劉建成　張興華　袁偉　王曉童　馬潔#北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學國家重點實驗室，北京　000首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院消化科，北京　00050

IL-17A和G-CSF在炎癥相關結腸癌中的作用△

劉建成1張興華2袁偉1王曉童1馬潔1#
1北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學國家重點實驗室，北京1000212首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院消化科，北京100050

目的探索在小鼠結腸炎相關結腸癌（CAC）發(fā)展過程中IL-17A和G-CSF的調控關系。方法采用氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉聯(lián)合誘導建立CAC動物模型，得到了從結腸炎發(fā)展到結腸癌三個階段的小鼠模型（分別為AD1、AD2、AD3），免疫組化檢測各階段小鼠結直腸部位IL-17A和G-CSF表達；重組小鼠IL-17A體外刺激流式分選得到的結直腸上皮細胞，實時PCR和ELISA方法檢測G-CSF基因轉錄和蛋白表達水平。結果CAC模型經(jīng)歷了從隱窩病灶—腺瘤—腺癌疾病發(fā)展過程，與人CAC病程相似。免疫組化結果顯示，IL-17A和G-CSF在CAC小鼠結直腸部位的表達均高于健康對照組；IL-17A作用于小鼠結直腸上皮細胞，G-CSF在處理組轉錄（10.34±0.8）ng/m l和蛋白表達水平（3.5±0.24）ng/m l的表達均高于對照組轉錄（0.94±0.04）ng/m l和蛋白水平（0.05±0.008）ng/m l的表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。結論隨著小鼠CAC的發(fā)展，IL-17A和G-CSF在結直腸組織中均上調表達，且體外實驗證實IL-17A促進了結直腸上皮細胞G-CSF表達。

結腸炎相關結腸癌；IL-17A；G-CSF

Oncol Prog，2016，14（4）

結腸炎相關結腸癌（colitis-associated cancer，CAC）與炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）密切相關，如克羅恩病和潰瘍性結腸炎，是IBD死亡的主要原因，IBD患者發(fā)展成為結直腸癌的風險是普通人的6倍［1］。由于CAC的發(fā)病原因復雜，調控機制尚不清楚，因此有必要對其發(fā)病機制進行研究。IBD患者的結直腸組織在經(jīng)歷了長達數(shù)十年的周期性黏膜潰瘍、壞死、修復等病理過程后發(fā)展成為結直腸癌。在CAC發(fā)展過程中許多細胞因子參與炎癥反應，具有代表性的炎癥性細胞因子有IL-17A［2］，以及參與調控炎癥細胞增殖和分化的G-CSF［3］。這兩個炎癥因子在CAC發(fā)展過程中是否有一定的調控關系，通過什么類型細胞發(fā)揮調控作用已成為研究熱點。本研究通過誘導能模擬人CAC發(fā)展的AOM/DSS動物模型，以揭示IL-17A與G-CSF的調控關系，為CAC的免疫干預治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）購自美國Sigma公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）購自美國MP生物醫(yī)藥公司。重組小鼠IL-17A和EGF細胞因子購自美國PeproTech；小鼠G-CSF ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司；G-CSF山羊抗小鼠多抗和IL-17A山羊抗小鼠多抗購自美國Santa Cruz公司；過氧化物封閉液、一抗稀釋液、山羊超敏二步法檢測試劑盒、哈瑞蘇木素染液、中性快干膠、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（3%H2O2）、DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自美國Am resco公司；抗小鼠CD324（E-cadherin）A lexa Fluor?488和抗小鼠CD45 APC購自于美國eBioscience公司；Triozl購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒和SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；70 μm細胞濾網(wǎng)和Matrigel Basement Membrane Matrix購自美國BD公司；膠原酶XI和DNaseI均購自瑞士Roche公司。

無特定病原體級（specific pathogen free，SPF）雌性C57BL/6小鼠，7～9周齡，體質量19～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證編號：SCXK（京）2014-0004，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院SPF級動物房。

1.2實驗儀器

采用BD流式細胞分選儀、Eppendorf熒光定量PCR儀、nanodrop 2000紫外分光光度儀、三洋CO2培養(yǎng)箱、美國寶特（Bio-Tek）ELx-800自動酶標儀、LEICA倒置顯微鏡進行實驗。

1.3實驗方法

1.3.1誘導小鼠CAC動物模型［2］將7～9周齡，體質量為19～20 g的雌性C57BL/6小鼠隨機分成健康對照組和給藥組，健康對照組不做任何處理（n=5），給藥組小鼠第一天腹腔注射致癌劑AOM（12.5 mg/kg），休息10 d，給予第一次喂食含致炎劑DSS（2.5%）的飲用水5 d，該階段誘導結束后命名為AD1（n=5）；休息14 d，第二次飼喂含致炎劑DSS（2.5%）的飲用水5 d，該階段誘導結束后小鼠命名為AD2（n=5）；休息14 d，第三次飼喂含致炎劑（DSS）（2.5%）的飲用水5 d，該階段誘導結束后命名為AD3（n=5）。

1.3.2免疫組化10%甲醛固定組織，常規(guī)石蠟包埋，組織蠟塊進行4 μm厚的連續(xù)切片，用二甲苯、梯度濃度酒精脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液抗原修復，冷卻至室溫，3%H2O2室溫孵育30 m in，PBS沖洗，3%BSA封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，PBS沖洗，二抗孵育30 m in，PBS沖洗；DAB顯色，蘇木素染核，酒精鹽酸分色，氨水返藍，脫水，透明，封片。每組選取5只小鼠結直腸組織玻片進行免疫組化染色，每張免疫組化片子隨機取4個視野進行觀察。

1.3.3小鼠結直腸上皮細胞的分離和培養(yǎng)用預冷的PBS將小鼠結直腸組織清洗干凈，放入4 m l離心管中，加入2 m l含5%牛血清的PBS，用手術剪刀將組織剪成糜狀，轉入50 m l燒杯，加入10 m l DMEM培養(yǎng)基，膠原酶XI終濃度為100 U/m l，DN-aseI終濃度為0.22 mg/m l，37℃低速攪拌30 min，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，去除雜物，再用細胞篩（70 μm濾膜）過濾細胞，獲得結直腸單細胞懸液，將細胞數(shù)調整至1×107m l，加1 μl CD45流式抗體，4℃避光孵育30 m in，PBS洗掉未結合流式抗體，用流式細胞術分選CD45-細胞。

用DMEM培養(yǎng)基重懸CD45-細胞，接種于含2%Matrigel的6孔板中，加入10 ng/m l的EGF，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后，流式細胞術檢測上皮細胞的E-cadherin陽性率，取5×105個上皮細胞轉入六孔板，加入重組小鼠IL-17A（終濃度100 ng/m l）細胞因子，培養(yǎng)24 h，收取培養(yǎng)上清和細胞。

1.3.4實時PCR檢測按照TRIzol試劑說明書提取細胞總的mRNA，nanodrop 2000紫外分光光度儀測核酸濃度，逆轉錄制備cDNA，1 μg mRNA、1 μl Oligo dT、1 μl AMV逆轉錄酶、RNase Free dH2O補足20 μl。反應條件：37℃、15 min（反轉錄反應），85℃、5 （s反轉錄酶的失活反應），4℃、10 m in。實時PCR引物及其序列見下：

20μl實時PCR體系SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μl、PCR Forward Primer（10 μm）0.4 μl、PCR Reverse Primer（10 μm）各0.4 μl、cDNA溶液2 μl、補足20 μl反應體系。反應條件，第一步預示變性95℃、30 s，第二步95℃、5 s，第三步退火60℃、30 s，第二步至第三步循環(huán)40次。

1.3.5ELISA檢測按照R&D公司小鼠G-CSF ELISA檢測試劑盒方法，96孔板每孔加入50 μl捕獲抗體，4℃過夜。棄去孔板液體，每孔加入50 μl G-CSF標準品、陰性對照和待測樣品，室溫孵育2 h；棄去孔中液體，用PBST洗板。每孔加入100 μl抗小鼠G-CSF二抗，室溫孵育2 h，PBST洗板。每孔加入100 μ DAB顯色液，避光孵育30 m in，加50 μl終止液，酶標儀450 nm波長檢測吸收值。

1.4實驗所用軟件

Flow Jo 7.6軟件分析流式細胞術結果，Graph-Pad Prism 5.0制作圖表，SPSS 19軟件分析統(tǒng)計結果，以均數(shù)±標準差（±s）表示計量資料數(shù)據(jù)，計量資料數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　實驗結果

2.1小鼠CAC動物模型的建立

觀察結果顯示，小鼠飲用第一輪DSS水后，出現(xiàn)精神不振、怠倦、體質量減輕、腹瀉和便血癥狀。飼喂普通水后，小鼠大便、精神狀態(tài)和體質量逐步恢復正常。第二、三循環(huán)期內(nèi)，小鼠表現(xiàn)與第一循環(huán)期相似。在AD小鼠誘導結束后，解剖小鼠結直腸，可觀察到3組AD小鼠結直腸內(nèi)多有血便和血便黏附，糞便惡臭，并且結直腸長度較健康組短，腸壁增厚，AD3有肉眼可見腺瘤。

結直腸HE病理結果顯示，AD1小鼠結直腸有大量淋巴細胞浸潤，表明誘導初期有炎性腸病癥狀，AD2小鼠結直腸有大量的不典型增生和腺瘤病變組織，AD3小鼠結直腸部位有原位癌。

綜合觀察和結直腸病理結果分析，小鼠CAC發(fā)展過程經(jīng)歷由正常隱窩變?yōu)楫惓ｋ[窩，異常隱窩增殖形成微腺瘤，逐漸形成腺瘤、腺癌，與人的CAC發(fā)展病程相似。

2.2IL-17A在CAC發(fā)展過程中的表達

免疫組化檢測結果顯示，IL-17A在AD1、AD2、AD3小鼠結直腸中的表達均高于健康對照組（n=5）。IL-17A在健康小鼠結腸組織中幾乎檢測不到，在AD1組小鼠結直腸腸道黏膜有少量IL-17A表達，在AD2和AD3組小鼠結直腸黏膜和固有層均有IL-17A表達，但AD3組表達較AD2組IL-17A降低。（圖1）

2.3G-CSF在CAC發(fā)展過程中的表達

免疫組化檢測結果顯示，與健康對照組相比，AD1、AD2、AD3小鼠結直腸中G-CSF表達上調。G-CSF在健康小鼠組幾乎檢測不到，在AD1和AD2小鼠結直腸組織主要表達在腸黏膜和固有層，G-CSF在AD3小鼠結直腸組織中主要表達在腸道固有層。與IL-17A表達類似，AD3組較AD2組的G-CSF表達也呈現(xiàn)降低趨勢。（圖2）

圖1　對照組和CAC組小鼠結直腸IL-17A表達典型結果（免疫組化法，10×40）

圖2　對照組和CAC組結直腸組織G-CSF表達典型結果（免疫組化法，10×40）

圖3　小鼠結直腸上皮細胞的富集

2.4IL-17A對結直腸上皮細胞G-CSF表達的影響

先利用流式細胞術分選獲得結直腸CD45-（95.9%）細胞，然后將分選的細胞用上皮細胞原代培養(yǎng)的方法進行富集，培養(yǎng)6 d，流式細胞術分析結直腸上皮細胞的純度，結果顯示，約99%的細胞為E-cadherin+上皮細胞。（圖3）

將上皮細胞轉到6孔板，IL-17A刺激24 h，檢測結直腸上皮細胞G-CSF轉錄水平和培養(yǎng)上清液中的G-CSF表達水平，結果顯示，IL-17A處理組G-CSF轉錄水平［（10.34±0.8）ng/m l，n=3］和蛋白水平［（3.5± 0.24）ng/m l，n=3］的表達均高于對照組轉錄水平［（0.94±0.04）ng/m l，n=3］和蛋白水平［（0.05±0.008）ng/m l，n=3］的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。（圖4）

圖4　IL-17A刺激后小鼠結直腸上皮細胞的G-CSF表達

3　討論

近些年越來越多研究表明，炎癥與腫瘤的關系密切。慢性炎癥持續(xù)存在時，炎性細胞產(chǎn)生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮中間體（reactive nitrogen intermediates，RN），可引起DNA損傷和基因組不穩(wěn)定，介導致癌效應，如幽門螺旋桿菌感染的慢性胃炎與胃癌，乙肝病毒感染的慢性肝炎與肝癌，以及IBD與結直腸癌等［4］。而CAC是IBD最嚴重的并發(fā)癥，IBD患者在10年、20年、30年發(fā)展為CAC的概率分別為2%、8%、18%［5］。雖然炎癥是導致腫瘤的一個明確危險因素，但IBD向CAC發(fā)展過程中的調控機制尚不明確。炎癥發(fā)生的機制是炎癥組織內(nèi)微血管的舒張，血細胞的滲入和大量炎性細胞因子的釋放［6］。炎性細胞因子IL-17A和G-CSF在介導炎性調控和腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。

IL-17A主要是由Th17細胞分泌的一種較強的炎癥性細胞因子，具有募集中性粒細胞和促進多種細胞進一步釋放炎性細胞因子的作用，可通過誘導IL-6、TNF-α、MMP參與炎癥反應，在自身免疫性疾?。愶L濕性關節(jié)炎、硬化癥）和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

IL-17A通過作用于腫瘤成纖維細胞和腫瘤基質細胞，誘導血管內(nèi)皮生長因子在內(nèi)的大量促血管生長因子的產(chǎn)生，大大促進了炎癥和腫瘤血管的生成。現(xiàn)在普遍觀點認為，IL-17A可以誘導腫瘤微環(huán)境的形成，促進血管生成和腫瘤的遷移，加速腫瘤的生長［7］。IL-17A能上調結直腸癌細胞系EGFR的表達，促進結直腸癌的惡性發(fā)展［8］。近期有研究報道在誘導IL-17A基因敲除小鼠CAC模型中，結直腸上皮增生減慢，腫瘤減少，CAC的發(fā)展受到抑制［9］。本研究結果顯示，IL-17A在健康小鼠結腸組織中難以檢測到，但隨著CAC的發(fā)展，IL-17A在結直腸組織中表達上調，但AD3組較AD2組IL-17A表達降低，說明IL-17A在CAC發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，且主要作用于早期階段。

G-CSF是造血因子家族的一員，在促進中性粒細胞的增殖和分化、動員骨髓細胞向外周和組織遷移、維持免疫微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF在多種腫瘤中表達上調，促進腫瘤的增殖和轉移。體外實驗表明，結直腸癌和胃癌細胞的增殖能力對G-CSF的處理具有濃度和時間依賴性［10］。G-CSF可通過STAT3信號通路促進腦膠質瘤細胞的生長、轉移和侵襲［11］。肺癌高表達腫瘤相關的G-CSF與腫瘤的淋巴侵襲轉移和不良預后有關［12］。本實驗前期研究結果證實，G-CSF在CAC發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，結直腸組織的G-CSF通過募集MDSC，介導小鼠CAC的發(fā)展，抗G-CSF治療能干預CAC的發(fā)展［13］。本研究結果顯示，G-CSF和IL-17A在健康小鼠結直腸組織低表達，隨著CAC的發(fā)展，G-CSF和IL-17A均表達上調，在AD2階段達峰值。AD3階段較AD2階段炎癥程度下降，可觀察到IL-17A及G-CSF表達的下調。由于腸道炎癥微環(huán)境復雜，細胞因子變化機制還有待進一步研究。

有研究報道IL-17A能促進肺臟上皮細胞GCSF的表達［14］，本實驗室前期實驗證實，結直腸上皮細胞表達G-CSF［15］，推測IL-17A可能作用于結直腸上皮細胞，調控G-CSF的表達。本研究亦發(fā)現(xiàn)IL-17A和G-CSF在CAC發(fā)展過程中表達變化趨勢一致，但IL-17A與G-CSF的表達是否有一定的調控關系？為了驗證該設想，本實驗利用重組小鼠IL-17A處理結直腸上皮細胞，從轉錄水平和蛋白水平均檢測到G-CSF在IL-17A處理組表達上調，證實IL-17A促進了結直腸上皮細胞G-CSF的表達。但是，IL-17家族的其他成員如IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F是否影響G-CSF的表達及作用機制，結直腸組織中其他類型細胞的GCSF表達是否也受IL-17家族影響，需要進一步深入研究。

綜上所述，本研究通過建立CAC動物模型，模擬人CAC的發(fā)展過程，不僅檢測到IL-17A和GCSF在CAC發(fā)展過程中協(xié)同上調表達，而且證明了IL-17A可通過作用于結直腸上皮細胞促進GCSF表達。

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The association between IL-17A and G-CSF in murine colitis-associated cancer△

LIU Jian-cheng1ZHANG Xing-hua2YUAN Wei1WANG Xiao-tong1MA Jie1#
1State Key Laboratory of Molecular Oncology，Cancer Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100021，China
2Department of Gastroenterology，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing l00050，China

Objective To investigate the correlation between IL-17A and G-CSF during the development of colitis-associated cancer（CAC）.Method A murine colitis-associated colon cancer（CAC）model was established using azoxymethane（AOM）and dextran sulfate sodium（DSS）.The three stages from colitis to colon cancer were named as ADl，AD2 and AD3，respectively.The expression of IL-17A and G-CSF in rectum were detected by immunohistochem istry.Recombinant mouse IL-17A was used to stimulate the colorectal epithelial cells sorted by flow cytometry.The transcription and protein expression level of G-CSF were detected by Real-time PCR and ELISA.Result The CAC mouse model underwent a normal development process of mucosa—dysplasia—adenoma—carcinoma，which was sim ilar to the development of human CAC.Immunohistochem istry results indicated that the expression of IL-17A and G-CSF in CAC model was higher than that in normal m ice.A fter IL-17A stimulation，the level of IL-17A and G-CSF were up-regulated in epithelial cells compared w ith control［（10.34±0.8）ng/m l vs（0.94±0.04）ng/m l］and［（3.5±0.24）ng/m l vs（0.05±0.008）ng/m l］，P＜0.001，respectively.These findings were statistically significant.Conclusion IL-17A and G-CSF are up-regulated in colorectal tissue as the murine CAC develops，and it is demonstrated that IL-17A promotes the expression of G-CSF in colorectal epithelial cells.

colitis-associated cancer；IL-17A；G-CSF

R735.3

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.08

2016-03-04）

國家自然科學基金（81541154）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2014CB542103）；科技北京百名領軍人才培養(yǎng)工程（Z131107000513001）；北京市科技新星計劃（Z131107000413066）

（corresponding author），郵箱：majie1965@163.com