譚志軍　劉玉瑩　李昌生　楊彩云

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表皮生長因子受體表達(dá)與結(jié)直腸癌患者化療耐藥及預(yù)后的關(guān)系

譚志軍劉玉瑩李昌生楊彩云

目的研究表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）與結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者化療耐藥及預(yù)后的關(guān)系。方法采用免疫組化法分析2010年4月至2012年9月壽光市人民醫(yī)院37名CRC患者腫瘤組織中EGFR表達(dá)強(qiáng)度，采用復(fù)合評分系統(tǒng)（0～9）進(jìn)行評價，并分析其與不同臨床病理特征及化療耐藥之間的關(guān)系。結(jié)果高分化、中分化、低分化CRC腫瘤組織及正常結(jié)直腸組織EGFR表達(dá)陽性率分別為25%、56.25%、84.62%和16.67%。低分化、中分化CRC患者EGFR陽性表達(dá)率與高分化CRC和正常直腸組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.576，P=0.003）。37名患者中EGFR強(qiáng)表達(dá)率為67.57%。EGFR強(qiáng)表達(dá)與CRC臨床分期（χ2=4.68，P=0.030）及化療反應(yīng)率（χ2=7.27，P=0.007）顯著相關(guān)。結(jié)論EGFR強(qiáng)表達(dá)（復(fù)合評分≥6）預(yù)示化療反應(yīng)率低，可能成為CRC化療耐藥的預(yù)測指標(biāo)。

結(jié)直腸腫瘤；預(yù)后；表皮生長因子受體；化療耐藥

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，屬于常見消化道惡性腫瘤之一。其全球每年新增患者約40萬例，在世界范圍內(nèi)，仍是癌癥死亡的主要原因之一。在過去幾十年中，由于5-氟尿嘧啶（5-FU）、伊立替康（Irinotecan）、奧沙利鉑（Oxaliplatin）、卡培他濱（Capecitabine）及分子靶向藥物西妥昔單抗（Cetuximab）和貝伐珠單抗（Bevacizumab）等抗腫瘤藥物的廣泛應(yīng)用，CRC患者的中位生存期已由12個月延長至月21個月［1-2］。

然而，腫瘤治療中的化療耐藥及患者預(yù)后差仍是目前化療藥物普遍存在問題。臨床上死于不同程度耐藥的腫瘤患者約占90%以上。其中部分患者屬于先天性耐藥（nature resistance），另一部分患者屬于用藥過程中逐漸產(chǎn)生耐藥，即獲得性耐藥（acquired resistance）。近年來國內(nèi)外學(xué)者已對直腸癌耐藥機(jī)制及預(yù)后標(biāo)志物進(jìn)行了廣泛的研究。CXCL10/CXCR3［3］、X-連鎖凋亡蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein）［4］等可用于預(yù)測CRC耐藥的生物標(biāo)志物相繼被發(fā)現(xiàn)。胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TS）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α）等則被發(fā)現(xiàn)與CRC預(yù)后存在關(guān)聯(lián)［5］。

表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）是一個170 kDa的跨膜糖蛋白受體酪氨酸激酶，已在多種癌癥中被檢測到，被證明與乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌和頭頸癌等的預(yù)后及臨床進(jìn)展相關(guān)［6］。因此，本文對CRC患者腫瘤組織中EGFR的表達(dá)與化療耐藥及預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行臨床實證研究，以期為臨床治療方案的制定及藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

選取2010年4月至2012年9月經(jīng)壽光市人民醫(yī)院病理科專家診斷證實為原發(fā)性CRC患者腫瘤組織標(biāo)本共37例，其中男性30例，女性7例，患者年齡為26～72歲，平均年齡為45.2±10.1歲。其中高分化CRC 8例、中分化CRC 16例，低分化CRC 13例。所有患者術(shù)前均未接受放、化療及免疫治療，術(shù)后給予3個療程以上以5-FU/亞葉酸鈣為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療方案。另取同期6例正常直腸組織作對照。

二、病理切片制備及免疫組化分析

患者腫瘤組織切除后，以10% pH中性福爾馬林固定，梯度乙醇脫水（TKY-TSC生物組織智能脫水機(jī)，孝感市泰醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司），石蠟包埋（TKY-BMA 型石蠟包埋機(jī)，孝感市泰醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司），修蠟，切5 μm薄片（MICROM HM 315型切片機(jī)，美康儀器設(shè)備北京有限公司），脫蠟，水化。

免疫組化分析根據(jù)參考文獻(xiàn)方法［7］略作修改。切片以0.3%過氧化氫甲醇溶液浸泡30 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后采用含0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0，99℃）浸漬40 min以修復(fù)抗原。EGFR/113小鼠一抗（上海起發(fā)實驗試劑有限公司）作為一抗，稀釋比例為1：20，室溫下孵育60 min；隨后采用生物素標(biāo)記親和純化山羊抗小鼠IgG二抗（上海研卉生物科技有限公司）和辣根過氧化物酶-鏈霉親和素偶聯(lián)物（上海魯汶生物科技有限公司）孵育。DAB顯色，蘇木紫復(fù)染，脫水，透明，OLYMPUS BX-41顯微鏡觀察。陰性對照為磷酸鹽緩沖液，陽性對照為已知CRC陽性切片。

三、EGFR表達(dá)評分

光學(xué)顯微鏡下對病理切片進(jìn)行觀察計數(shù)，按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價。

陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：肉眼觀察過氧化物沉積物顏色（淡黃色至深褐色），EGFR陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜和/或胞漿，以染色為淡黃色至深褐色為陽性，未染色為陰性（0），染為淡黃色為弱陽性（1），褐黃色為陽性（2），深褐色為強(qiáng)陽性（3）。

陽性細(xì)胞數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)：按照陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比例劃分為0：無陽性細(xì)胞；1：占1%～24%；2：占25%～50%；3：＞50%。

以陽性結(jié)果評分與陽性細(xì)胞數(shù)判定評分乘積作為EGFR表達(dá)復(fù)合得分，范圍為0～9。復(fù)合得分＜6視為EGFR低表達(dá)，復(fù)合得分≥6視為EGFR高表達(dá)。

四、化療反應(yīng)評定

患者完成3療程化療后進(jìn)行化療反應(yīng)評定，化療結(jié)束后至少隨訪1～2年。療效評價由盆腔CT檢查、B超檢查、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）測定進(jìn)行判斷。檢查頻率為每3～4月一次。參考世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)分級如下［8］：（1）臨床完全緩解（complete response，CR）：臨床癥狀消失，盆腔檢查及B超檢查均無包塊，CEA值下降至正常；（2）臨床部分緩解（partial response，PR）：臨床癥狀消失，病灶縮?。?0%，無疾病進(jìn)展表現(xiàn)，CEA值較術(shù)前明顯下降但未達(dá)正常；（3）臨床無效：臨床癥狀存在，病灶縮小＜50%，盆腔檢查及B超檢查有包塊，病灶增大或復(fù)發(fā)，CEA值未下降或下降后再升高、病情在3個月內(nèi)急劇加重，視為臨床無效。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果采用SPSS17.0進(jìn)行分析。EGFR表達(dá)（＜6或≥6）、主要臨床指標(biāo)及化療反應(yīng)率比較采用χ2檢驗進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　果

一、CRC患者腫瘤組織的EGFR表達(dá)

CRC腫瘤組織及正常直腸組織EGFR表達(dá)的復(fù)合評分（陽性結(jié)果評分與陽性細(xì)胞數(shù)判定評分的乘積）見表1，其中強(qiáng)陽性表達(dá)（≥6）為57.57%。而高分化、中分化、低分化CRC腫瘤組織及正常直腸組織EGFR表達(dá)陽性率分別為25%、56.25%、84.62%和16.67%。中分化、低分化CRC腫瘤組織與高分化CRC及正常直腸組織EGFR表達(dá)陽性率相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.576，P＜0.05）。37名CRC患者中，強(qiáng)陽性患者（≥6）及弱陽性患者（＜6）分別為25名（67.57%）、12名（32.43%）。

腫瘤組織中EGFR表達(dá)的典型病理圖片見圖1。由圖1可見，CRC患者腫瘤組織的胞漿中EGFR表達(dá)呈顯著陽性特征。

表1　CRC患者腫瘤組織及正常直腸組織中的EGFR表達(dá)（例）

圖1　CRC腫瘤組織中EGFR的表達(dá)（×100）。A、B：胞漿EGFR表達(dá)為強(qiáng)陽性；C、D：胞漿EGFR表達(dá)為陽性

二、EGFR表達(dá)與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系

化療結(jié)束后對患者進(jìn)行了為期1～2年的隨訪，隨訪至患者死亡或2014年12月。隨訪率97.4%，患者平均隨訪時長為14個月。采用單因素分析比較了EGFR表達(dá)復(fù)合評分與CRC患者臨床病理特征間的關(guān)系。由表2可見，CRC患者EGFR表達(dá)復(fù)合評分與患者年齡、性別、腫瘤細(xì)胞分化程度、是否淋巴轉(zhuǎn)移、瘤徑及CEA水平無關(guān)，差異無顯著性（P＞0.05），但與CRC臨床分期相關(guān)（P＜0.05），M期、Ⅳ期腫瘤組織中EGFR強(qiáng)陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ～Ⅲ期（χ2=4.68，P＜0.05），且分期越晚EGFR強(qiáng)陽性表達(dá)率越高。

三、EGFR表達(dá)與CRC患者化療反應(yīng)率的關(guān)系

37名患者中，EGFR強(qiáng)陽性表達(dá)者為25名，對化療有效9名，化療反應(yīng)率36%；EGFR弱陽性表達(dá)者為12名，對化療有效10名，化療反應(yīng)率83%；兩組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.27，P=0.007）。

表2　EGFR表達(dá)與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］

表3　EGFR表達(dá)與CRC患者化療反應(yīng)率的關(guān)系（例）

討　論

本研究測定了CRC患者腫瘤組織EGFR免疫組化反應(yīng)活性，并分別采用卡方檢驗和費(fèi)舍爾精確檢驗分析了EGFR表達(dá)強(qiáng)度（＜6或≥6）與CRC組織學(xué)特征、臨床特征及化療反應(yīng)率間的關(guān)系。

EGFR在多種腫瘤中均存在過表達(dá)現(xiàn)象，其在CRC中的過表達(dá)尤為突出，據(jù)報道CRC患者腫瘤組織中EGFR表達(dá)率約為25%～77%，且多數(shù)與預(yù)后不良相關(guān)［9］。其中EGFR表達(dá)率的報道數(shù)據(jù)差異較大，在一定程度上與EGFR定量測定方法差異有關(guān)。免疫組化法雖然存在重復(fù)性差等問題，但仍是目前用于評價EGFR表達(dá)的常用方法之一［10］。目前評價EGFR陽性表達(dá)通常采用陽性結(jié)果評分和陽性細(xì)胞數(shù)評分兩種獨立的評分系統(tǒng)，為更為準(zhǔn)確的反應(yīng)EGFR陽性表達(dá)的范圍及程度，本研究采用了復(fù)合評分系統(tǒng)［11］。EGFR陽性表達(dá)率結(jié)果顯示：EGFR在低分化和中分化腫瘤CRC組織中的陽性表達(dá)率顯著高于高分化腫瘤組織及正常對照組織，表明EGFR過表達(dá)與CRC的發(fā)病及進(jìn)展存在一定關(guān)聯(lián)。其中強(qiáng)陽性表達(dá)（≥6）為57.57%，與文獻(xiàn)報道相一致［9］。

患者年齡、性別、腫瘤細(xì)胞分化程度、臨床分期、是否淋巴轉(zhuǎn)移、瘤徑、靜脈浸潤及CEA等可能與CRC患者預(yù)后相關(guān)，但相關(guān)程度尚存在爭議［12］，其中臨床分期、浸潤深度等被認(rèn)為屬于CRC患者預(yù)后的獨立影響因素。

Li等［13］研究表明，CRC患者腫瘤組織Bcl-2、B7-H1、EGFR、VEGF表達(dá)水平均與年齡、腫瘤浸潤程度等無關(guān)，其中B7-H1與腫瘤分期顯著相關(guān)，但其EGFR評分為非復(fù)合評分。Jiang等［14］通過Meta分析顯示，EGFR表達(dá)與CRC患者預(yù)后相關(guān)及生存期相關(guān)。

化療耐藥是目前癌癥藥物治療普遍存在的問題，近年來研發(fā)并進(jìn)入臨床應(yīng)用的EGFR拮抗劑類藥物如西妥昔單抗和帕尼單抗在CRC治療中顯示了良好的療效，但目前也已出現(xiàn)獲得性耐藥，通常在治療開始后第3～12個月患者即出現(xiàn)耐藥［13］。Misale等［14］研究表明，抑制EGFR表達(dá)可抑制CRC患者一過性耐藥，說明EGFR過表達(dá)與CRC患者的化療耐藥存在相關(guān)性。本研究中發(fā)現(xiàn)，EGFR表達(dá)復(fù)合評分與化療反應(yīng)率顯著相關(guān)，EGFR強(qiáng)表達(dá)（≥6）的腫瘤組織，其化療反應(yīng)率顯著低于弱表達(dá)的腫瘤組織，與上述報道相符。

由于腫瘤藥物作用機(jī)理復(fù)雜，且體內(nèi)存在Ras/ Raf/MEK/ERK/MAPK通路、PI3K/PDK1/Akt（PKB）通路、PLC-C通路、JAK/STAT通路等多條EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因此，目前尚無法闡明EGFR導(dǎo)致化藥耐藥的詳細(xì)機(jī)制。關(guān)于EGFR致化藥耐藥的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Impact of EGFR expression on chemoresistance and prognosis of colorectal cancer patients

Tan Zhijun，Liu Yuying，Li Changsheng，Yang Caiyun.Department of General Surgery，People′s Hospital of Shouguang，Shouguang 262700，China

Tan Zhijun，Email: 13963668120@163.com

ObjectiveTo investigate the impact of EGFR expression on chemoresistance and prognosis of colorectal cancer.MethodsEGFR expression was analyzed by immunohistochemistry，CRC tumor tissues were collected from 37 patients of People?s Hospital of Shouguang.A complex score （0～9） was used to evaluated the EGFR immunohistochemical reactivity.Relationship among EGFR strong expression （score≥6），clinico-histological features and chemotherapy response rate were analyses.ResultsEGFR positive rates in high，middle，low differentiation CRC specimens and normal rectal tissues were 25%，56.25%，84.62% and 16.67%，respectively.EGFR positive rates in middle and low differentiation CRC specimens were significant higher than that in the high differentiation ones and normal rectal tissues （χ2=8.576，P=0.003）.EGFR was high expressed in 37 patient （67.57%）.Both CRC clinical stage （χ2=4.68，P=0.030） and chemotherapy response rate （χ2=7.27，P=0.007） showed significant correlation with EGFR expression.ConclusionsEGFR expression levels in CRC tumor tissues may be used to predict the chemoresistance of CRC.

Colorectal neoplasms；Prognosis；EGFR；Chemoresistance

2016-06-20）

（本文編輯：楊明）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.05.007

262700山東省壽光市人民醫(yī)院普外科

譚志軍，Email：13963668120@163.com

譚志軍，劉玉瑩，李昌生，等.表皮生長因子受體表達(dá)與結(jié)直腸癌患者化療耐藥及預(yù)后的關(guān)系［J/CD］.中華結(jié)直腸疾病電子雜志，2016，5（5）：405-409.