩慢加入750 mL/L的乙醇1 mL，將離心管震蕩搖勻，在冰上靜置10 min后放入7 500 r/min、4 ℃離心機(jī)中離心5 min，棄上清液。上述過(guò)程重復(fù)2次。⑥室溫干燥10 min，加入10 μL的DEPC水混合均勻，將RNA完全溶解。

1.5.2RNA純度的測(cè)定

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm、280 nm的紫外吸收值，重復(fù)3次。如各組結(jié)果A260/A280在1.8～2.0之間，說(shuō)明提取的RNA純度較高。

1.5.3RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取0.2 mL EP管，分別順次加入表1內(nèi)試劑，完成RT反應(yīng)液的配置。將上述試劑混勻靜置10 min，上PCR儀反應(yīng)(45 ℃水浴40 min，95 ℃水浴5 min，5 ℃水浴5 min)，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶后，存放于-20 ℃冰箱中備用。

表1　RT反應(yīng)液的配置

1.5.4RT-PCR反應(yīng)

引物序列 參見(jiàn)表2。 GAPDH反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃充分延伸5 min，4 ℃保存。NF-KB反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，72 ℃充分延伸5 min，4 ℃保存。IKKβ反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72 ℃充分延伸 5 min，4 ℃保存。

表2　引物序列名稱(chēng)

1.5.5PCR產(chǎn)物的檢測(cè)和分析

將終產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳20～30 min，紫外燈下拍照，利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)每個(gè)樣品PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行灰度掃描，并以GAPDH密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)　果

模型對(duì)照組、吡格列酮組、苦酸通調(diào)組大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA的表達(dá)高于正常對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，苦酸通調(diào)組和吡格列酮組NF-κB、IKKβ mRNA的表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。與吡格列酮組對(duì)比，苦酸通調(diào)NF-κB、IKKβ mRNA的表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明：苦酸通調(diào)方和吡格列酮均有降低糖尿病大鼠腹腔脂肪組織NF-κB、IKKβ基因表達(dá)的作用，且苦酸通調(diào)方優(yōu)于吡格列酮。見(jiàn)表3、圖1。

分 組NF-κBIKKβ正常對(duì)照組0.53±0.010.66±0.05模型對(duì)照組0.92±0.01**0.90±0.04**吡格列酮組0.91±0.01**#0.86±0.03**#苦酸通調(diào)組0.80±0.02**##△0.72±0.02**##△

注:與正常對(duì)照組對(duì)比，**P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05，##P<0.01；與吡格列酮組對(duì)比，△P<0.05。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；

3　討　論

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇。古人對(duì)消渴的病機(jī)一直遵循“陰虛燥熱”的傳統(tǒng)觀點(diǎn)，認(rèn)為陰虛為本、燥熱為標(biāo);但隨著生活方式的改變、生存壓力的增加，醫(yī)家對(duì)消渴的病因病機(jī)有了新的認(rèn)識(shí)：飲食不節(jié)使脾胃功能受損，運(yùn)化失常，氣機(jī)壅滯，郁而生熱；情志不遂，氣機(jī)郁滯，郁而化火?？梢?jiàn)，消渴的產(chǎn)生與郁、熱關(guān)系較為密切。隨著病程的進(jìn)展，日久熱耗氣傷陰，氣陰兩傷，久則陰陽(yáng)兩虛。課題組所在的團(tuán)隊(duì)經(jīng)十余年的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[5，7]證實(shí)，六郁和絡(luò)滯并存是導(dǎo)致肥胖2型糖尿病的核心病機(jī)。六郁是指以肥甘滋膩之品滯脾礙胃(食郁)為先導(dǎo)而形成的氣郁、血郁、熱郁、痰郁、濕郁的病理狀態(tài)；膏、濁、痰、脂、瘀、毒化生，郁滯絡(luò)脈。絡(luò)滯是由六郁交互作用而形成絡(luò)脈郁滯的病理狀態(tài)。苦酸通調(diào)法是對(duì)苦酸制甜、辛開(kāi)苦降、活血通絡(luò)、解毒通絡(luò)單一治法學(xué)說(shuō)的高度概括，主要針對(duì)肥胖2型糖尿病的核心病機(jī)“六郁和絡(luò)滯”。苦酸通調(diào)方按照君臣佐使的組方原則進(jìn)行藥物配伍，以六郁和絡(luò)滯的病機(jī)理論為基礎(chǔ)，治療以清熱瀉火、養(yǎng)陰生津、解毒通絡(luò)為原則，以苦酸通調(diào)為治療大法。既往臨床研究發(fā)現(xiàn)[8]，苦酸通調(diào)方對(duì)肥胖2型糖尿病胰島素抵抗患者有較好的改善作用。核因子κB(NF-κB)是細(xì)胞中的重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，存在于多種細(xì)胞中，通過(guò)刺激腫瘤壞死因子等的活化，誘導(dǎo)多種基因的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)[9]。王曉晨等[10]指出，NF-κB通過(guò)復(fù)雜的分子調(diào)節(jié)參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，并產(chǎn)生一定的生理變化，通常以p50-p655異二聚體的形式與其抑制性蛋白結(jié)合。NF-κB信號(hào)通路中有IKKβ、IKBα、NF-κB3個(gè)關(guān)鍵因子[11]。有研究報(bào)道，IKKβ是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵[12]。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，IKKβ抑制劑可阻斷NF-κB的激活。

本研究結(jié)果顯示：模型對(duì)照組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ mRNA表達(dá)量較正常對(duì)照組增高，苦酸通調(diào)方可在一定程度上能抑制糖尿病大鼠此兩指標(biāo)的表達(dá)。這可能是苦酸通調(diào)方抑制炎癥信號(hào)通路的傳導(dǎo)而發(fā)揮其改善胰島素抵抗治療糖尿病的機(jī)制之一。

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(編輯陶珠)

1001-6910(2016)02-0063-04

R587.1

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.02.31

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201115169)

2015-06-30；修回：2015-11-30