陸奕娜, 陳建偉， 張林田， 魏建華， 林 文

(汕頭出入境檢驗檢疫局,廣東汕頭 515031)

砷是一種廣泛分布于自然界的元素，其生物毒性不僅與其含量有關，且更大程度上由其存在形態(tài)決定。常見的砷化合物有：亞砷酸(As(Ⅲ))、砷酸(As(Ⅴ))、一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷膽堿(AsC)和砷甜菜堿(AsB)等。不同形態(tài)的砷化合物毒性差異很大，其毒性依次為As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MAA>DMA>AsC>AsB[1]。有機砷的毒性較小，砷糖是無毒的，無機砷的毒性最大。

近年來，隨著現(xiàn)代儀器分析技術不斷發(fā)展，砷形態(tài)分析取得了長足的進步，尤其是高效液相色譜(HPLC)與電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)聯(lián)用技術的應用，使得砷化合物得以不斷被識別和確認。本文利用高效液相色譜和電感耦合等離子體質(HPLC-ICP-MS)譜聯(lián)用技術，建立了同時快速測定蝦類產品6種砷形態(tài)的分析方法，以期為蝦類水產品的質量控制提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國，安捷倫公司)，配四元泵及自動進樣器；Agilent 7700X電感耦合等離子體質譜儀(美國，安捷倫公司)；Hettich高速離心機(德國)；Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)(美國)；Hamilton PRP-X100陰離子分析柱(250×4 mm，10 μm)。

砷標準物質：As(Ⅲ)(GBW0866)、As(Ⅴ)(GBW08667)、一甲基砷(MMA,GBW08668 )、二甲基砷(DMA,GBW 08669)、砷甜菜堿(AsB,GBW08670)、砷膽堿(AsC,GBW08671)，均購于國家標準物質研究中心，使用前用純水配制成1 μg/mL儲備液，0～5 ℃避光保存。(NH4)H2PO4、(NH4)2HPO4、NaH2PO4、NaAc、KNO3、NH4NO3、(NH4)2CO3、(NH4)HCO3、HAc、無水乙醇、甲酸、氨水均為分析純；EDTA、甲醇為色譜純。實驗用水為超純水。

1.2 儀器條件

1.2.1HPLC條件流動相A：0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1,V/V)(pH=8.5)，流動相B：50 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1,V/V)(pH=8.5)，流速1.0 mL/min，進樣量15 μL，梯度程序：0～1 min，100%A～100%B；1～8 min，100%B；8～10 min，100%B～100%A；10～15 min，100%A。

1.2.2ICP-MS條件在分析測試前，先用10 μg/L的7Li、89Y、140Ce、205Ti調諧液對ICP-MS進行調諧，使89Y的靈敏度達到最優(yōu)，同時也可使75As有較高的靈敏度和較低的檢測限，優(yōu)化后的條件：測質量數(shù)75As,m/z采集模式：TRA，采樣周期：0.8 s，采集時間：9 005 s，載氣:高純液氬，霧化器：同心霧化器，等離子體氣體流速：15.0 L/min，載氣流速：1.0 L/min，輔助氣流速：0.9 L/min。

1.3 樣品處理

稱取均質后的樣品1.00 g于50 mL離心管中，加入38 mL 0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1，V/V)溶液，混均，超聲萃取1.5 h，再加2 mL 3%乙酸，加水定容至50 mL，混均。于4 ℃冰箱中靜止10 min后，上清液過0.22 μm濾膜于1.5 mL離心管中，以10 000 r/min離心15 min，吸取上清液進行HPLC-ICP-MS分析。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實驗對比了幾種洗脫溶劑對6種砷形態(tài)的洗脫效果(表1)。結果顯示，序號4、6、7、8色譜條件下，6種砷形態(tài)化合物基本洗脫分離。通過單標定性，6種化合物的洗脫順序均為：AsC、AsB、As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)。序號8條件下，6種化合物的分離效果最好，在10 min內完全洗脫，除了As(Ⅲ)、DMA的保留時間比較接近外，其他幾種化合物出峰間隔比較均勻。實驗通過降低前期離子強度，即把流動相A：0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1)(pH=8.5)轉向流動相B：50 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1)(pH=8.5)轉換的時間延長，可以將As(Ⅲ)、DMA保留時間拉開，當其轉換時間延長至1 min時，6種砷形態(tài)化合物的出峰間隔非常均勻，其保留時間分別為1.601、2.307、3.148、4.788、6.362、9.416 min，在10 min內洗脫完畢，色譜圖如圖1。本實驗最終選定的色譜條件見1.2.1。

表1 液相色譜條件

圖1 6種砷形態(tài)洗脫最佳色譜圖Fig.1 The optimal chromatograms of six kinds of arsenic species

2.2 標準曲線及檢出限

對濃度分別為0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 ng/mL的6種砷形態(tài)化合物混合標準溶液進行HPLC-ICP-MS分析，以峰面積(y)對濃度(x,μg/L)進行線性回歸。結果表明，在該濃度范圍內，6種砷形態(tài)的線性回歸方程相關系數(shù)均在0.999以上。線性方程式及檢出限見表2。

表2 6種砷形態(tài)的線性方程式及檢出限

2.3 前處理的優(yōu)化

分別采用甲醇-水(1∶l)、水、水-HAc(19∶1)、0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1) 等4種體系對養(yǎng)殖蝦的6種砷形態(tài)進行提取，將上述處理完畢的上清液進HPLC-ICP-MS檢測。實驗同時采用文獻方法[6]對養(yǎng)殖蝦樣品進行總砷測定，根據(jù)6種砷化合物含量總和與總砷含量的比率得到提取率。采用GB/T 5009.11-2003[7]對樣品進行無機砷測定。實驗過程添加6種砷化合物標準溶液，使得加標濃度為40 μg/kg。結果顯示，四種前處理的提取率差別不大。0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1)作為提取劑獲得的提取率及回收率相對較好，回收率符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》[8]。因此，確定提取劑為0.5 mmol/L (NH4)2CO3-甲醇(99∶1)。結果見表3。

表3 前處理砷形態(tài)化合物的結果及回收率(n=3)

ND:Not detected.

2.4 樣品測定

用本法同時測定汕頭市海域附近的養(yǎng)殖蝦的6種砷形態(tài)，其檢測結果見表4。養(yǎng)殖蝦中的砷主要以砷甜菜堿(AsB)形式存在，基本不存在毒性較大的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)。

表4 養(yǎng)殖蝦樣品的6種砷形態(tài)化合物檢測結果(n=3)

ND:not detected.

3 結論

建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜同時測定蝦類中6種砷形態(tài)，優(yōu)化了As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA、AsB和AsC 6種砷形態(tài)的分離條件，使6種不同形態(tài)的化合物在10 min內得以分離，基線平穩(wěn)，各個化合物出峰相間隔均勻。該方法能快速地分析養(yǎng)殖蝦中的6種砷形態(tài)。