周亞敏,　吳魯艷,　白　雪,　何　飛,　石　剛,　倪才華

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,食品膠體與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫 214122)

?

pH和還原雙重敏感性超支化納米膠束的制備及其釋藥性能

周亞敏,吳魯艷,白雪,何飛,石剛,倪才華

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,食品膠體與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫 214122)

將聚乙二醇二縮水甘油醚(PEGDGE)與胱胺(Cys)置于水溶液中,通過親核開環(huán)反應(yīng)制備出超支化聚合物,并自組裝形成多核-殼結(jié)構(gòu)的納米膠束,再通過甲氨蝶呤(MTX)與納米膠束間的疏水作用制備出載藥膠束。用FT-IR、1H-NMR、DLS、SEM等方法對(duì)聚合物結(jié)構(gòu)和膠束粒徑與形貌進(jìn)行表征,采用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)試納米膠束和載藥膠束的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明:聚合物經(jīng)過透析純化后自組裝形成納米膠束,其粒徑約為100 nm,呈均一球形;載藥膠束對(duì)MTX的載藥率為10.32%; 當(dāng)載藥膠束處于模擬腫瘤環(huán)境中時(shí),酸性和還原性條件可刺激藥物釋放。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,納米膠束具有優(yōu)良的生物相容性; 載藥膠束具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

超支化納米膠束; 還原敏感性; pH敏感性; 甲氨蝶呤

納米藥物載體可以通過腫瘤組織的高滲透和滯留(EPR)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)藥物對(duì)腫瘤組織的的被動(dòng)靶向性[1-3],從而大大提高藥物利用率并降低毒副作用。其中聚合物納米膠束[4]作為藥物載體具有增溶疏水性藥物、提高藥物穩(wěn)定性、緩釋藥物等優(yōu)勢(shì)。超支化聚合物[5-7]具有新穎的結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的性能,如高溶解性、低黏度、內(nèi)部具有空腔三維球形結(jié)構(gòu)等,結(jié)構(gòu)中存在的大量空腔可以在疏水載藥的過程中提高藥物的載藥量。

為了使藥物在腫瘤組織處靶向釋放,目前研究較多的是具有環(huán)境智能響應(yīng)性(如pH[8]、還原電勢(shì)[9]、酶等)的生物可降解載體。例如黃衛(wèi)等[10]制備了一種由疏水性二硫鍵和親水性磷酸酯鏈段交替分布于分子骨架中而形成的多核-殼結(jié)構(gòu)的超支化納米膠束,二硫鍵在10 mmol/L 谷胱甘肽(GSH)還原性條件下快速斷裂,膠束結(jié)構(gòu)遭到破壞從而實(shí)現(xiàn)藥物的靶向釋放。申有青等[11]合成了一種水溶性酸刺激可降解的聚酯類超支化聚合物,聚合物與藥物甲氨蝶呤(MTX)形成的鍵合物在水中呈單分子膠束,在酸性環(huán)境中被降解為無毒性的小分子并釋放出藥物。然而,這些合成方法通常需要多步完成,且需要用到大量有機(jī)溶劑。

本文提出一種簡(jiǎn)單綠色制備超支化納米膠束藥物載體的方法。利用親水性的聚乙二醇二縮水甘油醚(PEGDGE)與含二硫鍵的胱胺(Cys)發(fā)生親核開環(huán)反應(yīng),制備出具有pH和還原雙重敏感性的超支化納米膠束。由于納米膠束結(jié)構(gòu)中存在大量的伯、仲、叔氨基團(tuán),使該納米膠束具有很強(qiáng)的質(zhì)子海綿效應(yīng)[12],被溶酶體吞入后大量吸附質(zhì)子氫,引起Cl-和水分子內(nèi)流,導(dǎo)致溶酶體滲透性腫脹并最終破裂,載藥膠束進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi),因此制備過程不需要使用有機(jī)溶劑。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑和儀器

胱胺二鹽酸鹽(Cys·2HCl,w=0.98)、MTX(w=0.98):阿拉丁試劑有限公司; PEGDGE(w=0.98,Mn=352):廣州奧寶化工科技有限公司; 其他試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

采用美國Thermo Fisher Scientific公司Nicolet 6700型全反射傅里葉紅外光譜儀測(cè)定冷凍干燥后聚合物的紅外譜圖; 采用瑞士Bruker BioSpin公司AVANCE Ⅲ HD 400 MHz型核磁共振譜儀測(cè)定聚合物的1H-NMR; 采用德國HOSIC LIMITED公司ALV/DLS/SLS-5022F型激光光散射儀測(cè)定納米膠束在水溶液中的粒徑(D)及其分布(PDI),測(cè)試溫度為25 ℃; 采用美國布魯克海文公司ZetaPALS型Zeta電位及納米粒度分析儀測(cè)試納米膠束的ζ電位(pH=5.0,測(cè)試溫度為25 ℃); 采用日本東曹株式會(huì)社HLC-8320型凝膠滲透色譜儀測(cè)定納米膠束的分子量(流動(dòng)相:H2O,標(biāo)樣:聚乙二醇,測(cè)試溫度為25 ℃); 采用美國瓦里安有限公司Cary Esclipse型熒光分光光度計(jì)測(cè)定臨界膠束濃度(CMC),用芘作熒光探針; 采用日本日立株式會(huì)社S-4800(HR)型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡測(cè)定干燥狀態(tài)下納米膠束的形貌及粒徑; 采用上海盛磁儀器有限公司PHS-3C型精密pH計(jì)測(cè)定納米膠束的酸堿滴定曲線; 采用北京普析通用儀器有限責(zé)任公司TU-1950 紫外分光光度計(jì)測(cè)定納米膠束和載藥膠束溶液的吸光度。

1.2胱胺二鹽酸鹽的中和

參照文獻(xiàn)[13]的方法,稱取12.15 g粉末狀Cys·2HCl溶于16 mL去離子水,再加入60 mL乙醚和24 mL四氫呋喃,攪拌均勻。冰浴下將w=40% 的NaOH溶液(66.7 mL)逐滴滴入上述混合液中,磁力攪拌1 h后萃取分離,取上層有機(jī)相。再用50 mL乙醚及18 mL四氫呋喃的混合溶劑萃取下層水相。合并有機(jī)相,稱取4 g NaOH干燥2 h,過濾后真空旋蒸除去易揮發(fā)的乙醚和四氫呋喃,最終得到6.2 g無色油狀胱胺,產(chǎn)率為75.5%。

1.3超支化納米膠束的制備

將616 mg Cys溶入8 mL超純水中,磁力攪拌使其完全溶解,向其中滴加PEGDGE(2.873 g)的水溶液(8 mL),在60 ℃下磁力攪拌反應(yīng)24 h。將產(chǎn)物溶液倒入透析袋(截留分子量為3 500)中,在超純水中透析3 d,每隔4 h換一次透析液,在透析的過程中形成超支化納米膠束,記為CP12。通過調(diào)節(jié)Cys與PEGDGE的物質(zhì)的量之比,可以制得一系列的超支化納米膠束,如表1所示,再經(jīng)冷凍干燥可得到相應(yīng)固態(tài)超支化聚合物CP。

1.4載藥膠束的制備

取0.5 mg/mL超支化納米膠束溶液20 mL,向其中添加0.1 mg/mL的MTX溶液10 mL,室溫下避光磁力攪拌24 h后轉(zhuǎn)入透析袋(截留分子量為3 500)中透析24 h,每隔3 h換一次透析液,將載藥膠束用0.45 μm微孔濾膜避光過濾,所得載藥膠束為淡黃色,記為CP-MTX。

1.5酸堿滴定曲線的繪制

取10 mg/mL超支化納米膠束溶液5 mL,向其中緩慢滴加1.0 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0,接著用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定,繪制滴定曲線。

1.6藥物釋放實(shí)驗(yàn)

取4份5 mL透析后的載藥膠束裝入透析袋(截留分子量為3 500)內(nèi),分別置于50 mL不同 pH(7.4和5.0)含10 mmol/L(或無)GSH的醋酸鹽緩沖溶液中,在(37±0.5) ℃的恒溫震蕩器中回旋震蕩,每隔一段時(shí)間取3 mL樣品測(cè)試吸光度(A388),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算釋放液中MTX的質(zhì)量濃度,同時(shí)補(bǔ)充相同體積的新鮮介質(zhì)以維持緩沖溶液體積不變。

1.7體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用噻唑藍(lán)(MTT)法分別檢測(cè)納米膠束和載藥膠束對(duì)3T3和Hela細(xì)胞的毒性,實(shí)驗(yàn)步驟如下:用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基將3T3細(xì)胞和Hela細(xì)胞分別種植于96孔板上(104cells/mL),37 ℃下培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,向孔中加入100 μL不同質(zhì)量濃度的納米膠束和載藥膠束,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入20 μL MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄去培養(yǎng)板中的溶液,每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO),搖勻,用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定光學(xué)密度值(OD),并計(jì)算細(xì)胞存活率。

2　結(jié)果與討論

2.1納米膠束的制備

Cys中的雙端氨基與PEGDGE中的雙端環(huán)氧基容易發(fā)生親核開環(huán)反應(yīng)[13],聚合形成具有三維立體空腔結(jié)構(gòu)的兩親性超支化聚合物,其中疏水的二硫鍵具有還原敏感性,使其可以實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的靶向釋放,而親水的PEG部分則具有優(yōu)良的生物相容性。納米膠束骨干柔韌性極好,在相分離階段可以輕易地容納構(gòu)象改變。因此,在選擇性溶劑中,分子內(nèi)和分子間可以很快發(fā)生微相分離,進(jìn)而形成多核-殼膠束結(jié)構(gòu)[10]。納米膠束在溶酶體pH(pH≈5.0)下顯正電性,通過與負(fù)電性細(xì)胞膜間的靜電相互作用使其具備輕松通過細(xì)胞膜的能力,從而使其進(jìn)入癌細(xì)胞的傾向大大提高。其具體配方如表1所示。

表1　超支化納米膠束的配方及其性質(zhì)

2.2超支化聚合物的結(jié)構(gòu)表征

圖1為各超支化聚合物的紅外光譜圖。Cys的端氨基與PEGDGE的環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生氨基開環(huán)反應(yīng)后,在3 386 cm-1處為生成的羥基的伸縮振動(dòng)峰,可能是因?yàn)樯傻牧u基與端氨基形成了氫鍵,因而此處峰型較寬。聚合物端—NH2在3 500～3 250 cm-1處本應(yīng)有2個(gè)吸收峰,但被—OH峰覆蓋住,故紅外譜圖上看不出此處—NH2的峰。在1 636 cm-1處為聚合物端—NH2的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰; 在1 093 cm-1處為脂肪族醚鍵的強(qiáng)伸縮振動(dòng)峰。以上3個(gè)主要吸收峰說明反應(yīng)物Cys和PEGDGE發(fā)生了氨基環(huán)氧開環(huán)反應(yīng)。

圖2為超支化聚合物CP12的核磁共振氫譜圖。通過圖2可知,胱胺亞甲基(-SS-CH2-CH2-)以及PEG中亞甲基(-O-CH2-)的特征質(zhì)子峰分別在2.82和3.50處出現(xiàn)[14],證明超支化聚合物合成成功。

2.3納米膠束的粒徑形貌分析

圖3為納米膠束的掃描電鏡圖?？梢钥闯?膠束CP12具有粒徑小(約100 nm)、分布窄以及形貌規(guī)整均一的特點(diǎn)。隨著Cys投料比的增加,粒徑整體呈逐漸增大的趨勢(shì)。

圖1　超支化聚合物的紅外光譜圖

2.4納米膠束的還原敏感性分析

圖4反映了CP12納米膠束在10 mmol/L GSH水溶液中孵育不同時(shí)間后的粒徑變化情況。如圖4所示,隨著時(shí)間的推延,粒子的粒徑不斷減小。這是因?yàn)镚SH分子中所含的巰基(—SH)具有較強(qiáng)的還原性,—SH能夠與聚合物骨架中的二硫鍵(S—S)發(fā)生交換反應(yīng),使得聚合物的二硫鍵斷裂,破壞納米膠束結(jié)構(gòu)。

2.5納米膠束的pH敏感性分析

圖5為納米膠束溶液和對(duì)照組NaCl溶液的酸堿滴定曲線圖。由圖5可知,在NaCl溶液中無緩沖平臺(tái),而納米膠束溶液在pH由7.4降至5.0期間緩沖能力按CP32、CP22、CP12、CP13依次下降,之所以具有緩沖作用是因?yàn)榧{米膠束結(jié)構(gòu)骨架中的氨基具有吸附質(zhì)子氫的能力。這種緩沖能力有利于CP-MTX的溶酶體逃逸[12],從而使藥物能夠快速有效地進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮藥效。

圖4　CP12納米膠束在37 ℃ GSH水溶液(10 mmol/L)中孵育不同時(shí)間后的粒徑變化

圖5　納米膠束的酸堿滴定曲線

2.6MTX的體外釋放

圖6　載藥膠束CP12-MTX在37 ℃不同介質(zhì)下對(duì)MTX的體外釋放曲線

圖6為載藥膠束CP12-MTX在不同介質(zhì)下對(duì)MTX的體外釋放曲線?？梢钥闯?在還原性介質(zhì)(10 mmol/L GSH)存在下,藥物釋放率普遍比在非還原性介質(zhì)中高出50%左右,這是因?yàn)樵贕SH的作用下,還原敏感性的二硫鍵斷裂,納米膠束解體,所載的藥物得以釋放。

因?yàn)榈脱醯奈h(huán)境及癌細(xì)胞的酸性細(xì)胞器,腫瘤病灶處較正常組織處呈明顯酸性,納米膠束在pH=5.0處比在pH=7.4下更有利于MTX的釋放。這可能是因?yàn)镃P12膠束的質(zhì)子海綿效應(yīng),在酸性條件(pH=5.0)下,超支化納米膠束結(jié)構(gòu)中的氨基質(zhì)子化,使得整個(gè)納米膠束高度正電性,從而使結(jié)構(gòu)內(nèi)部產(chǎn)生高強(qiáng)度的靜電斥力,使結(jié)構(gòu)松散,從根本上使藥物釋放增強(qiáng)。

2.7細(xì)胞毒性分析

圖7(a)為3T3細(xì)胞和Hela細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度納米膠束CP12處理24 h后的細(xì)胞存活率圖。可以看出,3T3和Hela的細(xì)胞存活率均在90%以上,說明納米膠束對(duì)細(xì)胞幾乎沒有毒性,生物相容性很好。圖7(b)為不同質(zhì)量濃度游離藥物和載藥膠束對(duì)Hela細(xì)胞處理24 h后的抗腫瘤活性圖。可以分析出,游離藥物MTX和載藥膠束CP12-MTX對(duì)Hela細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)分別是0.024 μg/mL和0.07 μg/mL。相同藥物濃度下,載藥膠束較游離藥物的毒性要略低一些,說明載藥膠束對(duì)藥物MTX具有緩釋作用。

圖7　3T3和Hela細(xì)胞在不同質(zhì)量濃度納米膠束CP12下的存活率(a); 相同藥物濃度下游離藥物和載藥膠束CP12-MTX對(duì)Hela細(xì)胞的抗腫瘤活性(b)

3　結(jié)　論

通過PEGDGE與Cys的親核開環(huán)反應(yīng),在水溶液中合成了具有pH和還原雙重敏感性的納米膠束; 利用疏水載藥和超支化聚合物的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu),可將藥物的載藥率提高至10.32%,體外釋放顯示了顯著的pH和還原敏感性;該納米膠束具有優(yōu)良的生物相容性,具有作為抗癌藥物載體的應(yīng)用前景。

[1]JOSHI G,SULTANA R,TANGPONG J,etal.Free radical mediated oxidative stress and toxic side effects in brain induced by the anti cancer drug adriamycin:Insight into chemobrain[J].Free Radical Research,2005,39(11):1147-1154.

[2]WANG Xu,YANG Lily,CHEN Zhuo,etal.Application of nanotechnology in cancer therapy and imaging[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2008,58(2):97-110.

[3]MAEDA H.Toward a full understanding of the EPR effect in primary and metastatic tumors as well as issues related to its heterogeneity[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2015,91:3-6.

[4]KIM M S,HYUN H,KIM B S.Polymeric nano-micelles as drug carrier using polyethylene glycol and polytrimethylene carbonate linear and star-shaped block copolymer[J].Current Applied Physics,2008,8(6):646-650.

[5]侯志林,周永豐,顏德岳.超支化聚合物膠束自組裝[J].高分子通報(bào),2015(9):5-20.

[6]FAN Yujiao,ZHANG Dapeng,WANG Jie,etal.Preparation of anion-exchangeable polymer vesicles through the self-assembly of hyperbranched polymeric ionic liquids[J].Chemical Communications,2015,51(33):7234-7237.

[7]CHEN Chaojian,LIU Gongyan,LIU Xiangsheng,etal.Photo-responsive,biocompatible polymeric micelles self-assembled from hyperbranched polyphosphate-based polymers[J].Polymer Chemistry,2011,2(6):1389-1397.

[8]WANG Jixue,XU Weiguo,HUI Guo,etal.Selective intracellular drug delivery from pH-responsive polyion complex micelle for enhanced malignancy suppressioninvivo[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2015,135:283-290.

[9]ZHAO Xubo,LIU Peng.Reduction-responsive core-shell-corona micelles based on triblock copolymers:Novel synthetic strategy,characterizatio,and application as a tumor microenvironment-responsive drug delivery system[J].ACS Applied Materials and Interfaces,2015,7(1):166-174.

[10]LIU Jinyao,HUANG Wei,PANG Yan,etal.Molecular self-assembly of a homopolymer:An alternative to fabricate drug-delivery platforms for cancer therapy[J].Angewandte Chemie,2011,50(39):9162-9166.

[11]WANG Xingping,TANG Jianbin,SUI Meihua,etal.Degradable water soluble hyperbranched polymers for drug delivery[J].Journal of Controlled Release,2011,152(suppl 1):e76-e78.

[12]PIEST M,LIN CHAO,MATEOS-TIMONEDA M A,etal.Novel poly(amido amine)s with bioreducible disulfide linkages in their diamino-units:Structure effects andinvitrogene transfer properties[J].Journal of Controlled Release,2008,130(1):38-45.

[13]HAMID Z A A,BLENCOWE A,OZCELIK B,etal.Epoxy-amine synthesised hydrogel scaffolds for soft-tissue engineering[J].Biomaterials,2010,31(25):6454-6467.

[14]XU Minghui,QIAN Junmin,SUO Aili,etal.Co-delivery of doxorubicin and P-glycoprotein siRNA by multifunctional triblock copolymers for enhanced anticancer efficacy in breast cancer cells[J].Journal of Materials Chemistry B,2015,3(10):2215-2228.

Preparation and Drug Release Properties of pH/Redox-Responsive Hyperbranched Nano Micelles

ZHOU Ya-min,WU Lu-yan,BAI Xue,HE Fei,SHI Gang,NI Cai-hua

(Key Laboratory of Food Colloids and Biotechnology of Ministry of Education,School of Chemical and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China)

Hyperbranched nano micelles with a multi-core-shell structure were prepared via the nucleophilic ring-opening reaction of poly(ethylene glycol) diglycidyl ether (PEGDGE) and cystamine (Cys) in aqueous solution.The drug methotrexate (MTX) was loaded into nano micelles through hydrophobic interactions between MTX and nano micelles to form drug-loaded micelles.The chemical structure and morphology of the micelles were characterized by FT-IR,1H-NMR,DLS and SEM.The cytotoxicity of nano and MTX-loaded micelles were studied by Methyl Thiazolyl Tetrazolium(MTT) assays.Results showed that the hyperbranched nano micelles had spheric morphology with an average diameter of 100 nm and narrow dispersity.MTX-loaded micelles had drug loading content of 10.32%.The release of MTX was stimuli-responsive under an acidic and reductive condition which simulated the intracellular environment of tumors.MTT assays demonstrated that nano micelles were highly biocompatibleinvivo,while MTX-loaded micelles caused pronounced cytotoxic effects to Hela tumor cells.

hyperbranched nano micelles; redox-responsive; pH-responsive; methotrexate

1008-9357(2016)03-0346-006

10.14133/j.cnki.1008-9357.2016.03.015

2015-12-08

國家自然科學(xué)基金(21401079); 江蘇省科技支撐計(jì)劃-工業(yè)部分(BE2012017)

周亞敏(1989-),女,安徽安慶人,碩士生,主要研究方向?yàn)樯镝t(yī)用材料。E-mail:1426842802@qq.com

倪才華,E-mail:nicaihua2000@163.com

O636.9

A