周惠燕， 陳 玨, 王嘉俊

(1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W校生物與制藥學院，浙江寧波 315100； 2.浙江大學寧波理工學院，浙江寧波 315100)

氯霉素(Chforamphenicol，CAP)屬于廣譜抗生素，由于其低廉的成本和良好的治療效果，被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)以預防動物疾病和促進動物生長，不僅使食品中殘留了氯霉素，過量的氯霉素還會進入環(huán)境，如水和土壤中形成持續(xù)性的污染，嚴重危害人類的健康。因此,研究一種快速、簡便、高靈敏度的分析氯霉素殘留的方法具有重要意義。

目前已經(jīng)報道的用于氯霉素殘留分析檢測的樣品前處理方法有溶劑萃取[1]、加速溶劑萃取[2]、固相萃取[3]、基質(zhì)固相分散技術(shù)[4]、分散液液微萃取[5]等。分散液液微萃取(DLLME)是一種簡單、快速并且廉價的前處理方法，但是使用有機溶劑作為萃取劑和分散劑。離子液體分散液液微萃取(IL-DLLME)以離子液體替代傳統(tǒng)的有機溶劑作為萃取劑，而分散劑依然是有機溶劑。原位離子液體-分散液液微萃取技術(shù)(insituIL-DLLME)以親水性離子液體作為萃取劑，離子交換劑作為分散劑被引入通過原位復分解反應形成具有疏水性的離子渾濁溶液。該方法非?？焖?，并且未使用有機溶劑，目前已成功的用于測定一些水樣中的污染物[6 - 8]。本實驗在原位IL-DLLME法萃取水中氯霉素的研究中引入渦旋輔助萃取，并結(jié)合高效液相色譜(HPLC)法測定氯霉素的含量，對影響實驗的各種參數(shù)進行了研究，建立了簡便、快速、環(huán)保的分析水樣中氯霉素的方法。本實驗為進一步研究渦旋輔助原位IL-DLLME法萃取其它基質(zhì)(如食品)及環(huán)境中的氯霉素奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本，島津公司)；XW-80A旋渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司)；臺式低速離心機(上海醫(yī)療器械(集團)有限公司手術(shù)器械廠)；WBFY-201微電腦微波化學反應器(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

氯霉素標準溶液：準確稱取氯霉素標準品(貴州迪大生物科技有限責任公司，批號GZDD-1021)置于100 mL容量瓶中，加少量甲醇溶解后，加水配制成質(zhì)量濃度為104 μg·mL-1的氯霉素標準品儲備溶液。甲醇(色譜純)；甲醇(分析純，中國杭州化學試劑有限公司)；親水性離子液體1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C2MIN][BF4])、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C4MIN][BF4])、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C6MIN][BF4])、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C8MIN][BF4])，均購自寧波市鄞州銘浩醫(yī)藥化工有限公司；雙三氟甲磺酰亞氨基鋰(LiNTF2)、六氟磷酸鉀(KPF6)購自上海成捷化學有限公司)。實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

在15 mL的微波管中加入5 mL水樣，加入40 μL親水性離子液體[C6MIN][BF4]，渦旋震蕩混合1 min，使親水性離子液體與水樣充分混合，然后加入500 μL離子交換劑LiNTF2，旋渦震蕩混合5 min，80 W微波輻射1 min，冷卻至室溫，然后將微波管置于轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1的離心機中離心8 min，移去上層水相，抽取下層疏水性離子液體相測定總體積V總，后以HPLC法測定氯霉素的峰面積A。最后計算校正峰面積=[V總(μL)/定量環(huán)20(μL)]×A。校正峰面積的大小即代表氯霉素的提取效率。

1.3 高效液相色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS柱(250×4.6 mm，5 μm )；流動相：水-甲醇(40∶60,V/V)；流速:1.0 mL·min-1；進樣環(huán)體積:20 μL；柱溫:25 ℃；檢測波長:275 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 親水性離子液體種類的選擇

離子液體的性質(zhì)在萃取中起著重要作用。本研究中的離子液體必須是親水性的，當加入離子交換劑后變?yōu)槭杷缘碾x子液體，1-烷基-3-甲基咪唑基四氟硼酸鹽系列符合該特點。在水中添加氯霉素(加標質(zhì)量濃度為104 μg·mL-1)用于實驗條件優(yōu)化。取加標水樣5 mL置于15 mL的微波管中，分別用4種親水性離子液體[C2MIN][BF4]、[C4MIN][BF4]、[C6MIN][BF4]、[C8MIN][BF4]作為萃取劑，以LiNTF2作為離子交換劑，萃取劑與離子交換劑的體積分別為70 μL和500 μL。其余步驟同1.2，最后比較4種不同親水性離子液體萃取條件下氯霉素的校正峰面積。結(jié)果顯示[C6MIN][BF4]的提取效率最好。

2.2 親水性離子液體體積的優(yōu)化

親水性離子液體的體積對于目標物的萃取效率有很大影響。本文分別以20、30、40、50、60、70、80、90 μL的[C6MIN][BF4]為萃取劑，以500 μL LiNTF2作為離子交換劑，其余步驟同1.2。結(jié)果表明，當[C6MIN][BF4]體積從20 μL增加至40 μL時，氯霉素的提取效率逐漸增加，此后氯霉素的萃取效率隨著[C6MIN][BF4]體積的增加而降低。因此選擇40 μL [C6MIN][BF4]為最佳實驗條件。

2.3 離子交換劑種類的選擇

LiNTF2和KPF6是兩種非常好的離子交換劑，加入包裹了藥物的親水性離子液體后，通過離子交換作用，使親水性離子液體變?yōu)槭杷噪x子液體，達到分離的作用。實驗過程中，當使用KPF6溶液時，發(fā)現(xiàn)KPF6在常溫下水中的溶解度較低，而且在使用離子交換劑后，離心分離后在管子底部形成固體狀的離子液體分層，無法進行HPLC分析。因此選擇LiNTF2作為離子交換劑。

2.4 離子交換劑體積的選擇

離子交換劑LiNTF2在原位IL-DLLME萃取過程中起到重要的作用，LiNTF2過少會導致置換反應發(fā)生不完全，萃取效率低；LiNTF2過多會改變?nèi)芤褐械柠}濃度，對萃取效率造成影響。本文分別以300、400、500、600、700、800 μL的離子交換劑LiNTF2考察其對氯霉素萃取效率的影響。結(jié)果表明，當LiNTF2體積從300增至500 μL時，萃取效率增加，此后萃取效率大幅度下降。因此選擇加入LiNTF2的體積為500 μL。

2.5 微波輻射時間的選擇

微波輻射能夠給樣品提供能量，影響化合物的相互作用和反應速率，從而可能影響水中氯霉素的提取效率。本文在80 W下改變輻射時間，分別設置0、30、50、60、70、90 s，其余步驟同1.2，最后計算不同微波輻射時間下氯霉素的提取效率。結(jié)果氯霉素的提取效率在未經(jīng)微波輻射時最大，而微波輻射后提取效率顯著下降，可能的原因是微波輻射的功率太大產(chǎn)生熱量不利于離子液體之間進行離子交換。

2.6 渦旋震蕩的選擇

渦旋震蕩是將混合物充分混合均勻，增加化合物間的接觸機會，可能會影響水中氯霉素的提取效率。實驗設置了兩次渦旋震蕩，第一次渦旋震蕩是在加入親水性離子液體后，目的是使親水性離子液體與加標水樣增大接觸面積，充分混合均勻，幫助親水性離子液體更好的萃取水中氯霉素；第二次渦旋震蕩是在加入離子交換劑后，目的是使離子交換劑與包裹著氯霉素的的親水性離子液體充分混合均勻，促進離子交換。結(jié)果如表1。研究結(jié)果表明第一次渦旋震蕩反而使氯霉素的提取率降低，第2次渦旋震蕩可提高氯霉素的提取效率。

表1 不同渦旋震蕩條件對氯霉素提取效率的影響

2.7 線性范圍

用已配制好的104 μg·mL-1的氯霉素標準品儲備溶液稀釋配制氯霉素濃度為5.2、10.4、20.8、52、78、104 μg·mL-1，進行HPLC分析。以濃度(c)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標作圖，得到標準工作曲線方程為：A=34.427c+6.1076,相關(guān)系數(shù)r=0.9999。氯霉素在5.2～104 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8 回收率與檢測限

原位置換IL-DLLME法萃取水中氯霉素最佳實驗條件為:5 mL水樣，加入40 μL親水性離子液體[C6MIN][BF4]輕輕手動搖晃混勻，然后加入500 μL離子交換劑LiNTF2，旋渦震蕩混合5 min，然后將微波管置于轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1的離心機中離心8 min，移去上層水相，抽取下層疏水性離子液體相測定體積并以HPLC法測定其中氯霉素的含量。向空白水樣中添加3個濃度水平的氯霉素標準溶液，按最佳實驗條件進行原位置換IL-DLLME法萃取水中氯霉素及上述HPLC測定條件進行回收率實驗，每個添加水平做6個平行，結(jié)果見表2。氯霉素的平均回收率為82.7%～89.4%，相對標準偏差(RSD)為3.5%～5.3%。本方法檢測限為5.2 μg·L-1。

表2 樣品中氯霉素的回收率和相對標準偏差(n=6)

2.9 實際樣品分析

應用本方法對來自浙江地區(qū)多個水庫、養(yǎng)魚塘、城市自來水、河水、海水等30份水樣進行檢測，均未檢測到水樣中氯霉素殘留。

3 結(jié)論

本文將一種新型的樣品預處理技術(shù)即渦旋輔助原位IL-DLLME法用于水樣中氯霉素的萃取富集，通過優(yōu)化樣品預處理以及結(jié)合HPLC測定方法，建立了簡便、快速、環(huán)保的測定水中氯霉素殘留的分析方法。