劉慧，王惠，史倞，孔祥清

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟科，南京210029）

循環(huán)血miR-21-3p作為膿毒癥心肌病的標(biāo)記物

劉慧，王惠，史倞，孔祥清

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟科，南京210029）

已有研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNAs，miRNAs）可由細(xì)胞分泌并釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在血清、血漿、尿液和其他體液中穩(wěn)定存在，并可作為非損傷性生物標(biāo)記物對(duì)多種疾病進(jìn)行早期診斷、鑒別分期、預(yù)后判斷和療效監(jiān)測(cè)等.與健康對(duì)照者相比，miR-21-3p在22例膿毒癥心衰患者血漿中顯著升高.通過(guò)繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并分析其與臨床參數(shù)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p在鑒別膿毒癥心衰和健康人群時(shí)，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.949.相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血漿miR-21-3p水平與B型腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）（r=0.968，P＜0.001）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTNT）（r=0.257，P=0.002）水平呈正相關(guān).因此，外周血中的miR-21-3p有作為膿毒癥心肌病的生物標(biāo)記物的潛力.

膿毒癥心肌病；miR-21-3p；循環(huán)miRNA

敗血癥休克是臨床上最常見(jiàn)的急危重癥，由于至今仍缺乏療效高、副作用小的治療方法，因此導(dǎo)致其死亡率較高［1］.細(xì)菌感染是膿毒癥休克最常見(jiàn)的病因，細(xì)菌中的內(nèi)毒素、外毒素以及細(xì)菌外壁成分——脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以刺激相應(yīng)靶細(xì)胞如單核細(xì)胞、多形核中性粒白細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞等，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥進(jìn)程，產(chǎn)生一系列促炎細(xì)胞因子（proinflammtory cytokine）［2］.盡管經(jīng)過(guò)10年醫(yī)療的不斷進(jìn)步，膿毒癥卻仍因病情進(jìn)展迅速、臨床救治困難，而成為危重病人死亡的重要原因［3］.在膿毒癥早期心血管功能即可發(fā)生變化，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，膿毒癥并發(fā)心血管功能障礙被普遍稱為膿毒性心肌病（sepsis-induced cardiomyopathy，SIC）［4-5］.一旦出現(xiàn)心血管并發(fā)癥，心功能障礙又會(huì)加劇膿毒癥病情，導(dǎo)致死亡率顯著上升，因此膿毒癥心功能不全是重癥監(jiān)護(hù)室重點(diǎn)監(jiān)控疾病［6-7］.膿毒癥臨床治療措施中很難通過(guò)評(píng)估膿毒癥對(duì)心臟、血管、微循環(huán)的影響來(lái)判斷預(yù)后.

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p的表達(dá)水平在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥心肌病中升高，并會(huì)加重小鼠的心肌功能障礙，因此本研究旨在探索miR-21-3p是否具有膿毒癥心肌病相關(guān)生物標(biāo)記物的診斷潛力，并進(jìn)一步驗(yàn)證其與臨床參數(shù)的相關(guān)性.

1　材料與方法

1.1標(biāo)本的收集

所有血液樣本來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，包括膿毒癥心衰患者22例，健康對(duì)照者18例.血液樣本的使用已取得患者同意.膿毒癥患者在收治入院的24 h內(nèi)抽取血液樣本，2 mL外周血經(jīng)乙二胺四乙酸（ethylenediaminetraacetic acid，EDTA）抗凝后立即在室溫條件下于1 500 g離心力離心15 min，輕輕吸取上清即血漿，移入RNA-Free的EP管中，并于-80°C保存.

1.2血漿RNA的提取

利用Ambion試劑盒提取血漿中的RNA，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.RNA的純度和濃度采用Nanodrop ND2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行檢測(cè).

1.3qRT-PCR的檢測(cè)

血漿中miRNA的逆轉(zhuǎn)錄和后續(xù)的定量檢測(cè)采用Bio-Rad公司的miRNA qRT-PCR Detection Kit.miRNA引物購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司，SYBR Green染料購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，在Eppendorf公司Mastercyclerrealplex Real-Time PCR 7900儀器上進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè).10μL反應(yīng)體系如下：Power SYBR Green 5μL，正向引物（10μmol/L）0.5μL，反向引物（10μmol/L）0.5μL（具體序列見(jiàn)表1），cDNA模板0.5μL，去離子水3.5μL.熒光定量PCR具體步驟如下：①95°C 3 min；②95°C 15 s，60°C 30 s，72°C 30 s，本步驟重復(fù)40個(gè)循環(huán)；③反應(yīng)結(jié)束后溶解曲線先加熱到95°C，后降至60°C，在20 min內(nèi)再緩慢升溫至95°C，持續(xù)15 s，記錄熒光信號(hào)的變化.熒光定量PCR均重復(fù)3次.

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

兩組血漿中miRNA表達(dá)水平差異、與臨床資料的相關(guān)性及診斷價(jià)值的評(píng)估采用Graph-Pad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的繪制和曲線下面積（area under the curve，AUC）的計(jì)算，以評(píng)估目的miRNA的診斷價(jià)值，最后通過(guò)計(jì)算Youden指數(shù)（Youden's index）來(lái)選擇最佳界值（cutoff value）.

2　結(jié)果與分析

2.1目的miRNAs檢測(cè)

本課題組前期研究數(shù)據(jù)顯示，miR-21-3p的表達(dá)水平在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥心肌病中升高，并會(huì)加重小鼠的心肌功能障礙，因此對(duì)22例膿毒癥心衰患者和18例健康對(duì)照者血漿中miR-21-3p的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè).qRT-PCR結(jié)果顯示：miR-21-3p的表達(dá)水平在膿毒癥心衰患者中顯著升高，P＜0.001（見(jiàn)圖1）.

圖1　miR-21-3p在膿毒癥心衰患者和健康對(duì)照者血漿中的表達(dá)水平對(duì)比Fig.1 Plasma levels of miR-21-3p in septic patients with cardiac dysfunction compared with healthy controls

2.2ROC曲線分析

為了進(jìn)一步評(píng)估m(xù)iR-21-3p作為診斷膿毒癥心肌病標(biāo)記物的價(jià)值，本研究利用GraphPad Prism 5軟件繪制了ROC曲線，同時(shí)計(jì)算其AUC，并選擇最大Youden指數(shù)作為膿毒癥心肌病標(biāo)記物的界值.結(jié)果顯示，目的miRNAs在區(qū)別膿毒癥心肌病患者和健康人群時(shí)有一定的診斷價(jià)值.為了驗(yàn)證目的miRNAs在所有樣本中鑒別膿毒癥心肌病患者的水平，對(duì)所有樣本進(jìn)行ROC曲線的繪制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21-3p曲線下面積為0.949，靈敏度、特異度、AUC均較高，表現(xiàn)出較高的診斷價(jià)值（見(jiàn)圖2，P＜0.05）.

圖2　ROC曲線Fig.2 ROC curves

2.3miRNAs血漿表達(dá)水平與患者臨床資料相關(guān)性分析

與表1臨床資料結(jié)合作進(jìn)一步分析，按臨床參數(shù)分組對(duì)miR-21-3p表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，表1中，WBC代表白細(xì)胞（white blood cell），CRP代表C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein），PCT代表降鈣素原（procalcitonin），NT-proBNP代表N末端B型腦鈉肽前體（N-terminal of the prohormone brain natriuretic peptide），cTNT代表心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T）.Spearman秩相關(guān)性分析結(jié)果如表2所示，可見(jiàn)miR-21-3p表達(dá)水平與血漿中的BNP（r=0.968，P＜0.001）、cTNT（r=0.257，P=0.002）表達(dá)水平呈正相關(guān).但miR-21-3p的表達(dá)水平與WBC，CRP及PCT無(wú)關(guān).

表1　膿毒癥心功能不全患者與健康對(duì)照臨床資料Table 1 Clinical characteristics of sepsis patients with cardiac dysfunction and health control

表2　血漿中miR-21-3p與患者臨床資料之間的相關(guān)性Table 2 Correlation analyses between plasma miR-21-3p and clinical data

3　討論

本研究結(jié)果表明，循環(huán)miR-21-3p能夠作為診斷膿毒癥心肌功能障礙的生物標(biāo)記物，有較好的特異度、靈敏度，也具有較好的診斷價(jià)值.隨著本研究的深入，發(fā)現(xiàn)如下現(xiàn)象：①miR-21-3p表達(dá)水平在膿毒癥心衰患者血漿中顯著升高；②繪制ROC曲線人群鑒別時(shí)，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血漿miR-21-3p表達(dá)水平靈敏度、特異度、AUC較高，表現(xiàn)出較高的診斷價(jià)值，提示這種miRNA在膿毒癥導(dǎo)致的心功能轉(zhuǎn)變過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用.

近期研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中的miRNA有著作為膿毒癥早期診斷標(biāo)記物的潛力.已有報(bào)道指出，在膿毒癥患者外周血中miR-146a和miR-223的表達(dá)水平明顯下降，可將膿毒癥與其他非感染性引起的全身炎癥反應(yīng)綜合癥區(qū)分開(kāi)［8-9］.miR-150與細(xì)菌感染和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，Roderburg等［10］在膿毒癥病人的血清中檢測(cè)到miR-150表達(dá)水平降低，并提示不良預(yù)后.為了進(jìn)一步研究循環(huán)miRNA作為膿毒癥生物標(biāo)記物的潛在價(jià)值，研究者在小鼠盲腸結(jié)扎穿刺模型中進(jìn)行miRNA篩查，發(fā)現(xiàn)miR-16，miR-17，miR-20a，miR-20b，miR-26a，miR-26b，miR-106a，miR-106b，miR-195和miR-451表達(dá)水平升高.提取exosome后發(fā)現(xiàn)，miR-16，miR-17，miR-20a，miR-20b，miR-26a和miR-26b表達(dá)水平在exosome中顯著升高，提示循環(huán)miRNAs可能存在于體液的exosome中，并穩(wěn)定存在［11-12］.相似地，Tacke等［13］在動(dòng)物模型中篩選并發(fā)現(xiàn)了miR-133a，miR-150，miR-155，miR-193b表達(dá)水平的變化，并在膿毒癥和非膿毒癥患者血液中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-133a表達(dá)水平的升高與細(xì)菌感染炎癥相關(guān).除了miR-133a，近期研究還證實(shí)了miR-574-5p作為膿毒癥生物標(biāo)記物有一定的診斷價(jià)值［14］.

目前，對(duì)于miR-21-3p在膿毒癥心肌病中的作用知之甚少.近期研究發(fā)現(xiàn)miR-21-3p的表達(dá)水平在LPS誘導(dǎo)心肌功能障礙中升高，并通過(guò)影響心肌收縮、自噬影響心臟功能［15］.這種miRNA在敗血病的發(fā)展過(guò)程中，由心臟組織釋放進(jìn)入血液循環(huán)，穩(wěn)定地存在并表達(dá)，為在外周血中檢測(cè)循環(huán)miRNA從而篩查膿毒癥心肌病提供了可能.

本研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了miR-21-3p具有作為膿毒癥心肌病生物標(biāo)記物的潛力，具有較高的靈敏度、特異性.本研究納入22例SIC患者血漿樣本，并且所得數(shù)據(jù)顯示出了較好的診斷價(jià)值趨勢(shì)，但還有待更大樣本量的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí).本研究探索了無(wú)創(chuàng)性診斷膿毒癥心肌病的標(biāo)記物領(lǐng)域，為后續(xù)更大范圍和規(guī)模的研究提供了重要的參考.

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Circulating miR-21-3p as biomarkers for sepsis-induced cardiomyopathy

LIU Hui，WANG Hui，SHI Jing，KONG Xiangqing
（Department of Cardiology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

Recently，microRNAs（miRNAs）are found to be abundantly present in body fluids including plasma and serum，and called circulating miRNAs.Increasing evidences suggest that circulating miRNAs may be useful as stable blood-based biomarkers in sepsis. Serum miR-21-3p is significantly increased in septic patients compared with healthy controls.Receiver operating characteristic（ROC）curve analyses suggest that these plasma miR-21-3p may be useful biomarkers for discriminating patients with sepsis-induced cardiomyopathy（SIC）from healthy controls.miR-21-3p yields the ROC area under the curve（AUC）of 0.949.Further analyses indicate that the expression level of miR-21-3p is correlated with the brain natriuretic peptide（BNP）（r=0.968，P＜0.001）and cardiac troponin T（cTNT）level（r=0.257，P=0.002）.Serum miR-21-3p may serve as new biomarkers for sepsis with high specificity and sensitivity.

sepsis-induced cardiomyopathy（SIC）；miR-21-3p；circulating miRNAs

R631

A

1007-2861（2016）03-0366-05

10.3969/j.issn.1007-2861.2016.03.019

2016-04-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81570247）

孔祥清（1966—），男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，博士，研究方向?yàn)橄忍煨孕呐K病介入治療.

E-mail：xiangqingkong nj@163.com