任　曼，呂照勇，史　凱，李倩倩，周可柔，吳修磊，李升和

(安徽科技學院　動物科學學院，安徽　鳳陽　233100)

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異亮氨酸對大鼠空腸形態(tài)和抗菌肽表達的影響

任曼，呂照勇，史凱，李倩倩，周可柔，吳修磊，李升和*

(安徽科技學院動物科學學院，安徽鳳陽233100)

目的：研究不同濃度的異亮氨酸對大鼠空腸形態(tài)和抗菌肽表達的影響；方法：選用40只健康斷奶SD大鼠，隨機分為四組，分別飼喂含有不同濃度異亮氨酸的飼糧(基礎日糧+0%、0.5%、1.0%或1.5%異亮氨酸)，試驗期為14 d。HE染色觀察空腸形態(tài)變化，通過熒光定量PCR測定空腸中抗菌肽的表達水平。結果：1)對照組大鼠空腸絨毛整齊，黏膜上皮界限清晰，隱窩較淺，0.5%和1.0%異亮氨酸組大鼠空腸絨毛較對照組排列整齊，絨毛較高，隱窩較淺；與0%、0.5%和1.0%異亮氨酸組相比，1.5%異亮氨酸組大鼠絨毛高度較低，隱窩深度增加。2)與對照組相比，0.5%、1.0%和1.5%異亮氨酸均在不同程度上顯著提高了空腸防御素rBD-1的表達，其中0.5%異亮氨酸組大鼠空腸防御素rBD-1表達增加了2.3倍，1.0%異亮氨酸組rBD-1表達量增加了13.1倍，1.5%異亮氨酸組rBD-1表達量增加了14.2倍。結論：添加異亮氨酸可顯著增加大鼠空腸防御素基因的表達，適量的異亮氨酸對空腸黏膜形態(tài)具有改善作用，過量異亮氨酸可能破壞空腸黏膜形態(tài)。

異亮氨酸；SD大鼠；空腸形態(tài)結構；抗菌肽

哺乳動物腸道兼具消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)和阻擋病原微生物入侵的雙重任務，其黏膜屏障功能情況直接影響機體健康[1]。腸道形態(tài)、黏液蛋白分泌、上皮滲透性等均可反映腸道黏膜的完整性，其中絨毛高度和隱窩深度是評價腸道黏膜完整性的常用指標[2]?？咕?antimicrobial peptide，AMP)是一種具有抗菌或抑菌作用的小分子多肽，哺乳動物內(nèi)源合成的AMP是先天性免疫系統(tǒng)的重要組分，它直接殺死病原微生物的同時還可通過TLRs(Toll-like Receptors，TLRs)調(diào)節(jié)免疫反應，上皮組織(包括皮膚、腸道、肺等)產(chǎn)生和分泌的AMP參與構成上皮黏膜免疫的第一道屏障[3]。研究發(fā)現(xiàn)，多種因素可影響和調(diào)控內(nèi)源AMP表達，包括發(fā)育階段、損傷、營養(yǎng)物質(zhì)(如維生素D、短鏈脂肪酸、氨基酸等)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等[4]。支鏈氨基酸(branched-chain amino acids，BCAA)除了作為蛋白質(zhì)合成的底物，還能夠在體外促進抗菌肽的表達，并且對免疫細胞的發(fā)育具有至關重要的作用[4]，但是有關于支鏈氨基酸在腸道免疫功能方面的研究較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)異亮氨酸可促進豬腸上皮表達抗菌肽[5]，但有關異亮氨酸的使用劑量和對腸道黏膜屏障的影響尚缺乏研究。本研究以大鼠為動物模型，研究異亮氨酸對空腸抗菌肽表達和腸道形態(tài)的影響，旨在為營養(yǎng)素調(diào)控內(nèi)源抗菌肽表達及腸道黏膜屏障功能的提高提供借鑒，也為異亮氨酸在動物人類營養(yǎng)調(diào)控中的應用提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗動物與設計

試驗選用清潔級健康斷奶SD雄性大鼠(SCYK(浙)20140001)40只，平均初始體重50.73 g，購買自浙江實驗動物中心。隨機分為4組，分別飼喂添加不同濃度異亮氨酸的日糧(0%、0.5%、1%、1.5%)，試驗期為14 d。試驗期間，大鼠自由采食和飲水，保證環(huán)境溫度和濕度控制在25±2℃和50±5%。

1.2試驗試劑

L-異亮氨酸(1001064222)，C6H13NO2，純度≥99%，生物試劑，購自美國Sigma公司，RNAzol?RT試劑盒(RN190)購自美國Molecular Research Center公司，PrimeScript RT Reagent Kit反轉錄試劑盒(RR037A)和SYBR Premix Ex Taq II熒光定量PCR試劑盒(RR820A)均購自大連TAKARA公司。

1.3試驗方法

試驗結束時乙醚麻醉，取大鼠空腸兩段，一段放入4%多聚甲醛溶液中固定，另一段放入液氮中冷凍。

1.3.1組織切片制作將固定24 h以上的組織修整后梯度酒精脫水，經(jīng)二甲苯至透明，石蠟包理2 h，修塊后切片(6 μm)，HE染色，中性樹膠封片，Olympns BX5+DP73顯微攝影系統(tǒng)顯微觀察并攝影。

1.3.2提取mRNA和反轉錄切取1～2cm空腸腸段在研缽中加入液氮研磨，取100 mgL組織用于提取總RNA，提取方法參照RNAzol?RT試劑盒說明。用核酸蛋白濃度測定儀(NanoDrop-2000，Thermo Scientific公司，美國)測定所提總RNA的質(zhì)量和濃度，當OD260nm/OD280nm在1.8～2.0和OD260nm/OD230nm在1.5～2.2時，說明RNA質(zhì)量較好，可用于下一步試驗。取1μg RNA加入到20 μL反轉體系中，按照反轉錄試劑盒說明將RNA反轉為cDNA。

1.3.3引物篩選根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的相關基因序列，使用Primer Premier 5.0生物軟件設計防御素和內(nèi)參基因引物，由生工生物有限公司合成。根據(jù)溫度梯度PCR篩選特異性高的引物序列。

1.3.4熒光定量PCR首先制備實時熒光定量PCR標準曲線，取普通PCR反應產(chǎn)物1 μL用滅菌超純水稀釋100倍后，再逐級稀釋至109倍，根據(jù)預實驗模版中的所測基因cDNA濃度，選擇8個連續(xù)的濃度梯度作為標準曲線模板與cDNA模板一起按照試劑盒說明進行實時熒光定量PCR擴增。擴增體系如下：Buffer 5 μL， SYBR Green II 0.2 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，無RNA酶超純水3 μL，空白對照組以相同體積超純水代替cDNA模板。

1.4數(shù)據(jù)分析

所有測定結果均以平均值和SEM表示，顯著性統(tǒng)計采用SAS 8.1軟件中單因素方差分析進行，差異顯著時用Duncan’s多重比較。當P<0.05為差異顯著。

2　結果與分析

2.1大鼠空腸組織形態(tài)結構變化

異亮氨酸對大鼠空腸組織形態(tài)結構的影響如圖1所示，可見對照組(0%異亮氨酸組)大鼠空腸絨毛整齊，黏膜上皮界限清晰，隱窩較淺；0.5%和1.0%異亮氨酸組大鼠空腸絨毛較對照組排列整齊，絨毛較高，隱窩較淺；與0%、0.5%和1.0%異亮氨酸組相比，1.5%異亮氨酸組大鼠絨毛高度較低，隱窩深度增加，說明適量異亮氨酸有益于腸道黏膜上皮的發(fā)育，而過量異亮氨酸對腸道黏膜上皮有一定的損傷作用。

圖1　異亮氨酸對SD大鼠空腸形態(tài)結構的影響(HE染色，200×)

2.2大鼠空腸防御素表達情況

表1　大鼠基因引物序列

內(nèi)參基因β-actin和大鼠防御素基因rBD-1的引物序列和產(chǎn)物片段如表1和圖2所示。熒光定量PCR結果如圖3所示，結果表明，與對照組相比，0.5%、1.0%和1.5%異亮氨酸均在不同程度上顯著提高了空腸防御素rBD-1的相對表達量，其中0.5%異亮氨酸組大鼠空腸防御素rBD-1表達增加了2.3倍，1.0%異亮氨酸組rBD-1表達量增加了13.1倍，1.5%異亮氨酸組rBD-1表達量增加了14.2倍。說明在飼糧中添加異亮氨酸可顯著促進大鼠空腸防御素rBD-1基因的表達。

圖2　大鼠內(nèi)參基因β-actin和防御素基因rBD-1引物擴增產(chǎn)物核酸電泳。

圖3　大鼠防御素rBD-1在空腸的相對表達量。

3　結論與討論

近年營養(yǎng)學與免疫學一致認為腸道不僅消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)，還是重要的免疫器官[6]。在正常生理狀態(tài)下，腸道免疫屏障功能將細菌和內(nèi)毒素等外源抗原與機體組織隔絕，在創(chuàng)傷、感染、應激等狀態(tài)下，腸道黏膜會發(fā)生損傷、腸道共生菌群失調(diào)、免疫功能異常等，進而破壞腸免疫屏障，促使腸道內(nèi)微生物和內(nèi)毒素的位移，導致全身性炎癥反應，影響幼年機體的生長發(fā)育。斷奶之后，小腸黏膜受到抗原的過度刺激，絨毛萎縮和隱窩增生，腸免疫系統(tǒng)被激活[7-8]。日糧營養(yǎng)物質(zhì)直接影響斷奶后的早期腸道免疫反應和腸功能紊亂[9]，王薇薇[10]發(fā)現(xiàn)蘇氨酸直接影響小腸粘液蛋白質(zhì)的合成和分泌、免疫球蛋白分泌及斷奶仔豬小腸粘膜屏障功能，張峰瑞[11]發(fā)現(xiàn)精氨酸合成底物N-氨甲酰谷氨酸可促進新生仔豬小腸中免疫球蛋白的合成，降低大腸桿菌的感染。岳隆耀[12]的蛋白質(zhì)組研究結果表明低氮日糧中補充支鏈氨基酸能夠提高斷奶仔豬空腸中免疫相關蛋白的表達，并降低熱應激蛋白60水平。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)適量異亮氨酸可提高腸道屏障功能，表現(xiàn)為改善腸道形態(tài)和促進抗菌肽的表達。氨基酸作為蛋白合成底物，適量范圍內(nèi)可改善動物健康，過量時不僅造成氨基酸間不平衡和拮抗，還具有毒性，直接損傷機體。研究發(fā)現(xiàn)，過量的賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸或色氨酸均可抑制肉仔雞和斷奶仔豬的生長性能[13]，周凡[14]報道賴氨酸和精氨酸間拮抗會降低淡水魚的生長性能，尚曉迪[15]研究表明異亮氨酸濃度超過1.49%時會抑制草魚的生長。但關于氨基酸過量對腸道黏膜功能影響的研究較為缺乏，仍需進一步的探索。

腸上皮表面的AMP在抵御微生物過程中扮演重要角色，這些“天然抗生素”屬于進化古老的先天性免疫效應因子[16]。其中，β防御素是目前研究最為深入和存在最為廣泛的AMP之一，它一方面可阻止上皮表面微生物的入侵，另一方面參與機體免疫調(diào)節(jié)[17]。內(nèi)源AMP的表達和活性受多種因素調(diào)控，如細菌和LPS、營養(yǎng)供給和一些功能性營養(yǎng)物質(zhì)等。近期研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸能夠促進不同的上皮細胞表達β防御素，F(xiàn)ehlbaum等[18]報道3.12-12.5 μg/mL異亮氨酸可顯著促進牛腎上皮細胞中β防御素的表達，但當濃度大于 ≥ 25 μg/mL時這種促進作用明顯降低。Konno等[19]報道細胞培養(yǎng)基中添加5-50 μg/mL的異亮氨酸可提高人結腸上皮細胞系Caco-2中人β防御素2的表達。本研究通過體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，日糧添加異亮氨酸可以促進腸上皮表達β防御素，此結果與前人體外研究一致，表明適宜濃度異亮氨酸可能通過調(diào)節(jié)腸道形態(tài)和AMP表達而改善腸道健康。過量氨基酸可能由于氨基酸拮抗和過量氨基酸毒性而損傷腸道形態(tài)結構，但是沒有影響AMP的表達。

以上結果說明，在飼糧添加異亮氨酸可顯著增加大鼠空腸防御素基因的表達，適量的異亮氨酸對空腸黏膜上皮形態(tài)具有改善作用，過量異亮氨酸可能破壞空腸黏膜上皮形態(tài)。

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(責任編輯：馬世堂)

Modulation of Isoleucine on Intestinal Morphology and Antimicrobial Peptide Expression in Rat Jejunum

REN Man,LV Zhao-young,SHI Kai,LI Qian-qian,ZHOU Ke-rou,WU Xiu-lei,LI Sheng-he*

(College of Animal Science ，Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Objective:To investigate the effect of isoleucine on intestinal morphology and antimicrobial peptide expresion in intestine.Methods: 40 healthy weaned SD rat were randomly divided into 4 groups (n=10) and the experimental diets were contained 0%, 0.5%, 1.0%, 1.5% isoleucine, respectively. After 14 days of experimental period, rat jejunum was collected to test intestinal morphology by HE staining to analyze expression of antimicrobial peptide by qRT-PCR. Results:The microstructure photography showed that rats of the control group (0% isoleucine) had orderly villus and thin crypt, the 0.5% and 1.0% isoleucine groups had higher villus and thinner crypt. Compared with 0%, 0.5% and 1.0% isoleucine groups, 1.5% isoleucine in diet decreased villous height and increased the crypt depth. Compared with the control group, isoleucine supplementation induced expression of rBD-1 in jejunum and the level of rBD-1 expression in 0.5%, 1.0% and 1.5% isoleucine groups was increased by 2.3, 13.1 and 14.2 times, respectively. Conclusion: isoleucine significantly induced epithelial defensin expression and properly concentration of isoleucine improved jejunum morphology, but high isoleucine concentration had harmful effect on jejunum morphology.

Isoleucine; SD rat; Jejunum morphology; Anti-microbial peptides

2016-01-13

安徽省高校自然科學研究項目(KJ2015A296)；安徽省自然科學基金(1608085QC72)；安徽科技學院自然科學基金(ZRC2014453)；安徽省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(AH201410879036，AH201410879037)；安徽科技學院第十二批校大學生創(chuàng)新科研基金(15XSZ01)。

任曼(1986-)，女，安徽省淮北市人，博士，助教，主要從事動物營養(yǎng)調(diào)控研究。*通訊作者：李升和，教授，E-mail:Lish@ahstu.edu.cn。

S816

A

1673-8772(2016)03-0006-05