李夢(mèng)華， 褚先鋒， 豆小文， 楊美華*， 孔維軍， 歐陽(yáng)臻

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，藥用植物研究所 北京 100193)

1 前言

量子點(diǎn)(Quantum Dots,QDs)，又稱半導(dǎo)體納米粒子(Semi-conductor Nanoparticles)，是由Ⅱ-Ⅵ族元素或Ⅲ-Ⅴ族元素組成，且三個(gè)維度尺寸都小于100 nm的納米微晶體。由于其直徑小于或接近激子波爾半徑而表現(xiàn)出獨(dú)特的物理性質(zhì)，如量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等。自Alivisatos小組[1]和Nie小組[2]解決了量子點(diǎn)生物相容性的難題以來(lái)，量子點(diǎn)以顏色豐富、光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、抗漂白能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)備受關(guān)注，并逐步應(yīng)用于重金屬[3,4]、真菌毒素[5]、農(nóng)藥[6 - 8]及其他小分子污染物的痕量分析。

適配體(Aptamer)是經(jīng)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)體外篩選而獲得[9]，且能與靶物質(zhì)特異并緊密結(jié)合的一小段RNA或DNA單鏈寡核苷酸序列[10]。適配體與靶物質(zhì)之間的識(shí)別、結(jié)合原理與抗體相似，有著“化學(xué)抗體”的美譽(yù)，但適配體在很多性能方面都超越了抗體，如穩(wěn)定性強(qiáng)、易于功能化修飾與標(biāo)記、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單及成本低等。因此，適配體被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究[11]、藥物分析[12,13]、病毒檢測(cè)[14,15]等領(lǐng)域。

適配體特異性識(shí)別靶物質(zhì)后，本身并不具有將識(shí)別信息轉(zhuǎn)換為可檢測(cè)信號(hào)的能力，而熒光物質(zhì)可作為標(biāo)記物與適配體相結(jié)合，將信息轉(zhuǎn)換為可檢測(cè)信號(hào)。傳統(tǒng)的熒光染料在檢測(cè)過(guò)程中表現(xiàn)出易淬滅、瞬時(shí)即逝等缺點(diǎn)，量子點(diǎn)以獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[16 - 19](表1)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)熒光染料帶來(lái)的不足，提高了分析檢測(cè)的靈敏度，并實(shí)現(xiàn)了多組分的同時(shí)檢測(cè)。因此，將量子點(diǎn)的光學(xué)特異性與適配體特異性識(shí)別技術(shù)相結(jié)合，提供了高效、簡(jiǎn)便、快速、靈敏、高通量的分析檢測(cè)平臺(tái)。本文介紹了量子點(diǎn)的合成方法及其與適配體的偶聯(lián)，綜述了近幾年基于量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體技術(shù)在生物分子、病原微生物、細(xì)胞、生物毒素方面的應(yīng)用，總結(jié)了該技術(shù)在應(yīng)用方面存在的問(wèn)題，并提出該技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)，以期新技術(shù)在復(fù)雜基質(zhì)樣品檢測(cè)中發(fā)揮巨大的潛力。

表1 量子點(diǎn)與有機(jī)熒光染料特性比較[16 - 19]

2 量子點(diǎn)的合成

目前，研究較多的量子點(diǎn)有Ⅱ-Ⅵ族(CdS、CdSe、CdTe、ZnSe等)和Ⅲ-Ⅴ族(CaAs、InAs等)，其中Cd系量子點(diǎn)是最具有特色的量子點(diǎn)體系之一。量子點(diǎn)的合成方法有很多，根據(jù)合成所用溶劑的不同，一般可將量子點(diǎn)的合成分為有機(jī)相合成法和水相合成法。

2.1 有機(jī)相合成法

有機(jī)相合成法是基于有機(jī)物與金屬化合物之間的反應(yīng)而進(jìn)行的。傳統(tǒng)方法使用的前驅(qū)體，如二甲基鎘(Cd(CH3)2))大多具有毒性高，危險(xiǎn)性高，且價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。Peng 等[20]對(duì)傳統(tǒng)有機(jī)合成方法進(jìn)行了優(yōu)化，以CdO作為前驅(qū)體代替Cd(CH3)2，一步合成了高熒光產(chǎn)率的CdS、CdTe、CdTe量子點(diǎn)，使量子點(diǎn)的合成安全化，并大大縮短了反應(yīng)時(shí)間。

隨著量子點(diǎn)合成方法的改進(jìn)，價(jià)格低廉、綠色環(huán)保的試劑逐漸代替配位化合物三辛基氧化膦(Trioctylphosphine Oxide,TOPO)、三辛基膦(Trioctylphosphine,TOP)等有毒試劑。Deng等[21]采用液體石蠟和油酸分別作為溶劑和配體，合成出了高質(zhì)量單分散的CdSe半導(dǎo)體量子點(diǎn)，熒光量子產(chǎn)率達(dá)60%。與TOPO及TOP相比，液體石蠟和橄欖油價(jià)格更低，降低了實(shí)驗(yàn)成本，使大規(guī)模合成CdSe量子點(diǎn)成為可能。

含鎘量子點(diǎn)毒性大且造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，歐盟已禁止工業(yè)產(chǎn)品中Cd類重金屬元素的存在，因此非鎘量子點(diǎn)成為近年人們研究的熱點(diǎn)。過(guò)渡金屬摻雜型量子點(diǎn)是常見非鎘量子點(diǎn)類型之一，與經(jīng)典的Cd系量子點(diǎn)相比具有抗環(huán)境干擾能力強(qiáng)、光化學(xué)性穩(wěn)定、可抑制熒光自淬滅等優(yōu)點(diǎn)。Zhang等[22]在有機(jī)溶劑中合成Cu摻雜Zn-In-S量子點(diǎn)，并包裹ZnSe外殼形成Cu∶Zn-In-S/ZnS量子點(diǎn)。該量子點(diǎn)發(fā)射波長(zhǎng)覆蓋了藍(lán)色波段到近紅外波段(450～810 nm)，熒光量子產(chǎn)率可高達(dá)85%，并且可通過(guò)配體交換轉(zhuǎn)為水溶性量子點(diǎn)，而拓寬了應(yīng)用范圍。這種近紅外摻雜量子點(diǎn)將會(huì)是以后研究的重點(diǎn)，有望取代某些含鎘量子點(diǎn)。

隨著熒光標(biāo)記和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，低毒或無(wú)毒性的近紅外量子點(diǎn)發(fā)揮巨大潛力。近年來(lái)，近紅外Ⅱ區(qū)量子點(diǎn)成為活體成像的理想熒光探針，Zhu等[23]在有機(jī)相中合成Ag2Se量子點(diǎn)，其發(fā)射熒光在1 080～1 330 nm范圍，熒光產(chǎn)率為9.58%，且量子點(diǎn)通過(guò)配體交換由油相轉(zhuǎn)為水相仍保持3.33%的量子產(chǎn)率，可應(yīng)用于生物成像的實(shí)際應(yīng)用。Li等[24]在有機(jī)相中合成Ag2S量子點(diǎn)，平均粒徑為5.6 nm，以聚乙二醇(PEG)包裹形成聚乙二醇化Ag2S量子點(diǎn)，該量子點(diǎn)(0.1 mg·mL-1)組織穿透深度大于1.1 cm，更利于深層組織活體成像。

有機(jī)相制備的量子點(diǎn)具有優(yōu)良的光譜性能、尺寸均一、單分散性好、粒度可調(diào)的特點(diǎn)且技術(shù)比較成熟，但該類量子點(diǎn)不溶于水，必須對(duì)其表面進(jìn)行親水轉(zhuǎn)相處理才能用于實(shí)際樣品的分析檢測(cè)中。

2.2 水相合成法

水相合成法具有操作簡(jiǎn)單易行，成本較低等特點(diǎn)，常用巰基乙酸、巰基丙酸等作為穩(wěn)定劑來(lái)制備，所得量子點(diǎn)可直接應(yīng)用于樣品的分析檢測(cè)[25,26]。

近年來(lái)，水溶液合成量子點(diǎn)的方法得到逐步改進(jìn)，Hodlur等[27]研究了用性質(zhì)穩(wěn)定、可溶于水的二氧化硒代替了硒粉和其它有害前驅(qū)體，合成了三種CdSe量子點(diǎn)，量子產(chǎn)率最高為24%。這種合成方法符合“綠色”合成路線，但是制備的量子點(diǎn)表面存在大量缺陷，嚴(yán)重影響量子點(diǎn)的發(fā)光性質(zhì)、熒光量子產(chǎn)率，因此一般在水相量子點(diǎn)表面包被一層無(wú)機(jī)材料殼結(jié)構(gòu)形成核殼型量子點(diǎn)而使其表面鈍化，減少激發(fā)缺陷。Wang等[28]通過(guò)微波法在水相中合成了CdTe/CdS/ZnS核-殼-殼量子點(diǎn)，具有良好的分散性和生物相容性，并且發(fā)射光譜可覆蓋近紅外區(qū)間(700～800 nm)。另外，多元近紅外量子點(diǎn)如CuInS2[29,30]、AgInS2[31]、ZnIn2S4[32]等也逐漸應(yīng)用于生物分析檢測(cè)中。

水相合成法所得的量子點(diǎn)相對(duì)有一些不足，量子產(chǎn)率較低、熒光強(qiáng)度較弱、穩(wěn)定性較差等，通常需要用水熱法、微波輔助法來(lái)改善。目前，工作者已進(jìn)行了大量研究使水相合成法得到快速發(fā)展，具有更大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 量子點(diǎn)的表面修飾及其與適配體的偶聯(lián)

3.1 量子點(diǎn)的表面修飾

有機(jī)相中合成的量子點(diǎn)表面多包覆著TOPO、TOP等疏水有機(jī)配體，無(wú)法直接在水溶液環(huán)境中實(shí)現(xiàn)樣品的檢測(cè)。表面修飾是改善該類量子點(diǎn)生物相容性、擴(kuò)大其應(yīng)用范圍的有效手段。常用修飾方法主要有三種：第一，表面配體交換法，利用巰基乙酸[33]、巰基丙酸[34]、半胱氨酸[35]、谷胱甘肽[36]等含水溶性基團(tuán)的有機(jī)配體取代量子點(diǎn)表面原有配體。這些有機(jī)配體屬于雙功能分子，一端帶有的巰基與量子點(diǎn)表面的金屬離子發(fā)生配位作用，另一端的羧基、羥基等基團(tuán)可提高量子點(diǎn)的水溶性且能夠起到與適配體相偶聯(lián)的作用。此方法相對(duì)簡(jiǎn)單，但容易導(dǎo)致量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率下降及熒光減弱。第二，二氧化硅/硅氧烷包覆法[37]，首先在量子點(diǎn)的表面包覆一層親水性的無(wú)機(jī)物，然后修飾官能團(tuán)，使量子點(diǎn)具有水溶性而與生物分子連接。Ma等[38]在水相中合成CdTe/CdS核殼量子點(diǎn)，然后利用“St?ber”法在量子點(diǎn)表面形成二氧化硅殼層(圖1)，修飾后的量子點(diǎn)的平均粒徑小于5 nm，相比于最初的CdTe/CdS量子點(diǎn)展現(xiàn)出現(xiàn)更高的發(fā)光效率，同時(shí)降低了量子點(diǎn)毒性且改善了生物相容性。第三，兩親性聚合物法，利用聚合物的疏水側(cè)鏈與量子點(diǎn)表面烷基鏈相互作用形成一層穩(wěn)定的聚合膜，不僅可以進(jìn)行生物分子共價(jià)連接，而且可以防止量子點(diǎn)受到外界環(huán)境的破壞。Speranskaya等[39]以馬來(lái)酸酐兩親性聚合物修飾量子點(diǎn)，修飾后的量子點(diǎn)可保持90%的熒光且可更易于與蛋白的結(jié)合。Schmidtke等[40]合成聚酰亞胺-b-聚乙二醇(PI-b-PEG)嵌段共聚物修飾量子點(diǎn)，降低了細(xì)胞毒性。

3.2 量子點(diǎn)與適配體的偶聯(lián)

圖1 二氧化硅包覆量子點(diǎn)的合成示意圖[38]Fig.1 Schematic illustration for the synthesis of silica-coated QDs[38]

納米材料與核酸分子的偶聯(lián)方法分為共價(jià)偶聯(lián)與非共價(jià)偶聯(lián)。共價(jià)偶聯(lián)是通過(guò)化學(xué)鍵合的作用將適配體連接在量子點(diǎn)的表面。例如，Savla等[41]在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的催化下將標(biāo)有羧基的量子點(diǎn)與標(biāo)有氨基的適配體偶聯(lián)，成功將適配體連接在量子點(diǎn)表面。非共價(jià)偶聯(lián)是一種基于生物分子間特異性作用的生物偶聯(lián)法，Zhang等[42]利用生物素與親和素之間的特異性作用將量子點(diǎn)與適配體偶聯(lián)形成用于小鼠肝癌細(xì)胞成像的探針，證明該方法具有很高的結(jié)合效率。

4 基于量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體技術(shù)在分析檢測(cè)中的應(yīng)用

4.1 生物分子檢測(cè)

4.1.1蛋白質(zhì)生物大分子蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要載體，也是生物功能的主要執(zhí)行者。蛋白質(zhì)的檢測(cè)及其技術(shù)的發(fā)展對(duì)人類生命科學(xué)研究、人體健康評(píng)價(jià)等具有重大意義。蛋白質(zhì)檢測(cè)的最主要方法之一是標(biāo)記分析法。Levy等[43]基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理，首次將量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。無(wú)靶物質(zhì)時(shí)，量子點(diǎn)與猝滅基團(tuán)距離靠近，熒光被淬滅。靶物質(zhì)存在時(shí)，凝血酶與適配體形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使帶有淬滅物質(zhì)的核苷酸序列脫離，量子點(diǎn)熒光增強(qiáng)，從而達(dá)到檢測(cè)凝血酶的目的。

圖2 基于量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體檢測(cè)凝血酶示意圖[44]Fig.2 Schematic representation of thrombin detection based on quantum dots labeled aptamer[44]

目前，蛋白質(zhì)檢測(cè)中研究比較多的是將量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)與熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)結(jié)合。FRET是一種基于供體和受體之間的非輻射能量轉(zhuǎn)移的能量轉(zhuǎn)移方式?；诹孔狱c(diǎn)標(biāo)記的FRET體系中，供體-受體對(duì)需要滿足的條件包括：(1)供體基團(tuán)的發(fā)射光譜與受體基團(tuán)的吸收光譜必須有有效重疊；(2)供體基團(tuán)與受體基團(tuán)之間的距離必須小于10 nm；(3)供體基團(tuán)的發(fā)射光譜與受體基團(tuán)的發(fā)射光譜不重疊或重疊很小。Chi等[44]建立了一種新型量子點(diǎn)-適配體探針檢測(cè)凝血酶。將染料BOBO-3嵌入發(fā)夾結(jié)構(gòu)的適配體并將其偶聯(lián)到量子點(diǎn)上。量子點(diǎn)作為供體，BOBO-3為受體而組成FRET體系。當(dāng)加入凝血酶時(shí)，適配體發(fā)生構(gòu)象改變，由發(fā)夾構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)樗木垠w構(gòu)象，使BOBO-3脫離適配體探針，從而根據(jù)BOBO-3熒光強(qiáng)度下降程度而對(duì)凝血酶定量分析(圖2)。

另外，電致化學(xué)發(fā)光(ECL)傳感器也被廣泛應(yīng)用于生物分子的檢測(cè)。Li等[45]建立CdSe量子點(diǎn)標(biāo)記的電化學(xué)適配體傳感器(ECL-Aptamer-Sensor)檢測(cè)凝血酶，熒光強(qiáng)度與凝血酶濃度在0～64 μg·mL-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9986。實(shí)驗(yàn)證明該法檢測(cè)凝血酶具有良好的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。

4.1.2三磷酸腺苷(ATP) 最常見的ATP分析方法是熒光分析法和生物發(fā)光法，但由于抗體和生物發(fā)光試劑穩(wěn)定性差、成本高、制備困難等缺點(diǎn)限制了應(yīng)用范圍[46]，量子點(diǎn)標(biāo)記適配體技術(shù)的發(fā)展，為ATP的檢測(cè)提供了有效方法。Liu等[47]基于化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(CRET)設(shè)計(jì)了量子點(diǎn)-適配體傳感器，通過(guò)氯化血紅素/G-四鏈體脫氧核酶催化引起化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移，從而根據(jù)QDs產(chǎn)生的CRET熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的檢測(cè)，檢測(cè)限為10 μmol·L-1。該方法檢測(cè)ATP降低了背景信號(hào)并且使多通道檢測(cè)成為可能。相比于FRET，CRET不需要外來(lái)的激發(fā)光源并且以量子點(diǎn)作為受體，從而最大限度的降低了光漂白效應(yīng)以及樣品的自熒光干擾，降低了檢測(cè)限，提高了靈敏度。

4.2 病原微生物檢測(cè)

病原微生物是一類可引起人類和動(dòng)植物各種疾病的微生物，包括細(xì)菌、病毒等[48]。這些微生物具有種類繁多、遺傳變異快等特點(diǎn)，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)并且需要專業(yè)的操作人員。近年來(lái)，量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體技術(shù)以其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)在病原微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域脫穎而出。

圖3 基于量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體檢測(cè)細(xì)菌示意圖[51]Fig.3 Schematic representation of bacteria detection based on quantum dots labeled aptamer[51]

4.2.1細(xì)菌傳統(tǒng)檢測(cè)細(xì)菌的方法步驟比較繁瑣，分為以下幾步：首先將標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)、分純，配制成一定濁度的細(xì)菌濃度，然后進(jìn)行生化反應(yīng)，最后進(jìn)行細(xì)菌鑒定[49]。該方法操作復(fù)雜、漏檢率較高、費(fèi)時(shí)耗力且不能同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)菌。Jiang等[50]基于FRET構(gòu)建了檢測(cè)雙歧桿菌特異性16S rDNA的新方法，以羧基修飾的量子點(diǎn)為供體，有機(jī)染料6-羧基羅丹明(ROX)為受體，根據(jù)量子點(diǎn)與ROX的熒光強(qiáng)度的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)雙歧桿菌的檢測(cè)。Duan等[51]以量子點(diǎn)為熒光標(biāo)記物，適配體為識(shí)別元件選擇性捕獲目標(biāo)細(xì)菌，并利用流式細(xì)胞術(shù)構(gòu)建了一種特異性的、靈敏的同時(shí)檢測(cè)兩種食源性致病菌的方法(圖3)，結(jié)果顯示副溶血性弧菌和沙門氏菌的檢測(cè)限都為5×103cfu·mL-1，此方法為量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體技術(shù)在流式細(xì)胞儀上的應(yīng)用開辟了道路。

4.2.2病毒目前，文獻(xiàn)報(bào)道的病毒快速檢測(cè)方法并不多。Roh等[52]用羧基修飾的量子點(diǎn)標(biāo)記5′端為氨基的RNA核苷酸適配體作為熒光探針，在芯片上實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物肝炎C病毒的 NS3的檢測(cè)，檢出限可達(dá)5 ng·mL-1。隨后，Roh等[53]又研究了SARS病毒的檢測(cè)，同樣運(yùn)用量子點(diǎn)標(biāo)記適配體技術(shù)對(duì)SARS-CoV殼蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。在芯片表面，量子點(diǎn)標(biāo)記的RNA適配體可以特異性結(jié)合SARS-CoV殼蛋白，檢測(cè)限最低達(dá)到0.1 pg·mL-1。此外，Tian等[54]基于量子點(diǎn)與碳納米管之間形成FRET，建立量子點(diǎn)-單鏈DNA探針捕獲H5N1病毒的DNA，檢測(cè)限為9.39 nmol·L-1。

4.3 細(xì)胞檢測(cè)與成像

量子點(diǎn)標(biāo)記適配體的功能化探針在腫瘤細(xì)胞分析檢測(cè)領(lǐng)域已深受研究者的青睞。在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期的追蹤與觀察中，量子點(diǎn)作為標(biāo)記物具備較高的熒光性能，并且可以提高適配體的穩(wěn)定性[55]。

圖4 基于量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體檢測(cè)癌細(xì)胞示意圖[56]Fig.4 Schematic representation of cancer cells detection based on quantum dots labeled aptamer[56]

基于量子點(diǎn)修飾的適配體探針在腫瘤細(xì)胞檢測(cè)與分析中取得了很好的效果。Lin等[56]將嵌入柔紅霉素(DNR)的MUC1適配體與近紅外量子點(diǎn)CuInS2偶聯(lián)，形成DNR-MUC1-QDs偶聯(lián)物作為前列腺癌細(xì)胞的識(shí)別與成像系統(tǒng)(圖4)，MUC1-QDs納米-生物體系不但可以將DNR藥物傳輸?shù)桨屑?xì)胞中，還可以通過(guò)量子點(diǎn)CuInS2的熒光強(qiáng)度變化來(lái)檢測(cè)DNR，同時(shí)起到細(xì)胞成像的作用。其中對(duì)DNR的檢測(cè)線性范圍為33～88 nmol·L-1，檢測(cè)限為19 nmol·L-1，研究證明了DNR-MUC1-QDs探針的高特異性和靈敏度。目前，電化學(xué)細(xì)胞傳感器也成為細(xì)胞檢測(cè)中的一個(gè)熱點(diǎn)，Li等[57]基于適配體-量子點(diǎn)(Aptamer-QDs)構(gòu)建了競(jìng)爭(zhēng)性電化學(xué)細(xì)胞傳感器，將DNA(cDNA)序列與量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體互補(bǔ)并修飾在金電極表面，靶細(xì)胞可以通過(guò)特異性識(shí)別與Aptamer-QDs結(jié)合，使Aptamer-QDs脫離電極，通過(guò)檢測(cè)電極上量子點(diǎn)中Cd2+的濃度進(jìn)而確定靶細(xì)胞的濃度。結(jié)果顯示檢測(cè)線性范圍為1.0×102～1.0×106cells·mL-1，檢測(cè)限為100 cells·mL-1。除此之外量子點(diǎn)-適配體探針在乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)也被廣泛應(yīng)用[58]，并且還有研究將其與磁性粒子結(jié)合用于肝癌細(xì)胞(HCC)的捕獲與檢測(cè)[59]，證明了量子點(diǎn)-適配體可作為檢測(cè)HCC的理想分子探針。

4.4 真菌毒素檢測(cè)

真菌毒素包括黃曲霉毒素(AFs)、赭曲霉毒素(OTs)、伏馬菌素(FBs)玉米赤霉烯酮(ZON)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、展青霉素(PT)等[60]，目前常用檢測(cè)方法主要有液相色譜、高效液相色譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等方法[61]。這些方法大多需要大型儀器進(jìn)行分析檢測(cè)，儀器設(shè)備昂貴，對(duì)操作者要求較高，費(fèi)時(shí)又耗力，不適用于實(shí)際生產(chǎn)中大量樣品的分析檢測(cè)，從而迫切需要發(fā)展簡(jiǎn)便、靈敏的快速檢測(cè)方法。

圖5 基于量子點(diǎn)標(biāo)記適配體檢測(cè)AFB1[66]Fig.5 Schematic representation of AFB1 detection based on quantum dots labeled aptamer[66]

雖然，量子點(diǎn)以優(yōu)于熒光染料的獨(dú)特性質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于ZON[62]、黃曲霉毒素(AFB1)[63]、T-2毒素[64]等毒素的檢測(cè)。但是，目前量子點(diǎn)-適配體技術(shù)檢測(cè)真菌毒素的應(yīng)用仍然很少。研究者曾報(bào)道有機(jī)染料標(biāo)記適配體檢測(cè)真菌毒素[65]，以熒光素FAM作為標(biāo)記物，單壁碳納米管作為淬滅劑，設(shè)計(jì)了適配體傳感器檢測(cè)赭曲霉毒素A(OTA)，檢測(cè)限為24.1 nmol·L-1，線性范圍為25～200 nmol·L-1。在此基礎(chǔ)上Lu等[66]將量子點(diǎn)代替了熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)，與適配體進(jìn)行偶聯(lián)，然后吸附在石墨烯表面，形成石墨烯-適配體-量子點(diǎn)熒光淬滅系統(tǒng)(圖5)。根據(jù)FRET原理，在水溶液體系中AFB1的檢測(cè)限低達(dá)1.0 nmol·L-1，線性范圍為3.2 nmol·L-1～320 μmol·L-1。與上述熒光素標(biāo)記適配體檢測(cè)真菌毒素相比檢測(cè)限更低，靈敏度更高。另外，Yang等[67]基于量子點(diǎn)的電致化學(xué)發(fā)光和核酸外切酶雙重信號(hào)放大技術(shù)設(shè)計(jì)了高靈敏度適配體傳感器檢測(cè)OTA，其檢測(cè)限低達(dá)0.64 pg·mL-1，此方法為檢測(cè)毒素提供了新型化學(xué)傳感技術(shù)。

5 總結(jié)與展望

近年來(lái)，基于量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體技術(shù)在生物毒素檢測(cè)、藥物傳遞、細(xì)胞成像及臨床治療等領(lǐng)域成為廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)，展現(xiàn)出特異性高、靈敏性好、操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)勢(shì)，然而在應(yīng)用中還存在一些問(wèn)題：(1)生物毒性。量子點(diǎn)中含有的重金屬等元素使其具有潛在的危害，特別是Cd系量子點(diǎn)。研究證明量子點(diǎn)的生物毒性與本身的化學(xué)組成、合成方法、應(yīng)用方式及環(huán)境等因素有關(guān)[68]，量子點(diǎn)的安全性已成為臨床應(yīng)用的重要問(wèn)題之一。因此，使用綠色環(huán)保的方法合成毒性較低的量子點(diǎn)是下一步研究的方向。(2)穩(wěn)定性。適配體與量子點(diǎn)偶聯(lián)時(shí)容易發(fā)生顆粒的團(tuán)聚等不穩(wěn)定現(xiàn)象，并且偶聯(lián)后，可能會(huì)產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)從而降低適配體的特異性和靈敏度[69]。適配體在血液或者細(xì)胞內(nèi)容易被核酸酶降解，尤其是RNA更容易被水解，從而不能有效的識(shí)別檢測(cè)靶物質(zhì)。因此量子點(diǎn)-適配體探針需要更進(jìn)一步研究提高穩(wěn)定性。(3)適應(yīng)性。目前，量子點(diǎn)-適配體技術(shù)集中于生物分析檢測(cè)中，而在中藥材等復(fù)雜基質(zhì)中的應(yīng)用較少。基質(zhì)效應(yīng)是新技術(shù)在復(fù)雜基質(zhì)中應(yīng)用面臨的主要問(wèn)題，本課題組Yang[70]等將適配體親和柱應(yīng)用于中藥材中真菌毒素的富集、純化，為新技術(shù)在中藥材等復(fù)雜基質(zhì)中的檢測(cè)提供了前提。實(shí)現(xiàn)新技術(shù)在復(fù)雜基質(zhì)中的分析檢測(cè)也將成為今后發(fā)展的一個(gè)重要方向。

總之，基于量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體技術(shù)為現(xiàn)代分析檢測(cè)提供了快速、高效、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法，但仍需要不斷完善，不斷發(fā)展，進(jìn)而適用于各個(gè)領(lǐng)域的分析檢測(cè)，同時(shí)給中藥等復(fù)雜基質(zhì)中有害殘留物的分析檢測(cè)帶來(lái)新的發(fā)展契機(jī)。