笪　虎,焦　峰

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·論著·

多聚賴氨酸對同種異體骨的細(xì)胞親和性影響的實(shí)驗(yàn)研究

笪虎,焦峰

目的研究兔同種異體骨經(jīng)多聚賴氨酸表面改性后，對兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)親和性的變化。方法采取凍干法，將多聚賴氨酸覆蓋在同種異體骨的微孔表面，對其進(jìn)行表面改性。表面改性后的同種異體骨設(shè)定在實(shí)驗(yàn)組，表面未改性的設(shè)定在對照組，BMSCs分別種植于兩組同種異體骨的微孔表面。采用掃描電鏡觀察、噻唑藍(lán)(MTT)法檢測BMSCs在同種異體骨微孔表面貼附、增殖情況，同時檢測兩組經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞表達(dá)的堿性磷酸酶(ALP)的活性，并對兩組的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組中BMSCs在同種異體骨微孔表面貼附、增殖以及向成骨細(xì)胞分化的情況明顯優(yōu)于對照組(P<0.05)。結(jié)論同種異體骨經(jīng)多聚賴氨酸表面改性后，顯著提升了BMSCs的親和性。

同種異體骨； 多聚賴氨酸； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 兔； 表面改性

同種異體骨是骨科最常用的骨缺損填充材料，它在受體內(nèi)主要起骨傳導(dǎo)的作用，即為受體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等提供生長的平臺或載體[1-2]。但是，目前臨床上所用的同種異體骨均未經(jīng)過表面修飾劑的修飾，其對細(xì)胞的親和性(即對細(xì)胞的富集能力)仍不夠理想，不能完全滿足臨床的需要[3]。主要表現(xiàn)為：骨缺損區(qū)在植入同種異體骨后，常出現(xiàn)細(xì)胞難以大量貼附、增殖與分化的現(xiàn)象，導(dǎo)致其不能充分發(fā)揮骨傳導(dǎo)的功能，從而引起骨缺損區(qū)愈合延遲甚至不愈合[4-5]。近十年來，許多學(xué)者利用多聚賴氨酸對殼聚糖、珊瑚羥基磷灰石、羥乙基乙酸等組織工程支架進(jìn)行表面改性，均顯著地提高了支架對細(xì)胞的親和力[6-8]。為增加同種異體骨對細(xì)胞的親和力，本研究采取凍干法，將多聚賴氨酸覆蓋在同種異體骨的微孔表面，對其進(jìn)行表面改性。本研究通過評價同種異體骨經(jīng)多聚賴氨酸表面改性后，其對細(xì)胞親和力的變化，旨在明確多聚賴氨酸對同種異體骨進(jìn)行表面改性的意義。

材料與方法

1材料

新西蘭大白兔由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；兔同種異體骨由第四軍醫(yī)大學(xué)西京骨科醫(yī)院骨庫提供；左旋多聚賴氨酸(相對分子量為15～30萬，Sigma，美國)；DMEM培養(yǎng)基、D-Hank’s液、TGF-β2(Gibico，美國)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；戊巴比妥(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)；胰蛋白酶、地塞米松、L-抗壞血酸(Sigma，美國)；ITS(其中含有牛胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉，Sigma，美國)；丙酮酸鈉、堿性磷酸酶(ALP)活性測定試劑盒(上?；瘜W(xué)試劑集團(tuán))；β-甘油磷酸鈉(Sigma，美國)；50mL一次性塑料培養(yǎng)瓶(Coster，美國)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Hereus，德國)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；倒置相差顯微鏡(Zeiss，德國)；掃描電子顯微鏡(Hitachi，日本)；冷凍干燥機(jī)(Alpha 2-4,Chaist,德國)；酶聯(lián)免疫檢測儀(Sunrise,瑞士)。

2方法

2.1同種異體骨的表面改性將兔椎體松質(zhì)骨來源的同種異體骨切割成邊長為3mm的立方體，置于3%的多聚賴氨酸溶液內(nèi)，振蕩2h，使溶液充分浸透入同種異體骨的微孔表面。然后取出置于清潔玻片上，-20℃下預(yù)冷2h、-80℃下冷凍1h，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中干燥24h，即獲得微孔表面經(jīng)多聚賴氨酸改性后的同種異體骨。20kGy60Co輻照滅菌后，4℃條件下密封保存、備用。經(jīng)表面改性的同種異體骨設(shè)定為實(shí)驗(yàn)組，未經(jīng)表面改性的為對照組。

2.2兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的提取和培養(yǎng)肌注麻醉新西蘭大白兔后，于兔一側(cè)股骨大粗隆處備皮，消毒、鋪無菌巾。持腰穿針刺入股骨大粗隆內(nèi)，以5mL無菌注射器抽取1ml骨髓(注射器內(nèi)預(yù)留肝素0.1mL以抗凝)。將骨髓移入50mL培養(yǎng)瓶中，其中預(yù)先裝有含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基。接著置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以全骨髓貼壁法培養(yǎng)提純BMSCs。3d后進(jìn)行首次全量換液，去除未貼壁的細(xì)胞。此后2d半量換液一次，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時消化傳代。

2.3BMSCs種植于同種異體骨的微孔內(nèi)將生長融合的第3代BMSCs消化、重懸，置于向成骨方向誘導(dǎo)的培養(yǎng)基(含10-8M地塞米松、50mg/L L-抗壞血酸、10mM β-甘油磷酸鈉和10%胎牛血清的高糖DMEM)內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。無菌12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔內(nèi)放置一粒同種異體骨，用20μL移液器吸取10μL細(xì)胞懸液緩慢滴加至支架表面，待其完全滲透進(jìn)入支架后再繼續(xù)滴加，最終接種細(xì)胞數(shù)量控制在2×104個/塊。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2～4h后，添加向成骨誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，此后2d半量換液1次。

2.4掃描電鏡觀察細(xì)胞在兩組同種異體骨內(nèi)貼附與增殖情況于培養(yǎng)第 2、8和14天，使用2.5%的戊二醛、1%鋨酸先后固定同種異體骨，然后乙醇依次梯度脫水。乙腈依次置換乙醇后，在真空條件下進(jìn)行干燥處理。標(biāo)本粘貼在金屬托上后，在同種異體骨與細(xì)胞表面噴金。標(biāo)本放置于掃描電鏡內(nèi)，觀察細(xì)胞在同種異體骨微孔表面貼附與增殖情況。

2.5噻唑藍(lán)(MTT)法檢測兩組同種異體骨內(nèi)細(xì)胞的數(shù)量于培養(yǎng)、誘導(dǎo)第 2、4、6、8、10、12、14和16天，利用MTT法分別檢測細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組和對照組同種異體骨微孔上的貼附與增殖情況。每個時間點(diǎn)兩組各取8個標(biāo)本，然后分別用磷酸緩沖溶液(PBS)輕柔地沖洗3遍，除去未能有效貼附的細(xì)胞。先加入MTT溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄12孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)上清液。再加入二甲基亞砜(DMSO)震蕩10min，使甲臢結(jié)晶充分溶解，每孔吸取150μL液體移入另一96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值。以時間為橫軸，光吸收值(A)為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

2.6同種異體骨內(nèi)貼附細(xì)胞表達(dá)的ALP的活性測定于培養(yǎng)、誘導(dǎo)第4、8、12和16天，每個時間點(diǎn)兩組各取8個標(biāo)本。棄去兩組培養(yǎng)液，D-Hank’s液沖洗3次，根據(jù)ALP活性測定試劑盒逐步加入試劑。用酶標(biāo)儀在520nm波長處測定吸光度A值，即代表細(xì)胞ALP的活性。

2.7統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)　果

1細(xì)胞在兩組同種異體骨表面貼附、增殖情況的掃描電鏡觀察

BMSCs植于兩組同種異體骨后的第2、8和14天，利用掃描電鏡觀察細(xì)胞的貼附、增殖的情況(圖1)。培養(yǎng)后第2天，細(xì)胞在兩組松質(zhì)異體骨微孔的表面均完全伸展開，可見長長的偽足，但實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞密度是對照組的2～3倍，見圖1a、b；培養(yǎng)后第8天，兩組細(xì)胞密度均增加，而實(shí)驗(yàn)組增加得更多，兩組細(xì)胞密度相差顯著，見圖1c、d；培養(yǎng)后第14天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞近于鋪整個滿微孔表面，細(xì)胞膜之間發(fā)生接觸，數(shù)量難于繼續(xù)大幅增加，而對照組細(xì)胞密度仍明顯小于實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞膜之間無明顯接觸現(xiàn)象，見圖1e、f。

2細(xì)胞在兩組同種異體骨內(nèi)增殖的情況

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示：從培養(yǎng)的第2～14天，細(xì)胞在兩組同種異體骨內(nèi)的數(shù)量均持續(xù)增加，細(xì)胞生長曲線呈拋物線形。接種、培養(yǎng)后即迅速增殖，10d后增殖速度減慢，14d后進(jìn)入平臺期。每個時間點(diǎn)上實(shí)驗(yàn)組內(nèi)細(xì)胞的數(shù)量均明顯高于對照組，兩組差異顯著(P<0.05)。

圖1　細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組和對照組同種異體骨表面貼附與增殖情況的掃描電鏡觀察。

圖2　BMSCs在兩組同種異體骨微孔表面貼附與增殖情況的結(jié)果分析，數(shù)據(jù)采用±s表示(*P<0.05；n=8)

3BMSCs在兩組同種異體骨內(nèi)培養(yǎng)、誘導(dǎo)的不同時段的ALP活性

ALP活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示：實(shí)驗(yàn)組和空白對照組細(xì)胞經(jīng)過成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后，ALP的活性隨時間延長而增大。分別在4、8d時，實(shí)驗(yàn)組平均值稍高于對照組，但兩組結(jié)果無顯著差異(P>0.05)；分別在12、16d時，實(shí)驗(yàn)組ALP活性明顯大于對照組，且兩組差異顯著(P<0.05)。

表1　BMSCs在兩組同種異體骨內(nèi)培養(yǎng)不同時段表達(dá)的ALP活性±s，n=8)

討　論

支架材料的微孔表面能與細(xì)胞貼附分子以及某些生長因子受體相互作用，以便于種子細(xì)胞的貼附、擴(kuò)增和分化，從而給種子細(xì)胞提供一個生長的平臺[9]。將支架材料與生物分子結(jié)合以對支架材料進(jìn)行表面改性，是改善骨組織工程支架性能的重要策略之一[10]。支架材料表面改性的主要目的是提高支架對細(xì)胞的親和性，優(yōu)化其骨傳導(dǎo)能力。隨著骨組織工程的迅猛發(fā)展，支架表面改性成為目前研究的熱點(diǎn)，已有許多學(xué)者對人工合成支架材料進(jìn)行表面改性，并報道獲得了一定的成果[3]。但目前被廣泛運(yùn)用于臨床的同種異體骨均未經(jīng)表面改性，對細(xì)胞的親和性還不夠理想，影響了骨缺損的修復(fù)進(jìn)程。因此，對同種異體骨進(jìn)行表面改性，提高其對細(xì)胞的親和力顯得十分必要。

多聚賴氨酸是一種由多個賴氨酸片斷經(jīng)共價鍵及范德華力等聚合而成的有機(jī)物[6]，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)瓶(板)的表面處理[11-13]。許多實(shí)驗(yàn)證明：多聚賴氨酸能促進(jìn)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶(板)表面的貼附、生長及增殖[11，13-14]。受此啟發(fā)，本研究將多聚賴氨酸覆蓋在同種異體骨的微孔表面，對其進(jìn)行表面改性處理，期望在微孔表面構(gòu)建一個有利于細(xì)胞貼附、增殖的局部微環(huán)境，促進(jìn)種子細(xì)胞的貼附、增殖和分化。本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)，了解同種異體骨經(jīng)多聚賴氨酸表面改性后，對種子細(xì)胞親和力改變的情況。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)定經(jīng)表面改性的同種異體骨為實(shí)驗(yàn)組，未經(jīng)表面改性的為對照組。在相同條件下， BMSCs被種植于兩組同種異體骨上，以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基將其向成骨方向進(jìn)行誘導(dǎo)、培養(yǎng)。于種植、培養(yǎng)后的多個時間點(diǎn)，分別采用掃描電鏡觀察、MTT法檢測BMSCs在兩組同種異體骨微孔上貼附、生長、增殖情況，同時檢測兩組經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞表達(dá)的ALP的活性，并進(jìn)行對比。結(jié)果顯示：BMSCs在實(shí)驗(yàn)組同種異體骨內(nèi)貼附、增殖的數(shù)目顯著多于對照組(P<0.05)，向成骨細(xì)胞分化的情況顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)，即多聚賴氨酸能促進(jìn)BMSCs在同種異體骨的微孔表面進(jìn)行貼附、增殖和分化。

分析多聚賴氨酸對同種異體骨表面改性的作用機(jī)制，可能是：(1)多聚賴氨酸是一種多價陽離子聚合物，附著在同種異體骨微孔表面后，改變了微孔表面電荷狀態(tài)。能通過靜電吸引等作用，避免細(xì)胞聚集成球狀，使細(xì)胞在材料上貼附并鋪展為單層，明顯提高了三維立體條件下的細(xì)胞貼附效率[15]。(2)多聚賴氨酸與細(xì)胞磷脂雙層有直接的連接作用，可增加細(xì)胞在同種異體骨微孔表面的貼附[16]。(3)多聚賴氨酸所含的胺基、羥基等，能吸附溶液和血清中層粘蛋白、糖胺聚糖和纖維粘連蛋白等，改善異體骨微孔表面活性，增強(qiáng)親水性，可促進(jìn)細(xì)胞的貼附[17-18]。(4)通過其殘基所帶的陽離子，能與細(xì)胞表面的特異陰離子發(fā)生交聯(lián)作用，以促進(jìn)細(xì)胞的貼附；同時，通過穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)來促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化[19]。

需指出的是：采取凍干法利用多聚賴氨酸對同種異體骨進(jìn)行表面改性，此技術(shù)的方法與步驟較簡單，易于掌握與操作，成本較低，絕大多數(shù)科研院所均能實(shí)施。但是，本研究僅是體外實(shí)驗(yàn)，多聚賴氨酸在體內(nèi)對人體是否有害，還要進(jìn)行大樣本量的動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)才能證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)表明：多聚賴氨酸可作為同種異體骨表面改性的涂層材料，能明顯提高同種異體骨對細(xì)胞的親和性。本研究為組織工程骨的成功構(gòu)建提供一種新的選擇，為提高臨床使用同種異體骨治療骨缺損的效果提供了理論基礎(chǔ)，將會有較廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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(本文編輯： 郭衛(wèi))

Effect of polylysine on the affinity to the cells of the allogeneic bone

DAHu，JIAOFeng

(The 82nd Hospital of PLA,Huai’an223001,China)

ObjectiveTo investigate the change of the affinity of allogeneic bone to BMSCs of the rabbit after surface modification with polylysine. MethodsThe surface modification of the allogeneic bone was processed by the polylysine with lyophilization methods. The allogeneic bones whose surface was modificated were taken as the experimental group,and the others without modification were taken as the control group. The BMSCs was implanted onto the surface of the micropores in the bone allografts. The attachment and proliferation of BMSCs on the surface of the micropores in the bone allografts were observed with SEM and detected with MTT methods,and the activity of the ALP expressed by the osteoblast-induced BMSCs was also detected. Then,the results were compared. ResultsThe attachment,proliferation and osteoblast-differentiation of BMSCs in the experimental group were much superior than those in the control group(P<0.05). ConclusionThe affinity of the bone allografts to BMSCs can be significantly promoted after surface modification with polylysine.

allogeneic bone; polylysine; BMSCs; rabbits; surface modification

1009-4237(2016)05-0291-04

淮安市科技計劃項(xiàng)目資助(HAS2013034)

223001 江蘇 淮安，解放軍第八二醫(yī)院

焦峰，E-mail:923521468@qq.com

R 318.08

A

10.3969/j.issn.1009-4237.2016.05.010

2015-01-19；

2015-03-24)