王海洋 楊獻(xiàn)玲 韓苗苗等

摘要[目的]以杏鮑菇多糖的理化性質(zhì)作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，提取杏鮑菇多糖，并研究其對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的作用及對(duì)NO釋放的影響。[方法]采用水煎煮提取、超聲提取、90 ℃熱水浸提、70 ℃熱水浸提、50 ℃熱水浸提提取杏鮑菇多糖，并采用苯酚-硫酸法、間羥基聯(lián)苯法以及Lowry法測(cè)定其總糖、酸性糖和蛋白質(zhì)含量；采用PMP柱前衍生化法和HPGPC法測(cè)定其組成糖和分子量分布；采用吞噬中性紅法和Griess試劑盒法測(cè)定其吞噬能力及NO的釋放量。[結(jié)果]試驗(yàn)得出，50 ℃熱水浸提提取的多糖總糖含量最高，超聲提取的多糖蛋白質(zhì)含量最高，各組提取酸性糖含量相當(dāng)且均較低，水煎煮提取多糖中的單糖種類最少、分子量最低。綜合比較，90 ℃熱水浸提為杏鮑菇多糖的最佳提取方法；在質(zhì)量濃度為25～100 μg/mL，能夠極顯著地促進(jìn)細(xì)胞吞噬中性紅的能力和NO的釋放。[結(jié)論]90 ℃熱水浸提水煎煮為杏鮑菇多糖的最佳提取方法，一定濃度的杏鮑菇多糖能夠提高RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性，并能促進(jìn)NO的釋放，提示杏鮑菇多糖具有一定的免疫活性。

關(guān)鍵詞杏鮑菇多糖；提??；理化性質(zhì)；吞噬指數(shù)；一氧化氮

中圖分類號(hào)S646文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2016）04-116-04

Extraction of Pleurotus eryngii Polysaccharides and Its Effects on the Macrophages Activity of RAW264.7 Cell and the Release of NO

WANG Haiyang1， YANG Xianling2， HAN Miaomiao3， XU Duoduo1* et al（1. Changchun University of Chinese Medicine， Changchun， Jilin 130117； 2. Jilin Institute for Drug Control， Changchun， Jilin 130033； 3. Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao， Shandong 266555）

Abstract[Objective] With the physicochemical property of Pleurotus eryngii polysaccharides as the comprehensive evaluation index， polysaccharides were extracted from P. eryngii； and its effects on the macrophages activity of RAW264.7 cell and the release of NO were researched. [Method] Polysaccharides were extracted from P. eryngii by the methods of water decoction extraction （A）， ultrasonic extraction （B）， 90 ℃ hot water extraction （C）， 70 ℃ hot water extraction （D） and 50 ℃ hot water extraction （E）. Contents of total glucose， acid glucose and protein were detected by phenolsulfuric acid method， mhydroxydiphenyl method and lowry method. Glucose component and molecular weight distribution were detected by PMP precolumn derivatization method and HPGPC method. Phagocytic ability and NO release were detected by neutral red method and Griess kit method. [Result] Polysaccharides and total glucose contents were the maximum in 50 ℃ hot water extraction. Polysaccharides and protein contents were the maximum in ultrasonic extraction. Acid sugar content in each group was relatively low. Monosaccharide type was relatively less in polysaccharides， and molecular weight was relatively low in water decoction extraction. 90 ℃ hot water extraction was the maximum extraction method. 25-100 μg/mL significantly promoted the phagocytic ability and NO release. [Conclusion] 90 ℃ hot water extraction is the optimal extraction method for P. eryngii polysaccharides. A given concentration of P. eryngii polysaccharides enhances the phagocytic activity of RAW264.7 cells， and promotes the NO release， indicating that P. eryngii polysaccharides have certain immunocompetence.

Key wordsP. eryngii polysaccharides； Extraction； Physical and chemical properties； Phagocytic index； NO

是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，屬于免疫系統(tǒng)的“哨兵”，是繼黏膜屏障之后的機(jī)體第2道防御體系，參與抗原處理并將抗原遞呈給免疫活性細(xì)胞，是連接先天免疫和獲得免疫的紐帶，在去除病原體、抗腫瘤及一些慢性炎癥疾病中具有不可替代的作用[1]。現(xiàn)代研究表明，巨噬細(xì)胞具有免疫防御、監(jiān)視、調(diào)節(jié)等免疫功能，是生物體重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在生物體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著不可替代的作用，它通過(guò)吞噬作用和分泌多種細(xì)胞因子等多種功能而調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答[2]。

杏鮑菇（Pleurotus eryngii），別名刺芹側(cè)耳，屬側(cè)耳（口蘑）科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Agaricochaete），是一種十分重要的藥食同源的珍稀食用菌，目前在我國(guó)已經(jīng)成為繼金針菇之后的第二大工業(yè)化栽培品種[3]。杏鮑菇子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、還原性糖、不飽和脂肪酸等膳食纖維，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，杏鮑菇的主要活性成分為多糖組分，其具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、抗疲勞、降低膽固醇等功效[5-9]。目前，針對(duì)各種方法提取杏鮑菇多糖的工藝條件報(bào)道有很多[10-13]，但針對(duì)各提取方法得到的多糖的理化性質(zhì)、組成糖、分子量差異及免疫活性卻鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者采用不同方法提取杏鮑菇多糖，比較其理化性質(zhì)、組成糖及分子量差異，并初步研究其免疫活性，旨在為杏鮑菇的進(jìn)一步資源開(kāi)發(fā)利用提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料原料及主要試劑：杏鮑菇，購(gòu)自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌菜基地，菌種號(hào)：Pleurotus eryngii 2601；右旋糖酐（Dextran）及甘露糖等標(biāo)準(zhǔn)品、脂多糖（LPS）、中性紅，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RAW264.7細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640培養(yǎng)基等，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴鹽（噻唑藍(lán)，MTT），美國(guó)Amresco；小鼠Griess試劑盒，美國(guó)Promega公司；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；水為超純水。主要儀器：MCO15AC 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；MK3酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司。

1.2方法

1.2.1杏鮑菇多糖的提取。將新鮮杏鮑菇用清水洗凈，切成小塊，風(fēng)干，于95%乙醇中室溫浸泡24 h后過(guò)濾，將濾渣烘干，備用。試驗(yàn)共分為5組，每組100 g，分別為水煎煮提?。ˋ）、超聲提?。˙）、90 ℃熱水浸提（C）、70 ℃熱水浸提（D）、50 ℃熱水浸提（E）。每次提取1 h，提取3次，分別過(guò)濾、濃縮、放至室溫，緩慢向其加入無(wú)水乙醇至乙醇濃度為80%，放置過(guò)夜，離心（3 000 r/min，5 min），取沉淀，揮去乙醇，凍干，即得杏鮑菇多糖樣品[14]，備用。

1.2.2理化性質(zhì)的測(cè)定。分別采用苯酚-硫酸法[15]、間羥基聯(lián)苯法[16]、Lowry法[17]測(cè)定所提取多糖的總糖、酸性糖和蛋白質(zhì)含量。

1.2.3組成糖分析。采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法，參照文獻(xiàn)[18]步驟制備衍生化產(chǎn)物，根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的保留時(shí)間確定單糖種類。

色譜條件：Agilent 1200高效液相色譜儀，Grace Apollo C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱；以不同比例0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液（KH2PO4NaOH，pH 6.8）-乙腈作為流動(dòng)相，梯度洗脫比例見(jiàn)表1；流速0.8 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。

1.2.4分子量分析。采用高效凝膠分子排阻色譜法進(jìn)行測(cè)定[19]。

1.2.4.1色譜條件。TSK G3000PWxl凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm）、TSK guard column PWML預(yù)柱（40 mm×6.0 mm），流動(dòng)相為0.7%Na2SO4溶液（內(nèi)含0.02%疊氮鈉），流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL，RI201H檢測(cè)器。

1.2.4.2對(duì)照品溶液的制備。精密稱取已知分子量的Dextran T180、T1000、T5000、T12000、T25000的葡聚糖對(duì)照品，加流動(dòng)相配制成5 mg/mL的溶液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，作為對(duì)照品溶液。

1.2.4.3供試品溶液的制備。取樣品適量，加入流動(dòng)相配制成濃度為5 mg/mL的溶液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

1.2.5杏鮑菇多糖的吞噬活性及NO含量的測(cè)定[20]。RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（含1%雙抗）中，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%時(shí)，消化、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2.5.1杏鮑菇多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響。將細(xì)胞消化調(diào)整至1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入不同質(zhì)量濃度各多糖溶液（0、1.50、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00、1 000.00 μg/mL）100.00 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，采用MTT比色法測(cè)定其吸光度（A）值。每組5個(gè)復(fù)孔。

1.2.5.2杏鮑菇多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬作用的影響。細(xì)胞處理同“1.2.5.1”。試驗(yàn)分為3組，分別為空白組、對(duì)照組和給藥組?？瞻捉M加入100 μL新鮮培養(yǎng)液；對(duì)照組每孔分別加入10 μg/mL LPS溶液；給藥組加入質(zhì)量濃度為1.50、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL的多糖溶液。將各組置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后傾去液體，每孔加入0.075%的中性紅溶液進(jìn)行染色，1 h后傾去染色液，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每孔各加入100 μL醋酸乙醇（V/V=1∶1）細(xì)胞溶解液，室溫放置過(guò)夜，次日于酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)492 nm下測(cè)定吸光度值。細(xì)胞對(duì)中性紅吞噬能力用吞噬指數(shù)（pinocytotic index，PI）表示。

吞噬指數(shù)=A試驗(yàn)A空白×100%

1.2.5.3NO含量的測(cè)定。將細(xì)胞消化調(diào)整至1×105個(gè)/mL接種于6孔板中，每孔1 mL，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入1 mL質(zhì)量濃度為1.50～100.00 μg/mL的多糖溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸取上清液，離心，取上清，按Griess試劑盒操作計(jì)算NO的釋放量。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用±S表示，用單因素方差分析組間差異，以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1粗多糖的理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果由表2可知，E組提取得到的多糖總糖含量最高，A組提取多糖的總糖含量最低；各組提取得到的酸性糖含量均較低且含量相當(dāng)；B組提取得到的杏鮑菇多糖的蛋白質(zhì)含量最高。

A、C、D、E組的總糖含量顯示，隨著提取溫度的降低，所得多糖的總糖含量呈上升趨勢(shì)，但對(duì)酸性糖和蛋白質(zhì)含量影響不大；超聲的空化效應(yīng)能促進(jìn)蛋白質(zhì)類成分溶出；在水煎煮過(guò)程中，溫度過(guò)高，會(huì)將某些多糖組分破壞，同時(shí)也會(huì)提取出較多非糖類雜質(zhì)，使總糖含量下降。

2.2組成糖測(cè)定結(jié)果由表3可見(jiàn)，各組提取多糖均含有甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖4種單糖。B、C、D、E組提取的杏鮑菇多糖單糖組成相同，只有A組提取多糖不含葡萄糖醛酸，可能的原因是在水煎提取過(guò)程中的過(guò)高溫度使葡萄糖醛酸受到破壞。

2.3分子量測(cè)定結(jié)果高效凝膠色譜法（HPGPC）結(jié)果顯示，A組提取的杏鮑菇多糖分子量較小，分子量分布大于20 000 D的僅占7.73%，其分子量主要分布在300～2 000 D；C組提取多糖分子量相對(duì)較高，分子量分布在20 000 D的占55.02%；其余各組多糖分子量分布基本相同，主要集中分布在500～15 000 D。由此可見(jiàn)，水煎煮提取的過(guò)高溫度可能使多糖組分中高分子部分受到破壞，使其分子量變小。

2.4杏鮑菇多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬作用及NO含量的影響

2.4.1杏鮑菇多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響。由圖1可知，在試驗(yàn)濃度下，杏鮑菇多糖直接作用于RAW264.7細(xì)胞時(shí)，能夠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖，并且，隨著濃度的增大，增殖率隨之升高。在質(zhì)量濃度為1.50～100.00 μg/mL時(shí)，杏鮑菇多糖作用于RAW264.7細(xì)胞與空白組無(wú)明顯差異；200.00 μg/mL能顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖；400.00～1 000.00 μg/mL能極顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖。

4.7細(xì)胞的影響

Fig.1Effects of polysaccharides in different concentration groups on RAW264.7 cells2.4.2杏鮑菇多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響。由圖2可知，各組提取的多糖在試驗(yàn)濃度下均能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅的能力，并且，隨著濃度的增高，其吞噬指數(shù)也隨之增大。在質(zhì)量濃度為12.50 μg/mL時(shí)與空白組相比具有顯著性差異；在質(zhì)量濃度為25.00～100.00 μg/mL時(shí)與空白組相比具有極顯著性差異；在質(zhì)量濃度為100.00 μg/mL時(shí)，其吞噬指數(shù)大于LPS對(duì)照組，提示杏鮑菇多糖具有活化RAW264.7巨噬細(xì)胞、提高吞噬能力的作用，可保護(hù)機(jī)體免受抗原感染。

3結(jié)論與討論

多糖作為良好的免疫調(diào)節(jié)劑，其免疫活性越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外廣大學(xué)者的廣泛關(guān)注，巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的“哨兵”，它會(huì)傳遞病原體的信息給淋巴細(xì)胞，以此來(lái)激活免疫應(yīng)答，所以這類細(xì)胞在機(jī)體的免疫反應(yīng)中起著重要的作用。

NO是一種新型的生物活性信息遞質(zhì)，具有重要的免疫學(xué)功能，在免疫、神經(jīng)和呼吸等多個(gè)系統(tǒng)中均發(fā)揮著重要作用，并且廣泛參與到機(jī)體的免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種生理和病理過(guò)程中，與獲得性免疫、細(xì)胞因子的分泌以及自身免疫病都密切相關(guān)[21]。

該研究以杏鮑菇作為研究對(duì)象，分別采用水煎煮法、超聲提取法以及不同溫度的熱水浸提提取杏鮑菇多糖，研究不同提取方法下杏鮑菇多糖的理化性質(zhì)、組成糖、分子量差異。結(jié)果顯示，不同提取方法對(duì)杏鮑菇多糖的免疫活性影響不大，隨著提取溫度的升高，會(huì)有許多非糖類物質(zhì)溶出，同時(shí)多糖分子中的某些組分會(huì)受到破壞，使總糖含量相對(duì)降低，分子量降低。

以小鼠單核巨噬RAW264.7細(xì)胞作為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)分析細(xì)胞的增殖能力、吞噬能力、NO釋放水平來(lái)探討杏鮑菇多糖的免疫調(diào)節(jié)活性。結(jié)果顯示，杏鮑菇多糖直接作用于RAW264.7細(xì)胞能夠激活巨噬細(xì)胞，提高其吞噬能力，促進(jìn)其釋放NO，提示杏鮑菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑[22]，這為其開(kāi)發(fā)成為免疫調(diào)節(jié)藥物提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)，并有待于進(jìn)一步研究。

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