黃麗英　陳夏

福建省腫瘤醫(yī)院乳腺外科，福州　350014

沒食子酸乙酯對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力及其作用機(jī)制研究

黃麗英陳夏#

福建省腫瘤醫(yī)院乳腺外科，福州350014

目的研究沒食子酸乙酯（EG）對(duì)高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株黏附、侵襲和遷移能力影響及其作用機(jī)制。方法觀察EG干預(yù)后高轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDA-MB-231與對(duì)照組相比黏附、侵襲、遷移能力的變化，采用SABC法和實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)EG對(duì)絲/蘇氨酸激酶（AKT-2）和eIF-4E的蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果加入EG干預(yù)的高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株的黏附、侵襲和遷移能力均低于對(duì)照組（P＜0.05）；EG組的AKT-2和eIF-4E蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)量均低于對(duì)照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論體外EG能降低MDA-MB-231的侵襲能力，可能與抑制癌細(xì)胞中原癌基因和延長(zhǎng)因子蛋白以及mRNA的表達(dá)有關(guān)。

沒食子酸乙酯；MDA-MB-231細(xì)胞；AKT-2；eIF-4E

Oncol Prog，2016，14（4）

由于乳腺在生理位置和解剖構(gòu)造上的特殊性，乳腺癌細(xì)胞易脫落，并伴隨血液和淋巴液轉(zhuǎn)移至全身各處，從而對(duì)患者生命造成威脅。2012年公布的數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已經(jīng)成為我國(guó)女性惡性腫瘤發(fā)病率之首，所以提出有效的乳腺癌治療方案是目前婦科臨床工作研究的重點(diǎn)［1-3］。沒食子酸乙酯（ethyl gallate，EG）是狼毒大戟（euphorbia fischeriana steud）的主要成分之一，多項(xiàng)研究表明其對(duì)多種腫瘤均具有抑制作用，在前期研究中，應(yīng)用了MTT法對(duì)3株具有不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)EG對(duì)高轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用最為顯著［4］。因此，本文通過EG對(duì)體外培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞株黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移三個(gè)方面的影響進(jìn)行研究，探討EG對(duì)乳腺癌治療的積極作用，從而為以后的繼續(xù)研究提供參考價(jià)值。

1　材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑

EG由福建省腫瘤醫(yī)院研究室自主提煉。高轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株購(gòu)自上海研域生物科技有限公司，基質(zhì)膜購(gòu)自美國(guó)BD公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司；實(shí)時(shí)PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol細(xì)胞提取液購(gòu)自美國(guó)TIANGEN公司，SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自上海瓦藍(lán)生物科技公司。引物序列由福建省生物技術(shù)研究所合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

將高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株離心后置入含10% FBS的高糖DMEN培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中按1∶3傳代培養(yǎng)。通過顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活性直至達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

1.3細(xì)胞與基質(zhì)膠黏附實(shí)驗(yàn)［5］

使用基質(zhì)膠和20 μg/ml纖維粘連蛋白將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板制成與人體細(xì)胞基質(zhì)類似的黏附實(shí)驗(yàn)板，將培養(yǎng)好的高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株消化離心成單細(xì)胞懸液并清洗完畢后，接種于裝有1 ml完全培養(yǎng)基的12孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。分成兩組，分別加入磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）1 m（l對(duì)照組）和含有5 μg/ml的EG溶液1 m（lEG組）后，兩組均加入含有5 μg/ml的DiI染色液1 ml。培養(yǎng)并染色完成后，分別加入細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)板中，1 h后置于鏡下觀察細(xì)胞黏附情況，計(jì)算黏附細(xì)胞平均值。

1.4細(xì)胞與基質(zhì)膜侵襲實(shí)驗(yàn)［6］和遷移實(shí)驗(yàn)

按照說明要求使用Transwell小室制作細(xì)胞侵襲基質(zhì)膜實(shí)驗(yàn)裝置，將培養(yǎng)好的MDA-MB-231消化離心成單細(xì)胞懸液并清洗完畢后，接種于裝有1 ml完全培養(yǎng)基的12孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞。分成兩組，分別加入PBS緩沖液1 m（l對(duì)照組）和含有5 μg/ml的EG溶液1 m（lEG組）后，分別放入實(shí)驗(yàn)裝置中，培養(yǎng)36 h。結(jié)束后，取出Transwell小室，擦去上室內(nèi)的細(xì)胞和聚碳酸酯膜上的基質(zhì)膠，使用結(jié)晶紫染液染色，并用33%CH3COOH溶解脫色，洗脫液在酶標(biāo)記儀OD值等于570 nm處測(cè)量，通過穿膜細(xì)胞數(shù)量反映MDA-MB-231的侵襲情況。

遷移實(shí)驗(yàn)原理與侵襲實(shí)驗(yàn)類似，可以重復(fù)利用侵襲實(shí)驗(yàn)中擦去基質(zhì)膠的聚碳酸酯膜，避免浪費(fèi)。

將在12孔板中培養(yǎng)好的高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞分成兩組，分別加入蒸餾水1 m（l對(duì)照組）和含有5 μg/ml的EG溶液1 m（lEG組），再加入一抗、二抗后滴加顯色劑觀察并記錄。

將在12孔板中培養(yǎng)好的高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞分成兩組，分別加入PBS緩沖液1 m（l對(duì)照組）和含有5 μg/ml的EG溶液1 m（lEG組），培養(yǎng)24 h后，使用Trizol細(xì)胞提取液提取RNA，離心后使用PCR法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，成像后鏡下觀察并記錄，引物序列參考崔紅霞等［5］的研究（表1）。

表1　引物及其序列和長(zhǎng)度

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞黏附數(shù)、測(cè)量值、AKT-2水平等計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1EG對(duì)細(xì)胞黏附能力的影響

MDA-MB-231進(jìn)行黏附1 h后，鏡下可以觀察到被DiI染色的細(xì)胞呈紅色，通過圖1可以看出，EG組細(xì)胞黏附數(shù)量明顯低于對(duì)照組。兩組細(xì)胞黏附計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞黏附數(shù)為（142.19± 4.48），高于EG組的（79.36±5.27），兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.024）。

圖1　兩組的細(xì)胞黏附情況（熒光探針DiI染色，×200）

2.2EG對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

在Transwell小室中培養(yǎng)36 h后，鏡下觀察被結(jié)晶紫染液染色的高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞和對(duì)比酶標(biāo)記儀OD值等于570 nm處的測(cè)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EG組細(xì)胞的侵襲能力明顯低于對(duì)照組（圖2）。兩組OD值等于570 nm處的測(cè)量結(jié)果顯示，對(duì)照組測(cè)量為（0.672±0.026），EG組測(cè)量為（0.309±0.057），兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。

2.3EG對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

圖2　兩組的細(xì)胞侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×200）

在Transwell小室中培養(yǎng)24 h后，對(duì)比酶標(biāo)記儀OD值等于570 nm處的測(cè)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和EG組的測(cè)量結(jié)果分別為（0.628±0.129）和（0.359± 0.213），說明EG組細(xì)胞的遷移能力低于對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041）。

鏡下觀察結(jié)果顯示，EG組兩種蛋白的表達(dá)明顯被抑制（圖3）。兩組蛋白表達(dá)量對(duì)比結(jié)果顯示，EG組AKT-2表達(dá)量為（0.394±0.152），低于對(duì)照組的（0.835±0.173），兩組對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.035）；EG組eIF-4E表達(dá)量為（0.296±0.148），低于對(duì)照組的（0.649±0.281），兩組對(duì)比差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018）。

鏡下觀察結(jié)果顯示，EG組的兩種mRNA表達(dá)明顯被抑制（圖4）。兩組mRNA表達(dá)結(jié)果對(duì)比顯示，EG組AKT-2表達(dá)量為（0.401±0.208），低于對(duì)照組的（0.928±0.914），兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）；EG組eIF-4E表達(dá)量為（0.328± 0.301），低于對(duì)照組的（0.736±0.197），兩組比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。

圖4　EG對(duì)AKT-2和eIF-4E的mRNA表達(dá)檢測(cè)

3　討論

目前，乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移仍是影響預(yù)后的重要原因，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的黏附、侵襲及遷移運(yùn)動(dòng)是轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官的關(guān)鍵性步驟。

通過多年來的探索，發(fā)現(xiàn)原癌基因（AKT-2）［7］和延長(zhǎng)因子（eIF-4E）［8］在乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中起到了重要的作用。AKT-2是AKT家族中唯一與乳腺癌有關(guān)的蛋白激酶，它可使乳腺癌細(xì)胞變大、細(xì)胞核增加。在細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，AKT-2可以通過表達(dá)使細(xì)胞與膠原蛋白的結(jié)合能力增加，從而加速細(xì)胞的黏附能力和侵襲能力，這說明AKT-2在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中可以聚合整合素β-1，所以AKT-2可以在臨床上對(duì)乳腺癌的轉(zhuǎn)移檢測(cè)起到重要的標(biāo)志作用。延長(zhǎng)因子是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種乳腺癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志分子，病變細(xì)胞中的表達(dá)比在正常乳腺細(xì)胞中高5～25倍，eIF-4E通過提高癌基因的特異性轉(zhuǎn)錄活性，達(dá)到改變細(xì)胞形狀，加速細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。eIF-4E可以聯(lián)合VEGF、cyclinD1和MMP-9共同促進(jìn)腫瘤血管的形成，為癌細(xì)胞的活力提供保證，幫助癌細(xì)胞降解基底膜從而侵入臨近血管和淋巴，加速轉(zhuǎn)移進(jìn)程，目前臨床已將eIF-4E作為乳腺癌復(fù)發(fā)的標(biāo)志。沒食子酸乙酯是在狼毒大戟中提取的有效成分，多項(xiàng)研究表明其體外可顯著對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲、運(yùn)動(dòng)和黏附能力進(jìn)行抑制，并能夠從多個(gè)環(huán)節(jié)抑制乳腺癌細(xì)胞的體外侵襲能力［9］。

本研究中，通過觀察體外培養(yǎng)的高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞對(duì)Matrigel基底膜的黏附，Transwell小室中癌細(xì)胞的侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)，研究EG對(duì)細(xì)胞黏附能力、遷移能力、侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過EG干預(yù)的癌細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)能力下降，這說明在體外使用EG可以有效地影響乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，由于AKT-2和eIF-4E在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中具有重要作用，通過分析又得出，在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)EG可以降低以上兩種因子的表達(dá)，說明EG在體外可以抑制MDAMB-231的轉(zhuǎn)移，這與EG可以降低細(xì)胞中AKT-2和eIF-4E的蛋白和mRNA表達(dá)有關(guān)，但是否還有其他影響因素還需進(jìn)一步研究觀察。吳玉等［10］研究結(jié)果中顯示，EG還可降低MDA-MB-231細(xì)胞中MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA水平，因而抑制了細(xì)胞外基質(zhì)降解，并阻止了腫瘤細(xì)胞侵襲。

綜上所述，體外EG能降低MDA-MB-231的侵襲能力，這可能與抑制癌細(xì)胞中原癌基因和延長(zhǎng)因子蛋白以及mRNA的表達(dá)有關(guān)。另外，本研究?jī)?nèi)容方面可能較局限，還需在今后的研究中開展多方面研究，以進(jìn)一步擴(kuò)大研究?jī)?nèi)容，提高研究結(jié)果的科學(xué)性。

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The effect of ethyl gallate on the invasion ability of human breast cancer MDAMB-231 cells and the underlying mechanism of action

HUANG Li-ying CHEN Xia#
Department of Breast Surgery，F(xiàn)ujian Provincial Tumor Hospital，F(xiàn)uzhou 350014，China

ObjectiveTostudytheeffectofethylgallate（EG）ontheadhesion，invasionandmigrationabilityofinhighly metastatic breast cancer cell line.MethodThe changes of adhesion，invasion and migration ability of MDA-MB-231 after EG treatment were observed，while SABC and real-time PCR were applied to detect the effect of EG on protein and mRNA expression of serine/threonine kinase（ATK-2）and eIF-4E.ResultThe adhesion，invasion and migration ability of highly metastatic breast cancer cell line with EG treatment was weaker than that without EG（P＜0.05），besides，the protein and mRNAexpression of AKT-2 and eIF-4E in EG group was lower than that in control group，with significant difference observed（P＜0.05）.ConclusionIn vitro EG treatment reduces the invasion ability of the MDA-MB-231 cancer gene，which may be related to the inhibited expression of proto-oncogene，elongation factor and mRNA.

EG；MDA-MB-231；AKT-2；eIF-4E

R737.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.24

2015-08-05）

（corresponding author），郵箱：chenxia61@sina.com