王微，劉建華，王桂麗，齊特，阮強(qiáng)，孫崢嶸

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.病毒研究室；2.病毒檢驗(yàn)科，沈陽(yáng) 110004）

·論著·

人乳頭瘤病毒16型甲基化水平與子宮頸病變程度關(guān)系的研究

王微1，劉建華2，王桂麗1，齊特1，阮強(qiáng)1，孫崢嶸1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.病毒研究室；2.病毒檢驗(yàn)科，沈陽(yáng) 110004）

目的定量檢測(cè)位于人乳頭瘤病毒16（HPV16）L1基因3′端和LCR基因18個(gè)CpG甲基化水平，了解HPV 16甲基化與子宮頸病變的關(guān)系。方法選取本院就診HPV16陽(yáng)性正常/低度病變、高度病變、子宮頸癌標(biāo)本各10例患者，采用重硫酸鹽-焦磷酸測(cè)序方法分析HPVl6甲基化與子宮頸病變的關(guān)系。結(jié)果Ll基因3′端的位點(diǎn)7 089在正常/低度病變標(biāo)本的甲基化率最高，其次是子宮頸癌，高度病變標(biāo)本的甲基化率最低，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）；3組在位點(diǎn)7 134中甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01），與正常/低度病變標(biāo)本比較，子宮頸癌及高度病變甲基化率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.038、0.017）。結(jié)論HPVl6L1基因3′端甲基化位點(diǎn)7 089、7 134的甲基化水平與子宮頸病變程度存在相關(guān)性，HPVl6型DNA甲基化檢測(cè)可用于臨床上子宮頸病變篩查。

人乳頭瘤病毒16；甲基化；CpG位點(diǎn)；子宮頸病變；焦磷酸測(cè)序

子宮頸癌是全世界高發(fā)的婦科腫瘤之一，其中發(fā)展中國(guó)家的子宮頸癌患者占全球85%以上［1］。高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是導(dǎo)致子宮頸癌的主要原因［2，3］，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的100多種亞型中有40種能入侵生殖器官，其中16、18、58、52、31、33型等高危亞型的感染是女性子宮頸癌的主要病因，尤其是16型，占所有子宮頸癌50%左右［4，5］。但僅有少部分人HPV持續(xù)性感染而導(dǎo)致子宮頸病變，子宮頸上皮內(nèi)高度病變（highgrade squamous intraepithelial lesion，HSIL）是病毒、環(huán)境及機(jī)體共同作用的結(jié)果［6］。

由于大部分HPV感染并不會(huì)導(dǎo)致癌變的發(fā)生，臨床上需要一種檢測(cè)標(biāo)記物將會(huì)發(fā)生癌變的人群區(qū)分出來(lái)進(jìn)行臨床治療。傳統(tǒng)的子宮頸病變篩查依賴于細(xì)胞學(xué)方法，該方法敏感度較低，HPV DNA定量檢測(cè)具有高敏感度，但特異性比較低［7］，不能確定HPV感染者是否是子宮頸病變的進(jìn)一步進(jìn)展人群。因此，對(duì)于子宮頸病變的早期診斷還需要其他標(biāo)志物。DNA甲基化是一種常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，基因組正常甲基化模式的改變可能會(huì)影響病毒生命周期，促使致癌過(guò)程。許多研究［8～11］顯示，在子宮頸病變進(jìn)程中HPV DNA發(fā)生不同程度的甲基化，尤其是L1/L2基因以及基因長(zhǎng)調(diào)控區(qū)（long control region，LCR）變化尤為明顯。本研究采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HPVl6 3′端L1及LCR區(qū)的甲基化狀況，探討HPV16甲基化水平與子宮頸病變之間的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源：選擇2014年4月到2015年5月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院就診的HPV16型陽(yáng)性患者的子宮頸拭子標(biāo)本。按病理診斷結(jié)果分為3組：正常標(biāo)本/子宮頸上皮內(nèi)低度病變（normal/lowgrade squamous intraepithelial lesions，Normal/LSIL）組（Normal/LSIL組）、HSIL組、子宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervical cancer，CC）組（CC組），每組各10例，共30例標(biāo)本。

1.1.2主要試劑及材料：Qiagen公司的DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini kit）；德國(guó)QIAGEN公司轉(zhuǎn)化試劑盒（EpiTect Bisulfite Kit），其他試劑采用Ta-KaRa生物工程公司試劑。

1.2方法

1.2.1DNA提?。菏褂肈NA提取試劑盒從子宮頸拭子標(biāo)本中提取DNA：向1.5 mL EP管中加入750 μL子宮頸拭子樣本及750 μL異丙醇，混勻后14 000 r/min離心10 min。去掉上清后加入200 μL子宮頸拭子溶液懸浮沉淀；向加有樣本的Ep管中加入20 μL蛋白酶K和200 μL緩沖液AL，漩渦振蕩15 s后56℃孵育10 min；加入200 μL 100%的乙醇，漩渦振蕩15 s后將溶液轉(zhuǎn)移至放于2 mL收集管的柱中，6 000 g離心1 min，丟棄液體；向柱子中加入500 μL緩沖液AW2，20 000 g離心3 min，將柱子放置于另一干凈的收集管中20 000 g離心1 min；將柱子置于1.5 mL Ep管中，為了提高最終DNA濃度（＞50 ng/μL），用50 μL的AE緩沖液進(jìn)行洗脫。

1.2.2重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化：本步實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍NA中的非甲基化C轉(zhuǎn)化為U，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化為T。實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3引物設(shè)計(jì)：檢測(cè)的HPV l6甲基化位點(diǎn)為位于L1基因3′端以及全長(zhǎng)LCR基因的18個(gè)CpG位點(diǎn)：L1基因3′端包含3個(gè)位點(diǎn)（7 089、7 134、7 143），LCR基因（5′端）包含4個(gè)位點(diǎn)（7 268、7 426、7 452、7 458），增強(qiáng)子包含5個(gè)位點(diǎn)（7 532、7 550、7 673、 7 679、7 691），復(fù)制起點(diǎn)1個(gè)位點(diǎn)（7 859），E6/E7啟動(dòng)子包含5個(gè)位點(diǎn)（31、37、43、52、58），這些CpG位點(diǎn)在病毒整合及癌基因表達(dá)中起到?jīng)Q定性作用。為涵蓋本研究所涉及的CpG位點(diǎn)，需要擴(kuò)增出8條擴(kuò)增子，共設(shè)計(jì)8對(duì)PCR引物，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。見(jiàn)表1。

1.2.4焦磷酸測(cè)序：PCR擴(kuò)增體系，5×緩沖液GC （KAPA）反應(yīng)緩沖液10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，DNA 2 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，Taq酶（KAPA 5 U/μL）0.2 μL，加無(wú)菌水至50 μL；PCR擴(kuò)增條件，95℃3 min；40個(gè)循環(huán)（94℃30 s，52 ℃30 s，72℃1 min）；72℃7 min。所擴(kuò)增的產(chǎn)物由上海希匹吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行焦磷酸測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采取SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析采用描述性統(tǒng)計(jì)分析方法，數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)18個(gè)目的CpG位點(diǎn)的甲基化狀況。測(cè)序30個(gè)標(biāo)本的18個(gè)CpG位點(diǎn)均測(cè)序成功。

結(jié)果顯示，各位點(diǎn)在3組子宮頸病變中表現(xiàn)出不同的甲基化率，位于L1區(qū)的3個(gè)位點(diǎn)（7 089、7 134、7 143）相對(duì)于其他位點(diǎn)有較高的甲基化率，啟動(dòng)子區(qū)位點(diǎn)31、37、43、52、58甲基化水平變化趨勢(shì)一致，隨子宮頸病變的嚴(yán)重程度而升高，位點(diǎn)7 859在3種子宮頸病變中均表現(xiàn)為最低甲基化水平。位點(diǎn)7 089、7 134 3組甲基化率比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P分別為0.006、0.01）。在位點(diǎn)7 134與Normal/LSIL組比較CC組的甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.038），而HSIL組甲基化率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而此位點(diǎn)HSIL組與CC組的甲基化率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017）。其他位點(diǎn)（7 143、7 268、7 426、7 452、7 458、7 532、7 550、7 673、7 679、7 691、7 859、31、37、43、52、58）3組甲基化率均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。見(jiàn)表2。

3　討論

近年來(lái)，生物學(xué)技術(shù)上的進(jìn)步使我們可以利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)定量檢測(cè)個(gè)體CpG位點(diǎn)的甲基化，且測(cè)序技術(shù)的可靠性及精確度很高，在甲基化研究中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本研究結(jié)果顯示位于L1區(qū)的位點(diǎn)有較高的甲基化率，其中7 089、7 134位點(diǎn)甲基化率在3組病變中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），在HSIL中都表現(xiàn)出相對(duì)低甲基化率。L1基因編碼病毒殼蛋白［12］，該蛋白是病毒復(fù)制感染所必需，基因發(fā)生甲基化后編碼蛋白質(zhì)的功能受到抑制，不能編碼病毒殼蛋白，因此HSIL中的低甲基化水平有利于病毒殼蛋白的表達(dá)，促進(jìn)病毒的復(fù)制感染。在子宮頸癌階段，許多病毒整合入宿主細(xì)胞中，高甲基化是宿主抵抗外源基因整合的防御機(jī)制［13］。一些關(guān)于甲基化的研究［8，12，13］發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞中存在整合的病毒基因組，外源基因整合到宿主基因中，宿主細(xì)胞將其視為外源入侵對(duì)其進(jìn)行甲基化修飾，隨著整合程度的增加，甲基化程度不斷增加。本研究結(jié)果顯示，Normal/LSIL與CC組比較、HSIL與CC組比較7 134的甲基化率差異顯著（P＜0.05），但Normal/ LSIL與HSIL組比較7 134的甲基化率差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明位點(diǎn)7 134可以對(duì)子宮頸病變做出是否為子宮頸癌的診斷，但不能將正常/低度病變與高度病變加以區(qū)分。位點(diǎn)7 859在3組病變中均表現(xiàn)為低甲基化水平，該位點(diǎn)位于病毒的復(fù)制起點(diǎn)位置，并且位于許多轉(zhuǎn)錄因子附近，因此低甲基化有利于維持病毒的復(fù)制［14］。啟動(dòng)子區(qū)的5個(gè)位點(diǎn)（31、37、43、52、58）甲基化水平隨著病變的嚴(yán)重程度增加而增高，該區(qū)域是許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)區(qū)，包括2個(gè)E2蛋白結(jié)合位點(diǎn)（E2 binding site，E2BS）。正常情況下，E2蛋白與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合從而抑制E6、E7基因的表達(dá)。隨著病變進(jìn)展許多病毒基因整合入宿主細(xì)胞中，E2BS發(fā)生甲基化后，E2蛋白不能正常結(jié)合，對(duì)E6、E7基因的抑制得以解除［15］，E6、E7癌蛋白表達(dá)可以使宿主的抑癌蛋白p53和pRB受到抑制，從而加速癌變的進(jìn)程。

表1 HPV16L1/LCR基因引物序列及所檢測(cè)的相應(yīng)CpG位點(diǎn)Tab.1　Primer sequences and CpGs sites o f HPV16 L1/LCR region

許多研究也對(duì)HPV甲基化水平與子宮頸病變的關(guān)系做出了分析。Xi等［13］用亞硫酸鹽測(cè)序的方法研究了LCR區(qū)11個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)低度病變（CIN2-）與高度病變（CIN2+）的發(fā)生率與甲基化頻率呈逆相關(guān)，并且認(rèn)為在CIN2+過(guò)程中HPV低甲基化有利于病毒的復(fù)制感染，但未對(duì)子宮頸癌樣本中的甲基化情況作出分析。Hublarova等［16］使用限制性內(nèi)切酶-PCR法分析了正常樣本、CIN1、CIN2-3、CC的甲基化情況，正常樣本、CIN1甲基化率較高，CIN2-3、CC的甲基化率相對(duì)較低。Hu等［17］對(duì)30例臨床樣本的L1基因的3個(gè)CpG位點(diǎn)（7 032、7 091、7 136）進(jìn)行甲基化分析發(fā)現(xiàn)，在位點(diǎn)7 032和7 091子宮頸癌中的甲基化率最高，無(wú)明顯感染組中甲基化率最低，而在CIN樣本中位點(diǎn)7 136的甲基化率最高，其次是子宮頸癌樣本。出現(xiàn)這些研究結(jié)果不一致的原因是多方面的，可能與子宮頸病變的分類、所研究群體的種族差異及實(shí)驗(yàn)方法（如甲基化限制性內(nèi)切酶法及亞硫酸鹽測(cè)序法只能定性分析位點(diǎn)的甲基化情況，敏感性較低等）有關(guān)。本研究采用強(qiáng)有效的HPV甲基化檢測(cè)方法（焦磷酸測(cè)序技術(shù)），發(fā)現(xiàn)位于L1基因中的位點(diǎn)7 089、7 134的甲基化率在3組病變中差異顯著，可將子宮頸癌病程樣本加以區(qū)分。

表2　3組子宮頸病變中HPVl6 3′-L1及LCR基因各檢測(cè)位點(diǎn)的甲基化水平（%）Tab.2　Proportion methylation of each CpG site in 3′-L1/LCR o f HPV16 among three cervica l lesions（%）

表2　3組子宮頸病變中HPVl6 3′-L1及LCR基因各檢測(cè)位點(diǎn)的甲基化水平（%）Tab.2　Proportion methylation of each CpG site in 3′-L1/LCR o f HPV16 among three cervica l lesions（%）

Group CpG site in 3′-L1/LCR of HPV16 7 089　7 134　7 143　7 268　7 426　7 452 Normal/LSIL　86.07±6.23　28.32±7.11　37.49±16.22　14.54±8.60　25.50±8.88　12.35±7.80 HSIL　75.60±6.81　27.13±7.99　38.02±15.31　13.15±6.79　23.16±9.17　9.86±9.09 CC　78.72±7.39　37.70±8.37　41.43±10.71　12.63±5.16　22.61±13.52　13.91±13.55 F 6.203　5.449　0.224　0.201　0.205　0.382 P 0.006　0.010　0.800　0.819　0.816　0.686 Group　CpG site in 3′-L1/LCR of HPV16 7 458　7 532　7 550　7 673　7 679　7 691 Normal/LSIL　9.41±3.86　9.89±9.60　18.08±16.86　24.83±7.65　16.27±11.28　19.53±14.07 HSIL　9.99±5.99　10.30±12.27　16.11±19.05　22.34±6.35　15.72±9.85　16.39±13.58 CC　14.20±12.37　5.63±4.41　10.54±5.07　21.28±6.05　15.83±5.44　17.76±6.63 F 1.009　0.766　0.682　0.737　0.010　0.174 P 0.378　0.475　0.514　0.488　0.990　0.841 Group　CpG site in 3′-L1/LCR of HPV16 7 859　31　37　43　52　58 Normal/LSIL　3.71±2.33　14.76±6.94　13.12±6.70　12.73±6.87　13.66±8.21　13.22±8.30 HSIL　3.21±2.23　17.63±10.09　17.96±9.72　15.39±11.34　17.14±11.83　16.13±11.02 CC　2.82±1.93　23.60±14.66　22.14±13.69　22.22±14.61　22.90±17.16　20.61±18.29 F 0.426　1.670　1.848　1.848　1.302　0.792 P 0.657　0.207　0.177　0.177　0.288　0.463

綜上所述，HPV16 L1基因的特定位點(diǎn)甲基化水平與子宮頸病變相關(guān)，位點(diǎn)7 089、7 134的甲基化可以作為子宮頸病變篩查的一個(gè)潛在性分子標(biāo)記物，可作為臨床上子宮頸病變?cè)\療的新依據(jù)。

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（編輯武玉欣）

Correlation between Severity ofCervicalLesionsand Methylation of Human Papilloma Virus Type16DNA

WANGWei1，LIU Jian-hua2，WANGGui-li1，QITe1，RUANQiang1，SUNZheng-rong1
（1.Virus Laboratory，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Clinical Laboratory，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveToquantifiablymeasure themethylation frequencyof18CpG sites in the3′region of L1 geneand long control region（LCR）gene of HPVl6 DNA，and study the relationship between HPVl6 DNA methylation and severity of cervical lesions.M ethodsA total of 10 cases Normal/low-grade squamous intraepithelial lesion（Normal/LSIL），10 cases of high-grade squamous intraepithelial lesion（HSIL），and 10 cases of cervical cancer（CC）were recruited for the study.The relationship between severity of cervical lesions and HPV16 DNA methylation was analyzed bybisultlte-pyrosequencing.Results Themethylation ratewashighestin Normal/LSILatposition7089 located in3′-L1，followed byCC.The lowest was found in HSIL.The difference in methylation percentage among the three lesions was significant（P=0.006）.In 7 134，the proportion methylationwasalsodifferentamong threegroups（P=0.01），difference inmethylation percentagebetween Normal/LSILandCC，aswellasNormal/LSIL and HSILwassignificant（P=0.038，0.017）.ConclusionThemethylation statusofCpG sites7 089 and 7 134 in the3′region of L1 gene isassociatedwith theseverityofcervicaldisease.Thequantificationof HPV DNAmethylation canbeused forcervicaldiseasescreening in clinicalsamples.

human papilloma virus16；methylation；CpG site；cervical lesion；pyrosequencing

R373.9

A

0258-4646（2016）04-0293-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171581）

王微（1989-），女，碩士研究生.

孫崢嶸，E-mail：sunzr@sj-hospital.org

2015-06-16

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