鄭麗桑 吳燕茹 王瑜

[摘要] 目的 探討宮頸脫落細(xì)胞人乳頭瘤病毒（HPV）DNA及HPV L1蛋白檢測對宮頸病變的預(yù)測作用。 方法 選取2013年9月～2015年9月在解放軍第一八〇醫(yī)院就診的596例宮頸病變患者，根據(jù)組織病理學(xué)診斷分為：宮頸炎（349例）、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級（CINⅠ級，78例）、CINⅡ級（59例）、CINⅢ級（63例）及宮頸癌（47例）；根據(jù)宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為：未見異常細(xì)胞（NILM，286例）、意義未明的非典型鱗狀細(xì)胞（ASC-US，81例）、不能排除上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀細(xì)胞（ASC-H，94例）、輕度鱗狀細(xì)胞上皮內(nèi)瘤變（LSIL，79例）及高度鱗狀細(xì)胞上皮內(nèi)瘤變（HSIL，56例）。檢測不同宮頸病變中的HPV DNA及HPV L1蛋白并進(jìn)行比較。 結(jié)果 HPV DNA陽性者共410例，陽性率為68.8%，以宮頸癌（93.6%）及HSIL（91.1%）最高，宮頸炎（61.3%）及NILM（57.7%）最低，組間總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；HPV L1蛋白陽性者共275例，陽性率為46.1%，以宮頸炎（57.9%）及NILM（60.1%）最高，宮頸癌（12.8%）及HSIL（17.9%）最低，組間總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P < 0.05）。 結(jié)論 宮頸病變程度越高，宮頸脫落細(xì)胞HPV DNA陽性率越高，而HPV L1蛋白陽性率越低。二者聯(lián)合檢測對臨床診斷宮頸病變及評估風(fēng)險進(jìn)展具有重要意義，值得臨床推廣。

[關(guān)鍵詞] 人乳頭瘤病毒；HPV L1蛋白；宮頸脫落細(xì)胞；宮頸病變

[中圖分類號] R711.74 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（b）-0107-05

Clinical significance of HPV DNA and HPV L1 protein detection in cervical exfoliated cells

ZHENG Lisang WU Yanru WANG Yu

Center of Health Management， the 180th Hospital of PLA， Fujian Province， Quanzhou 362000， China

[Abstract] Objective To explore the clinical significance of HPV DNA and HPV L1 protein detection in cervical exfoliated cells. Methods 596 patients with cervical lesions received in the 180th Hospital of PLA from September 2013 and September 2015 were selected. According to histopathological results， patients were divided into cervicitis （349 cases）， cervical intraepithelial neoplasia Ⅰ （CINⅠ， 78 cases）， CIN Ⅱ （59 cases）， CIN Ⅲ （63 cases） and cervical cancer （47 cases）. While according to cervical cytology results， patients were divided into normal cells （NILM， 286 cases）， unclear of atypical squamous cells （ASC-US， 81 cases）， atypical cells suspicious squamous intraepithelial lesions （ASC-H， 94 cases）， low-grade squamous intraepithelial lesions （LSIL， 79 cases） and high grade squamous intraepithelial lesions （HSIL， 56 cases）. HPV DNA and HPV L1 protein were detected and compared between groups. Results HPV DNA were positive in 410 cases， with the positive rate of 68.8%. The cervical cancer （93.6%） and HSIL （91.1%） had the highest positive rate， while cervicitis （61.3%） and NILM （57.7%） had the lowest positive rate， the overall difference between groups was statistically significant （P < 0.05）. HPV L1 protein were positive in 275 cases， with the positive rate of 46.1%. The cervicitis （57.9%） and NILM （60.1%） had the highest positive rate， while cervical cancer group（12.8%） and HSIL group（17.9%） had the lowest positive rate， the overall difference between groups was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion With the increase of degree of the cervical lesions， the expression of HPV DNA is up-regulated while HPV L1 protein is down-regulated. Combined detection of both targets has important value in diagnosing of cervical lesion and predicting progressive risk. It is worth of clinical promotion.

[Key words] Human papilloma virus； HPV L1 protein； Cervical exfoliated cells； Cervical lesion

宮頸癌是常見的女性生殖道惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)居女性惡性腫瘤第2位，在一些發(fā)展中國家甚至居于首位。其發(fā)病率高，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅女性身心健康。大樣本量的臨床流行病學(xué)和實驗室研究數(shù)據(jù)已提示人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌的主要危險因素，90%以上的宮頸癌患者都有HPV感染[1]。但是，HPV感染并非均導(dǎo)致宮頸惡性病變，大部分的HPV感染即使不經(jīng)過治療，8～10個月后也能自行轉(zhuǎn)陰[2]。因此，尋找能夠預(yù)測宮頸病變結(jié)局的方法引起了越來越多的關(guān)注。本研究通過聯(lián)合檢測HPV DNA及HPV L1蛋白來評估宮頸病變嚴(yán)重程度，旨在為宮頸病變篩查提供指導(dǎo)。現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年9月～2015年9月在解放軍第一八〇醫(yī)院（以下簡稱“我院”）健康管理中心體檢并診斷為宮頸病變的596例患者為研究對象，年齡26～57歲，平均（35.3±2.1）歲。根據(jù)宮頸組織病理學(xué)結(jié)果將其分為宮頸炎（349例）、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級（CINⅠ級，78例）、CINⅡ級（59例）、CINⅢ級（63例）及宮頸癌（47例）；根據(jù)宮頸液基細(xì)胞學(xué)結(jié)果分為：未見異常細(xì)胞（NILM，286例）、意義未明的非典型鱗狀細(xì)胞（ASC-US，81例）、不能排除上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀細(xì)胞（ASC-H，94例）、輕度鱗狀細(xì)胞上皮內(nèi)瘤變（LSIL，79例）及高度鱗狀細(xì)胞上皮內(nèi)瘤變（HSIL，56例）。不同組別患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。所有患者均知情同意并簽同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集

采樣前確保患者不在月經(jīng)期且近期無陰道用藥史。宮頸脫落細(xì)胞采集：用消毒棉簽蘸無菌注射用水擦拭宮頸口后，采用新柏氏液基細(xì)胞專用刷，以宮頸口為中心旋轉(zhuǎn)，順時針逆時針各旋轉(zhuǎn)周，刷取宮頸鱗-柱狀上皮交界處的宮頸脫落上皮細(xì)胞，刷頭浸入新柏氏保存液中，反復(fù)洗滌使細(xì)胞盡可能多地浸入保存液中。HPV DNA采樣：宮頸刷插入宮頸口，順時針逆時針各旋轉(zhuǎn)3周，將刷頭折斷放入保存瓶中，送檢。

1.3 檢測方法

宮頸細(xì)胞經(jīng)自動制片機(jī)制片、染色、封片等步驟制成薄層細(xì)胞涂片，由我院病理科醫(yī)生用TBS診斷系統(tǒng)閱片及診斷。HPV DNA用第二代雜交捕獲法進(jìn)行檢測，利用對抗體捕獲信號放大，產(chǎn)生光信號經(jīng)微孔板分辨儀器測量，獲得相對光強(qiáng)度，與設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)對照值進(jìn)行比較，≥1為陽性，<1為陰性。HPV L1蛋白采用美國Advanced公司的HPV L1蛋白檢測試劑盒進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料以百分率表示，不同宮頸組織間比較比較采用χ2檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸病理學(xué)分組HPV DNA與HPVL1蛋白比較

HPV DNA陽性者共410例，陽性率為68.8%，宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級及宮頸癌中的陽性率分別為61.3%、69.2%、76.3%、84.1%及93.6%。宮頸病變越嚴(yán)重，HPV DNA陽性率越高，組間總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。HPV L1蛋白陽性者共275例，陽性率為46.1%，在宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級及宮頸癌中的陽性率分別為57.9%、43.6%、33.9%、20.6%及12.8%。宮頸病變越嚴(yán)重，HPV L1蛋白陽性率越低，組間總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

表1 不同病理學(xué)診斷的宮頸組織中HPV DNA

與HPVL1蛋白比較[n（%）]

注：HPV：人乳頭狀瘤病毒；CIN：宮頸上皮內(nèi)瘤變

2.2 宮頸液基細(xì)胞學(xué)分組HPV DNA與HPVL1蛋白比較

在NILM、ASC-US、ASC-H、LSIL及HSIL組中的HPV DNA陽性率分別為57.7%、67.9%、75.5%、86.1%及91.1%。宮頸病變程度越高，HPV DNA陽性率越高，組間總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。HPV L1蛋白陽性率在NILM、ASC-US、ASC-H、LSIL及HSIL組中分別為60.1%、50.6%、35.1%、24.1%及17.9%。宮頸病變程度越高，HPV L1蛋白陽性率越低，組間總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

表2 不同細(xì)胞學(xué)診斷的宮頸組織中HPV DNA

與HPVL1蛋白比較[n（%）]

注：HPV：人乳頭狀瘤病毒；NILM：宮頸上皮內(nèi)瘤變未見異常細(xì)胞；ASC-US：意義未明的非典型鱗狀細(xì)胞；ASC-H：不能排除上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀細(xì)胞；LSIL：輕度鱗狀細(xì)胞上皮內(nèi)瘤變；HSIL：高度鱗狀細(xì)胞上皮內(nèi)瘤變

3 討論

近年來，宮頸癌的發(fā)病率逐漸升高，且有年輕化的趨勢。據(jù)WHO統(tǒng)計，2012年88%的宮頸癌新發(fā)病例來自發(fā)展中國家，其中95%的死亡病例來自發(fā)展中國家。相關(guān)文獻(xiàn)報道，我國每年新發(fā)宮頸癌病例約75 000例，死亡約34 000例，分別占世界范圍宮頸癌發(fā)病率和死亡率的14%和12%[3-4]。國內(nèi)外均有研究顯示，35歲以下女性宮頸癌的患病率呈上升趨勢，年輕女性患宮頸癌后的轉(zhuǎn)移率亦逐漸增加[1，3]。宮頸癌主要是由CIN轉(zhuǎn)變而來，但并不是所有的CIN都能轉(zhuǎn)變?yōu)榘┳?，其病理生理學(xué)進(jìn)展有兩種轉(zhuǎn)歸，約75%患者可自然消退，約25%可在5～15年內(nèi)進(jìn)展為宮頸浸潤癌[5]。因此，早期診斷排查宮頸癌及其癌前病變具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的宮頸癌篩查方法主要是靠體檢發(fā)現(xiàn)宮頸病灶，或表現(xiàn)出接觸性陰道出血等臨床癥狀，然后進(jìn)行醋酸試驗及液基薄層細(xì)胞、TBS等細(xì)胞學(xué)檢查。但該方法只能對疾病做出排除性診斷，假陽性率和假陰性率均很高，不能提高宮頸癌的早期診斷率[6-7]。目前我國每年新發(fā)宮頸癌病例數(shù)占世界新發(fā)病例的1/5[3]，但我國尚未形成成熟的篩查模式。宮頸癌早期檢出率盡管隨著臨床檢測技術(shù)的發(fā)展逐步提高，但參差不齊的細(xì)胞學(xué)檢測產(chǎn)品使檢測的敏感性和特異性離發(fā)達(dá)國家仍有較大差距。因此，尋找有效的宮頸病變預(yù)測指標(biāo)在宮頸癌早期干預(yù)、降低宮頸癌發(fā)生率和死亡率中具有重要的臨床意義。

大量的流行病學(xué)和實驗研究數(shù)據(jù)表明，HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的重要條件[8-9]。HPV是已經(jīng)得到肯定的少數(shù)DNA腫瘤病毒之一，有HPV感染的宮頸癌的相對危險性較正常人增加250倍。迄今已經(jīng)鑒定的HPV有130多種，根據(jù)不同的HPV亞型與腫瘤發(fā)生的概率高低分為高危型和低危型[10]。高危型的HPV感染是宮頸癌發(fā)生的強(qiáng)危險因素，與宮頸癌前病變和宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前已經(jīng)明確有90%以上的宮頸癌與HPV感染密切相關(guān)，但僅有不到5%的宮頸HPV感染會進(jìn)展為宮頸癌。HPV感染宮頸上皮細(xì)胞后，通過E6、E7促進(jìn)病毒整合到染色體脆弱區(qū)，并抑制P53抑癌基因的活性，從而啟動腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。Shen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HPV異倍體的出現(xiàn)是宮頸癌腫瘤細(xì)胞形成過程中的一個重要生物學(xué)標(biāo)志，且HPV DNA的含量對判斷細(xì)胞良惡性及癌前病變和腫瘤的診斷具有十分重要的意義。張敦蘭等[13]在875例宮頸病變的患者中檢測出HPV DNA，結(jié)果顯示宮頸病變程度越重，HPV DNA異倍體陽性細(xì)胞數(shù)越多。同時宮頸癌變的惡性程度越高，核異質(zhì)的細(xì)胞數(shù)越多，細(xì)胞增生也就越活躍。WHO認(rèn)為，HPV檢測是目前宮頸癌首選的初篩方法。Ronco等[14]在一項大樣本研究中對47 001例女性進(jìn)行HPV初篩，47 396例女性進(jìn)行單獨(dú)宮頸細(xì)胞學(xué)初篩，結(jié)果顯示，兩種篩查方法在第一輪篩查中宮頸癌的檢出率相似，而第二輪篩查（間隔2～3年）中HPV組未檢出宮頸癌新發(fā)病例，但細(xì)胞學(xué)組檢出9例新發(fā)病例（P = 0.004）。Cuzick等[15]通過以HPV檢測為主的研究發(fā)現(xiàn)，若HPV初篩為陰性，6年后宮頸病變的發(fā)生率僅為0.27%，低于細(xì)胞學(xué)的0.97%，說明HPV的檢測效能優(yōu)于細(xì)胞學(xué)檢查。若檢測發(fā)現(xiàn)HPV持續(xù)感染，可行陰道鏡檢查，了解病變區(qū)域的毛細(xì)血管分布、移行帶區(qū)域上皮及血管網(wǎng)纏繞的異型上皮，然后在病變區(qū)域行活組織檢查，通過組織病理學(xué)確診。若肉眼未見明顯病變區(qū)域，可選擇在宮頸移行帶區(qū)的3、6、9、12點方向處行活檢以提高確診率。2013年美國癌癥協(xié)會更新指南建議：小于21歲的女性不需進(jìn)行篩查，21～29歲需每3年行細(xì)胞學(xué)篩查，30～65歲者每5年行細(xì)胞學(xué)和HPV聯(lián)合篩查，大于65歲者若連續(xù)2次細(xì)胞學(xué)聯(lián)合HPV篩查陰性，可以停止篩查[10]。用HPV DNA檢測宮頸病變靈敏度較高，且可避免反復(fù)宮頸活檢引起損傷，逐漸為臨床醫(yī)生所接受。但人群中HPV感染率較高，且大多數(shù)HPV感染為自限性，可在一段時間后自行轉(zhuǎn)陰。因此，如果單用HPVDNA檢測宮頸病變，特異性不高，容易造成過度治療。

HPV L1蛋白是參與HPV病毒形成的一種衣殼蛋白，當(dāng)HPV整合到宿主基因后，HPV L1蛋白表達(dá)降低[16]。同時，HPV L1蛋白還是免疫反應(yīng)攻擊HPV病毒感染細(xì)胞的主要靶點，能與T細(xì)胞及組織相容性抗原結(jié)合，激活免疫反應(yīng)，阻斷病毒感染的組織進(jìn)一步發(fā)展為癌。當(dāng)其表達(dá)降低時，被HPV感染的細(xì)胞不能被人體的免疫系統(tǒng)及時清除，導(dǎo)致局部病變不斷惡化[17-18]。HPV L1蛋白是HPV感染復(fù)制早期的結(jié)構(gòu)蛋白，能反映HPV的復(fù)制狀態(tài)，當(dāng)HPV整合到宿主基因后，HPV L1蛋白的表達(dá)下降。另一方面，HPV L1蛋白是人體細(xì)胞免疫反應(yīng)的靶蛋白，當(dāng)其表達(dá)缺失時，被HPV感染的細(xì)胞就不能被機(jī)體免疫系統(tǒng)有效識別并清除，進(jìn)而促進(jìn)上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[19]。因此，HPV L1蛋白的表達(dá)情況與子宮頸病變之間可能存在一定的關(guān)系。張金偉等[16]對宮頸病變患者行活組織檢查，然后用免疫組化的方法檢測各種程度宮頸病變組織的HPV L1蛋白，結(jié)果顯示隨著宮頸組織病理學(xué)級別的升高，HPV L1蛋白陽性表達(dá)率呈現(xiàn)下降趨勢。HPV L1蛋白下降說明HPV病毒感染處于游離狀態(tài)或短期感染，而HPV L1蛋白的缺失說明HPV病毒DNA整合到宿主基因，提示存在HPV的持續(xù)感染，機(jī)體無法識別與清除病毒，可能引發(fā)宮頸病變并向?qū)m頸癌的方向發(fā)展[20-21]。程紹云等[22]研究發(fā)現(xiàn)在HPV感染的患者中，HPV L1蛋白陽性組的病變持續(xù)率和進(jìn)展率都顯著高于陰性對照組。Lee等[23]研究表明，隨著患者子宮頸病變程度加重，HPV L1蛋白表達(dá)率呈下降趨勢，同時該蛋白缺失的低級別宮頸病變?nèi)菀走M(jìn)展為高級別宮頸病變。

然而，如果單憑HPV L1蛋白來預(yù)測宮頸病變的進(jìn)展，有一定的局限性和不準(zhǔn)確性，因為HPV L1蛋白表達(dá)陰性既有可能預(yù)示宮頸病變向惡變的方向進(jìn)展，還有可能表示患者無HPV感染。HPV L1蛋白是人體免疫細(xì)胞細(xì)胞殺傷HPV病毒的攻擊位點。當(dāng)HPV感染人體后，體內(nèi)表達(dá)正常的HPV L1蛋白單體會與CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞上的MHC分子形成免疫復(fù)合物，激活體內(nèi)的免疫級聯(lián)反應(yīng)，并在宮頸局部形成高濃度的免疫抗體，殺傷并清除被HPV感染的細(xì)胞。因此，在HPV陽性的患者中，HPV L1蛋白高表達(dá)往往意味著HPV病毒以游離狀態(tài)存在，而不是已經(jīng)大范圍侵犯細(xì)胞。這種情況屬于非進(jìn)展性的病變，發(fā)生高級別宮頸病變的概率極低。反之，如果HPV陽性的患者伴有HPV L1蛋白陰性，則有可能減少了機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，表示HPV感染將呈進(jìn)展趨勢，發(fā)生CIN或?qū)m頸癌的風(fēng)險較高。因此，HPV L1蛋白的檢測要結(jié)合其他檢查才能較準(zhǔn)確地預(yù)測宮頸病變。王家建等[2]篩選了386例高危型HPV感染的婦女，對其進(jìn)行宮頸病變分級并檢測HPV L1蛋白在不同組別的表達(dá)。結(jié)果顯示HPV L1蛋白檢測對宮頸病變具有較高的敏感性和陰性預(yù)測值，可在一定程度上彌補(bǔ)細(xì)胞學(xué)檢查的不足，特別是對HPV陽性婦女的分流篩查具有重要的臨床指導(dǎo)價值。本研究聯(lián)合檢測HPV DNA與HPV L1蛋白在不同程度宮頸病變中的差異，結(jié)果顯示HPV DNA陽性率在宮頸癌中最高，隨著子宮頸病變程度增加，其陽性率呈上升趨勢；而HPV L1蛋白在NILM和宮頸炎中的陽性表達(dá)率最高，在宮頸癌中最低，隨著子宮頸病變程度增加，其陽性率呈下降趨勢。二者聯(lián)合檢測，能大幅度提高宮頸惡性病變檢測的敏感性與特異性。與上述學(xué)者的研究結(jié)果相符。

綜上所述，聯(lián)合檢測HPV DNA與HPV L1蛋白對診斷宮頸病變程度和預(yù)測宮頸病變進(jìn)展具有重要的臨床指導(dǎo)價值，但其臨床應(yīng)用推廣尚需大量的臨床資料積累和長期隨訪證實。

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（收稿日期：2015-11-10 本文編輯：任 念）