韓　燕，管清梅，鄒　影

（1.阜陽師范學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.安徽環(huán)境污染物降解與監(jiān)測省級實驗室，安徽 阜陽 236037）

牛奶中氯霉素殘留的高效液相色譜法測定

韓燕1，2，管清梅1，2，鄒影1，2

（1.阜陽師范學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.安徽環(huán)境污染物降解與監(jiān)測省級實驗室，安徽 阜陽 236037）

利用液液萃取-高效液相色譜-二極管陣列檢測方法建立了牛奶中氯霉素殘留的分析方法。牛奶樣品加入冰醋酸和飽和氯化鈉溶液后用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮并轉(zhuǎn)溶于乙腈中，用正己烷脫脂，最后濃縮定容于流動相中，進行儀器分析。氯霉素濃度在20～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，方法的加標(biāo)回收率在86.5%～94.4%之間，最低檢測限為2 ng/mL。

氯霉素；獸藥殘留；牛奶；高效液相色譜

氯霉素（Chloramphenicol，簡稱CAP）作為一種廣譜的抗生素，能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，廣泛用于各種細(xì)菌性疾病的治療，特別是奶牛乳腺炎的治療，從而易使奶及奶制品中容易產(chǎn)生氯霉素殘留。由于氯霉素有嚴(yán)重的副作用，能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾?。?］，因此對人類的健康構(gòu)成了潛在威脅，歐盟、美國、日本等許多國家都禁止在動物飼養(yǎng)過程中使用氯霉素，為此建立了各種方法來監(jiān)測牛奶中氯霉素的殘留，并且規(guī)定牛奶中不可檢出氯霉素。

牛奶中氯霉素殘留的測定方法主要有氣相色譜法［2］、液相色譜法［3-7］、氣質(zhì)聯(lián)用法［8，9］和液質(zhì)聯(lián)用法［10-16］，通過文獻［2-16］比較可知，氣相色譜-電子捕俘獲檢測器（GC-ECD）的檢測靈敏度最高，方法檢測限可低至0.1 ng/mL，但其樣品預(yù)處理繁瑣，萃取后必須進一步衍生化。氣質(zhì)聯(lián)用法（GC/MS）和液質(zhì)聯(lián)用法（LC/MS）對儀器和操作者能力要求較高。高效液相色譜法雖然靈敏度低，但其預(yù)處理相對簡單，具有分離速度快、效率高和操作可自動化等特點。此外還有放射免疫法［17］和酶聯(lián)免疫分析法［18，19］，Arnold［17］報道了在奶中氯霉素的放射免疫的痕量分析方法，奶中氯霉素殘留在1 ng/mL以上的能被準(zhǔn)確定量，回收率高于95%，但放射免疫法具有同位素半衰期短、存在放射性污染及儀器設(shè)備復(fù)雜等缺點。另外荷蘭推出了測定氯霉素殘留的酶聯(lián)免疫測定試劑盒Quik2card（現(xiàn)又稱La cart test試劑盒）。該方法在應(yīng)用時，樣品不經(jīng)過預(yù)處理時的檢出限量為5～10 ng/mL，經(jīng)過預(yù)處理及濃縮后的檢出限可達1 ng/mL以下［18］，但樣品在被判斷為陽性時，需用質(zhì)譜方法做最終確認(rèn)。

因此本文采用高效液相色譜法建立了牛奶中氯霉素殘留的分析方法，并對本地出售的鮮牛奶和消毒牛奶中氯霉素殘留進行了檢測。

1　實驗方法

1.1儀器

高效液相色譜儀：Agilent 1100 Series配有二極管陣列（DAD）檢測器（Agilent，USA）；離心機LD4-2型（北京醫(yī)用離心機廠）；快速混勻器SK-1型（金壇市富華儀器有限公司）；超聲波清洗器B-52型（BRANSON儀器公司，USA）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52-A型（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2藥品與試劑

試劑（除注明外，均為色譜純）：乙酸乙酯；乙腈；正己烷；甲醇；冰醋酸（分析純）；氯化鈉（分析純）。

市售純牛奶（品牌：光明、長富、蒙牛、夏進、伊利）；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.99%，1 000 μg/mL，配于乙酸乙酯中，由廣東省佛山市順德區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗監(jiān)督中心提供）。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確移取 1 mL 1 000 g/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配制成100 μg/mL儲備液，置于-20℃冰箱中保存。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確移取1 mL 100 μg/mL的氯霉素儲備液氮氣吹干，用甲醇-水（35∶65，V/V）定容至10 mL，配制成10 μg/mL中間溶液，置于4℃冰箱中保存。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取適量中間溶液，用甲醇-水（35：65，V/V）配制成20、50、100、250、500、1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，置于4℃冰箱中保存。

1.3檢測方法

1.3.1液相色譜條件色譜柱

Waters Spherisorb ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：35：65的甲醇-水溶液；流速：1 mL/ min；進樣量：50 μL；二極管陣列檢測器：狹縫16 nm，掃描范圍190～600 nm。

1.3.2樣品提取方法

吸取10 mL牛奶于離心管內(nèi)，加入150 μL冰醋酸和1 mL氯化鈉飽和溶液，漩渦10 s，加入20 mL乙酸乙酯，充分振蕩3 min，離心，吸取上層清液于濃縮管中，重復(fù)萃取兩次，合并乙酸乙酯層，55℃下氮氣吹干。油狀殘渣用5 mL乙腈溶解，漩渦15 s，將溶液轉(zhuǎn)移至60 mL分液漏斗中，加入10 mL正己烷振蕩2 min，棄去正己烷，重復(fù)操作一次，下層溶液在氮氣下吹干，用甲醇-水（35：65，V/V）溶解殘渣并定容至1 mL，用0.45 μm水性濾膜過濾后待測定。

1.3.3全程空白實驗

不加牛奶，其余同1.3.2方法處理，按1.3.1的色譜條件進行檢測。

1.3.4加標(biāo)回收率檢測

分別量取10 mL牛奶樣品于離心管中，分別移取0.1 mL濃度為0.5、1、5、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與上述離心管中，獲得氯霉素添加水平分別為5、10、50、100 ng/mL的加標(biāo)樣品，漩渦10 s，放置10 min，同2.2和2.3方法操作。每種加標(biāo)濃度分別做四個平行樣。

1.3.5牛奶樣品的檢測

按照1.3.1-13.4的實驗方法分別對光明、長富、蒙牛、夏進和伊利五種品牌的牛奶進行檢測和回收率測定。

2　結(jié)果與討論

2.1校正曲線與方法檢測限

將濃度分別為 20、50、100、250、500、1 000 ng/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)系列，依次進樣，以氯霉素峰面積值為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1?？芍?，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為20～1 000 ng/mL，回歸方程式為

y=0.090 6x-0.366，

其相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9。以基線噪聲3倍峰面積對應(yīng)的氯霉素的含量作為檢出限的規(guī)則（RSN=3），得到氯霉素的檢出限為2 ng/mL。

圖1　氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2回收率實驗

分別在牛奶（光明牌）中加入一定濃度的氯霉素后，按1.3.4實驗方法測定其方法回收率，結(jié)果見表1。

表1　牛奶中氯霉素的加標(biāo)回收率

2.3全程空白與牛奶樣品的檢測結(jié)果

全程空白樣品中未檢出有氯霉素殘留，結(jié)果見表2，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)、樣品和樣品加標(biāo)的液相色譜圖見圖2。

圖2　氯霉素標(biāo)準(zhǔn)、牛奶樣品和添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)的牛奶樣品色譜圖。A：氯霉素標(biāo)準(zhǔn)，1 μg/mL；

表2　部分國產(chǎn)品牌牛奶中氯霉素

4　結(jié)論

與固相萃取凈化［7，20］和基質(zhì)固相分散［21］等樣品前處理方法相比較，本方法樣品前處理簡單實用、回收率高、重現(xiàn)性好，可作為牛奶中氯霉素殘留的檢測方法。本方法回收率較高，不同濃度加標(biāo)回收率的值均在86.5%～94.4%之間，且具有較好的精密度，說明本方法用于牛奶中氯霉素殘留的檢測能夠取得可信的結(jié)果。

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HPLC determination of chloramphenicol residues in milk

HAN Yan1，2，GUAN Qing-mei1，2，ZOU Ying1，2

（1.School of Chemistry and Materials Engineering，F(xiàn)uyang Normal University，F(xiàn)uyang Anhui 236037，China；2.Anhui Provincial Key Laboratory for Degradation and Monitoring of the Pollution of the Environment，F(xiàn)uyang Anhui 236037，China）

The liquid-liquid extraction-high performance liquid chromatography-diode array detection method were used to establish the analytic methods of chloramphenicol residues in milk.After the milk samples was added glacial acetic acid and a saturated sodium chloride solution，extracted with ethyl acetate，the extract was concentrated and dissolved in acetonitrile and transferred with hexane，and finally concentrated to volume in the mobile phase for instrumental analysis.Chloramphenicol concentration was excellent in 20～1 000 ng/mL linear range，and the recovery method was between 86.5%～94.4%，and the lowest detection limit was 2 ng/mL.

Chloramphenicol；veterinary drug residues；milk；HPLC

O623.731

A

1004-4329（2016）01-037-04

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2016）01-037-04

2015-07-20

安徽高校省級自然科學(xué)研究一般項目（2015KJ010）；安徽高校省級自然科學(xué)研究一般項目（2014KJ010，2014KJ014）；阜陽師范學(xué)院科研機構(gòu)校級委托專項課題（2015HJJC02）；阜陽師范學(xué)院自然科學(xué)研究項目（2015FSKJ06）資助。

韓燕（1977-），女，碩士，講師，研究方向：環(huán)境化學(xué)。