燕群　趙芯梅　鐘結(jié)桃　楊海云　方堉欣　李?lèi)?ài)民，2

·論著·

PBLD通過(guò)MAPK通路抑制HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移

燕群1趙芯梅1鐘結(jié)桃1楊海云1方堉欣1李?lèi)?ài)民1，2

目的分析PBLD對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，并初步探討其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。方法首先利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建PBLD過(guò)表達(dá)的HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，CCK-8法檢測(cè)PBLD過(guò)表達(dá)后肝癌細(xì)胞增殖能力的變化，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PBLD過(guò)表達(dá)后HepG2細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化，最后利用W estern-blot技術(shù)篩選并驗(yàn)證PBLD可能的下游信號(hào)通路。結(jié)果PBLD過(guò)表達(dá)后HepG2細(xì)胞的增殖能力被顯著抑制（P＜0.05），同時(shí)，發(fā)生侵襲、遷移的細(xì)胞數(shù)量與空載對(duì)照細(xì)胞相比顯著減低［（68± 12.5）vs.（19±10.21），P＜0.01；（30±8.83）vs.（11±4.41），P＜0.01］。進(jìn)一步W estern-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，PBLD過(guò)表達(dá)可顯著抑制MAPK信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)。結(jié)論P(yáng)BLD可通過(guò)MAPK信號(hào)通路抑制HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

PBLD；HepG2細(xì)胞；增殖；轉(zhuǎn)移；信號(hào)通路

【Abstract】Objective To investigate the effectsof PBLD on the proliferation，m igration and invasion of HepG2 cells and to explore the underlyingmolecularmechanism.Methods Firstly，we constructed PBLD overexpression cell line using liposome transfection technique.CCK-8 proliferation assay was performed to examine theeffectsof PBLD on cellgrow th in vitro.Transwellm igration and invasion assaywas carried out to investigate the effects of PBLD on themigration and invasion of HepG2 cells.Finally，the downstream genes mediating the effectsof PBLD in HepG2 cellsw ere identified by W estern-blotexam ination.Results CCK-8 proliferation assay showed that upregulation of PBLD significantly inhibited the proliferation rate of HepG2 cells（P＜0.05）.Transwellmigration and invasion assay showed thatHepG2 cellsmigrated slowerand had less ability to invade through the M atrigel-coated insertsw hen PBLD wasupregulated［（68±12.5）vs.（19± 10.21），P＜0.01；（30±8.83）vs.（11±4.41），P＜0.01］.Theexpressionsof genes in MAPK signalpathwaywere significantly inhibited in PBLD overexpression cells.Conclusion PBLD inhibited the grow th，m igration and invasion of HCC cells in vitro via MAPK signal pathw ay.

【Keywords】PBLD；HepG2 cell；Proliferation；Migration；Signalpathway

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）的發(fā)病率位列全球第六，全球每年新發(fā)病例782 500，死亡病例達(dá)745 500之多［1-2］，占所有成人肝臟惡性腫瘤的75%～90%［3］。HCC具有發(fā)病隱匿，惡性程度高、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，預(yù)后不良，是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病。目前，HCC發(fā)生發(fā)展的確切分子機(jī)制還不明確。因此，從分子水平開(kāi)展對(duì)HCC發(fā)病機(jī)制的深入研究，對(duì)探索新的靶向治療途徑、改善肝癌預(yù)后意義深遠(yuǎn)。

Phenazine biosynthesis-like domain-containing protein（PBLD）又稱(chēng)為MAWBP，最早在2001年由Iriyama等人［4］利用酵母雙雜交技術(shù)從人的肝臟cDNA庫(kù)中分離發(fā)現(xiàn)。作為phenazinebiosynthesislike protein蛋白家族的惟一代表，PBLD廣泛分布于人的大腦、心臟、肺臟、肝臟、胰腺和腎臟等各種組織中。已有研究發(fā)現(xiàn)，PBLD的表達(dá)水平在胰島素抵抗、葉酸缺乏癥和高血壓等一些疾病中升高［5］。但是，該分子在人體各組織及其在各種腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體生物學(xué)功能及其發(fā)揮作用的分子機(jī)制目前還沒(méi)有研究報(bào)道。迄今，關(guān)于該分子的有限認(rèn)識(shí)僅僅來(lái)源于基因組和蛋白組學(xué)海量、籠統(tǒng)的篩選結(jié)果中。因此，本研究首先分析了PBLD對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2增殖、侵襲和遷移的影響，然后進(jìn)一步對(duì)PBLD發(fā)揮這種生物學(xué)作用的下游信號(hào)通路進(jìn)行了探索。

材料與方法

一、細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（American type culture collection，ATCC），普通高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，G418購(gòu)自美國(guó)MPBiomedicals公司，PBLD過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1/PBLD、空載質(zhì)粒pEGFP-N1/vector及其相應(yīng)菌液購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectAM INE 2000購(gòu)自Invitrogen公司，CCK-8液購(gòu)自Beyotime公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司，Transwell小室購(gòu)自Corning公司，兔抗人ERK/pERK、p38/p-p38及JNK/pJNK一抗均購(gòu)自CST公司，小鼠抗人Tubulin單克隆一抗購(gòu)自三箭生物技術(shù)有限公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100u青、鏈霉素雙抗的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PBLD的HepG2細(xì)胞株及其空載對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)在含400μg/m L G418的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中。以上所有細(xì)胞的培養(yǎng)在溫度37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中。

三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

調(diào)整HepG2細(xì)胞密度為1×105/m L接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時(shí)即可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。按照LipofectAM INE 2000說(shuō)明書(shū)將PBLD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞株中，然后在培養(yǎng)基中加入G418對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選，96孔板進(jìn)行單克隆篩選，所得細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

四、CCK-8檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按每孔2 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后換液，分別在0、24、48、72 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)于每組細(xì)胞中隨機(jī)選取5孔細(xì)胞進(jìn)行CCK-8增殖檢測(cè)。以培養(yǎng)基體積：CCK-8體積=10：1的比例配制工作液，在每孔中加入100μLCCK-8工作液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光值。以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，各組細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均光吸收值與各組細(xì)胞貼壁0 h時(shí)測(cè)得的平均吸光值的比值作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的繪制。

五、Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel按1：8的比例稀釋?zhuān)瑢⑾♂屢河妙A(yù)冷的槍頭緩緩加至Transwell小室基底膜的內(nèi)室面上，37℃風(fēng)干。消化細(xì)胞前一天饑餓細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后輕輕吹勻細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液。分別將200μL細(xì)胞懸液加入基質(zhì)膠（侵襲）和不含基質(zhì)膠（遷移）的Transwell小室內(nèi)室中，外室中加入500μL含20%FBS的培養(yǎng)基，常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，用棉簽擦去Transwell小室基底膜內(nèi)室面殘留的貼壁細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫下固定20 h，0.5%結(jié)晶紫室溫下染色20m in，PBS洗凈結(jié)晶紫染液，將染色后的Transwell小室倒置，室溫下風(fēng)干。于高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

六、Western-blot實(shí)驗(yàn)

裂解液冰上裂解細(xì)胞20m in，每隔10min混勻一次，4℃，12 000 rpm離心30m in，取上清。加入loading buffer后沸水中煮5m in使其充分變性。利用10%分離膠分離目的蛋白，200mA，90m in恒流轉(zhuǎn)膜。將載有目的蛋白的PVDF膜5%的脫脂奶粉/ TBST室溫封閉2 h，4℃搖床一抗孵育過(guò)夜（濃度均為1：1 000），之后常溫二抗孵育1 h（1：3 000），發(fā)光。

七、統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。兩不同組間差異比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05視為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、PBLD過(guò)表達(dá)抑制HepG2細(xì)胞株的增殖

為研究PBLD對(duì)肝癌細(xì)胞株增殖能力的作用，我們首先將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PBLD的HepG2_PBLD及其相應(yīng)的空載對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，在兩組細(xì)胞貼壁后的24、48、72 h，PBLD過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞量均顯著小于它們所對(duì)應(yīng)的空載對(duì)照組細(xì)胞數(shù)（P＜0.05，圖1）。因此，由CCK-8結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)PBLD可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力。

圖1 CCK-8檢測(cè)PBLD過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖功能的影響

二、PBLD可抑制HepG2細(xì)胞侵襲、遷移能力

為研究PBLD對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響，我們分別將HepG2_PBLD和HepG2_vector接種于含有基質(zhì)膠和無(wú)基質(zhì)膠的Transwell小室中，48 h后結(jié)晶紫染色、計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖2所示，在沒(méi)有基質(zhì)膠存在的情況下，HepG2_PBLD細(xì)胞穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)均明顯少于空載對(duì)照細(xì)胞（P＜0.01）；同樣，在有基質(zhì)膠存在的條件下，HepG2_PBLD穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)也均明顯少于其對(duì)應(yīng)的空載對(duì)照細(xì)胞（P＜0.01）。由此可推斷，PBLD能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

圖2 Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PBLD過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞株遷移、侵襲能力的影響

三、PBLD通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用

為進(jìn)一步探索PBLD發(fā)揮生物學(xué)作用的下游分子機(jī)制，我們利用Western-blot檢測(cè)了PBLD過(guò)表達(dá)之后MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵分子p-ERK、p-p38以及p-JNK的表達(dá)變化，結(jié)果如圖3所示，PBLD過(guò)表達(dá)后ERK、p38及JNK的表達(dá)無(wú)顯著變化，但其對(duì)應(yīng)的活化形式pERK、p-p38及pJNK的表達(dá)均被顯著抑制。由此我們推斷，PBLD可能抑制MAPK信號(hào)通路進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲、遷移。

圖3 Western-blot檢測(cè)PBLD過(guò)表達(dá)后MAPK信號(hào)通路的變化

討論

增殖能力和侵襲、轉(zhuǎn)移能力是判斷腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)。因此，為研究PBLD對(duì)肝癌惡性進(jìn)展的影響，我們利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將PBLD過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中，首先觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。CCK-8結(jié)果顯示，PBLD過(guò)表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞株的增殖能力?；仡櫼酝嘘P(guān)PBLD與腫瘤的研究，除了組織的基因組和蛋白組學(xué)的篩選，關(guān)于PBLD生物學(xué)功能的研究?jī)H有個(gè)別報(bào)道。Li等［6］以蛋白組學(xué)篩選的結(jié)果為基礎(chǔ)，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染分析了PBLD對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，并得出了PBLD可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖的結(jié)論，與本研究結(jié)果相一致。

在前期的研究中，Xu等［7］利用蛋白組學(xué)對(duì)有門(mén)靜脈癌栓的肝癌組織和沒(méi)有門(mén)靜脈癌栓的肝癌組織的差異蛋白進(jìn)行篩選，其中，PBLD在有靜脈癌栓的肝癌組織中表達(dá)顯著降低，提示PBLD可能與肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移相關(guān)。為驗(yàn)證此假設(shè)，在本研究的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)部分利用Transwell侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PBLD對(duì)肝癌細(xì)胞株侵襲、遷移能力的影響，結(jié)果顯示PBLD可以顯著抑制肝癌細(xì)胞株的侵襲和遷移能力。該結(jié)果與Li等［6］在胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移研究中的研究結(jié)果相一致。

關(guān)于PBLD發(fā)揮作用的分子機(jī)制，目前的研究對(duì)其知之甚少。Li等［6］發(fā)現(xiàn)，MAWBP（PBLD）可通過(guò)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT從而抑制EMT相關(guān)的胃癌的進(jìn)展的結(jié)論；Zhao等［8］推測(cè)PBLD可能通過(guò)MAPK通路對(duì)癌前病變潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮一定的調(diào)控作用。絲裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinaae，MAPK）是一組可被多種信號(hào)激活的絲/蘇氨酸激酶。已有研究證實(shí)，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，其作用過(guò)程涉及多層次的細(xì)胞調(diào)節(jié)。MAPK有多個(gè)亞家族，主要包括ERK、JNK/SAPK，p38MAPK等。已有研究證實(shí)，MAPK在HCC中表達(dá)上調(diào)［9］，而被激活的MAPK在腫瘤的惡性進(jìn)展中起到重要作用［10］，抑制MAPK可顯著抑制腫瘤的血管生成［11］及轉(zhuǎn)移能力。本研究發(fā)現(xiàn)，PBLD過(guò)表達(dá)之后，MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)被顯著抑制。由此可推斷，PBLD可能通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路抑制HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，PBLD作為一個(gè)潛在的候選抑癌基因，可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路抑制HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

［1］FornerA，LlovetJM，BruixJ.Hepatocellularcarcinoma［J］.Lancet，2012，379（9822）：1245-1255.

［2］TorreLA，BrayF，SiegelRL，etal.Globalcancerstatistics，2012［J］. CACaancerJClin，2015，65（2）：87-108.

［3］CenterMM，JemalA.Internationaltrendsinlivercancerincidence rates［J］.CancerEpidemiolBiomarkersPrev，2011，20（11）：2362-2368.

［4］IriyamaC，MatsudaS，KatsumataR，etal.Cloningandsequencing ofanovelhumangenewhichencodesaputativehydroxylase［J］.J HumGenet，2001，46（5）：289-292.

［5］SchvartzD，CouteY，BrunnerY，etal.Modulationofneuronal pentraxin1expressioninratpancreaticbeta-cellssubmittedto chronicglucotoxicstress［J］.MolCellProteomics，2012，11（8）：244-254.

［6］LiDM，ZhangJ，LiWM，etal.MAWBPandMAWDinhibitproliferationandinvasioningastriccancer［J］.WorldJGastroenterol，2013，19（18）：2781-2792.

［7］XuX，WeiX，LingQ，etal.Identificationoftwoportalveintumor thrombosisassociatedproteinsinhepatocellularcarcinoma：protein disulfide-isomeraseA6andapolipoproteinA-I［J］.JGastroenterol Hepatol，2011，26（12）：1787-1794.

［8］ZhaoX，KangB，LuC，etal.Evaluationofp38MAPKpathwayas amolecularsignatureinulcerativecolitis［J］.JProteomeRes，2011，10（5）：2216-2225.

［9］ChiuCC，ChenJY，LinKL，etal.p38MAPKandNF-kappaB pathwaysareinvolvedinnaphtho［1，2-b］furan-4，5-dioneinduced anti-proliferationandapoptosisofhumanhepatomacells［J］.CancerLett，2010，295（1）：92-99.

［10］HuberMA，AzoiteiN，BaumannB，etal.NF-кBisessentialfor epithelial-mesenchymaltransitionandmetastasisinamodelof breastcancerprogression［J］.JClinInvest，2004，114（4）：569-581.

［11］MukaidaN，MoritaM，IshikawaY，etal.Novelmechanismofglucocorticoid-mediatedgenerepression.Nuclearfactor-kappaBis targetforglucocorticoid-mediatedinterleukin8generepression［J］. JBiolChem，1994，269（18）：13289-13295.

（本文編輯：南清振）

《現(xiàn)代消化及介入診療》雜志征稿、征訂啟事

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PBLD inhibits the p roliferation，invasion and m etastasis of HepG 2 cells through the M APK pathw ay

YANQun1，ZHAO Xin-mei1，ZHONG Jie-tao1，YANG Hai-yun1，F(xiàn)ANG Yu-xin1，LIAi-min1，2.
1）Department of Gastroenterology，Guangdong Provincial Key Laboratory ofGastroenterology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2）DepartmentofGastroenterology，Guangzhou Key Laboratory of Digestive Disease，Guangzhou FirstMunicipal People′s Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，China.Correspondence to：LIAi-min，E-mail：lam0725@163.com

2016-07-10）

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.04.001

1 510515南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化科；2 510180廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院消化科

李?lèi)?ài)民，E-mail：lam0725@163.com

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