湯春波，周永，陳偉，高文波，吳齊全，周酉楓，齊勇

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型成石的影響

湯春波，周永，陳偉，高文波，吳齊全，周酉楓，齊勇

目的觀察不同劑量表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對(duì)大鼠腎結(jié)石模型成石的影響。方法50只雄性SD大鼠分為5組，A組為空白對(duì)照組；B組為單純成石組，采用1%乙二醇及2%氯化銨進(jìn)行配制成的造石液2ml灌胃；C、D及E組均為EGCG干預(yù)組，分別在B組處理方法的基礎(chǔ)上每天予10、30及50 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃處理；均連續(xù)進(jìn)行28 d。取右腎組織測(cè)定丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平；左腎冰凍切片，偏光顯微鏡觀察結(jié)晶情況。結(jié)果B組較A組腎組織MDA濃度顯著增高，而SOD、GSH-Px、CAT濃度顯著降低（均＜0.01）。與B組比較，C、D及E組腎組織MDA水平降低及SOD水平增加（均＜0.01）。腎組織結(jié)晶與EGCG治療劑量呈負(fù)相關(guān)（=―0.483，＜0.01）。結(jié)論過氧化損傷是導(dǎo)致高草酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的主要機(jī)制和結(jié)石形成的主要途徑；EGCG可減輕機(jī)體的過氧化損傷，降低形成腎結(jié)石的危險(xiǎn)性。

泌尿系統(tǒng)結(jié)石；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；大鼠

泌尿系統(tǒng)結(jié)石是常見病，且治療后復(fù)發(fā)率居高不下。據(jù)報(bào)道，男性泌尿系統(tǒng)結(jié)石復(fù)發(fā)率為70%～80%，女性為47%～60%，其復(fù)發(fā)率高的原因主要是未對(duì)結(jié)石病因進(jìn)行有效的治療。在泌尿系結(jié)石中，草酸鈣是最常見的類型，多項(xiàng)研究表明其與自由基過度產(chǎn)生及氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致草酸鈣結(jié)石發(fā)生的重要原因［1］，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）具有較強(qiáng)的抗氧化生物學(xué)活性。本研究以乙二醇聯(lián)合氯化銨制作大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型，并用不同劑量EGCG進(jìn)行干預(yù)，觀察腎組織中的結(jié)晶沉積情況，同時(shí)檢測(cè)腎組織內(nèi)丙二醛（MDA）、抗氧化酶濃度，以更進(jìn)一步探討草酸鈣腎結(jié)石形成機(jī)制及尋求抑制其形成的方法。報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1動(dòng)物及分組雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量190～210 g，由浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分為5組。A組為空白對(duì)照組，繼續(xù)使用標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)飼料及純凈水飼養(yǎng)；B組為單純成石組，采用1%乙二醇及2%氯化銨進(jìn)行配制成的造石液2 ml灌胃；C組為低劑量EGCG干預(yù)組，在B組處理方法的基礎(chǔ)上每天予 10 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃處理；D組為中劑量EGCG干預(yù)組，在B組處理方法的基礎(chǔ)上每天予30 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃處理；E組為高劑量EGCG干預(yù)組，在B組處理方法的基礎(chǔ)上每天予50 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃處理；均連續(xù)進(jìn)行28 d。

1.2檢測(cè)指標(biāo)與方法采用過量 10%水合氯醛腹腔注射處死大鼠，將大鼠處死后剖開腹腔暴露腎臟，小心鉗夾并取出雙側(cè)腎臟，左側(cè)腎臟以10%中性甲醛溶液固定，經(jīng)過脫水、透明以及石蠟包埋等過程后，制成厚度為4 m的腎臟組織切片進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)腎臟組織進(jìn)行觀察。主要觀察對(duì)象為游離結(jié)石、結(jié)晶沉淀物以及鈣化斑等病理改變，可根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)草酸鈣結(jié)石嚴(yán)重程度進(jìn)行觀察：腎皮質(zhì)、髓質(zhì)及腎乳頭形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見顯著的結(jié)晶沉淀物及腎結(jié)石計(jì)0分；腎臟皮質(zhì)及髓質(zhì)內(nèi)可見散在的、少量的結(jié)晶沉淀計(jì)1分；腎盂、腎皮質(zhì)以及髓質(zhì)內(nèi)可見明顯的游離結(jié)晶以及結(jié)晶沉淀物計(jì)2分；可見腎盂擴(kuò)張積水、腎乳頭部位可見鈣化斑、腎皮質(zhì)及髓質(zhì)內(nèi)可見較多結(jié)晶計(jì)3分；腎盂明顯擴(kuò)張積水、腎乳頭部位可見鈣化斑、腎皮質(zhì)及髓質(zhì)內(nèi)可見大量結(jié)晶并伴有游離結(jié)石形成計(jì)4分?？偡譃楦鹘Y(jié)晶等級(jí)×相對(duì)應(yīng)的結(jié)晶結(jié)果數(shù)目之和。

取右側(cè)腎臟以玻璃勻漿器經(jīng)精細(xì)研磨后，制備組織制成勻漿。用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定丙二醛（MDA）含量：MDA可與TBA化合呈粉紅顯色反應(yīng)，測(cè)其吸光度A值，以四乙氧基丙烷作為標(biāo)準(zhǔn)品，可推算出MDA含量；用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）活性：黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶作用下可生成O2－，SOD可催化O2－與H+反應(yīng)生成H2O2，通過測(cè)定管與對(duì)照管比較吸光度，計(jì)算出樣品中SOD活性；采用紫外分光光度法測(cè)定過氧化氫酶（CAT）活性：CAT在一定條件下可直接分解其底H2O2，相應(yīng)的吸光度降低，以每克血紅蛋白中或每毫克組織蛋白中CAT每秒分解過氧化氫的相對(duì)量為一個(gè)活力單位，計(jì)算 CAT活力；采用 2-硝基苯甲酸（DTNB）比色法測(cè)定谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）活性：GSH-Px活力用催化GSH氧化的反應(yīng)速度表示。GSH和DTNB反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成5-二硫代2-硝基苯甲酸陰離子，測(cè)定其濃度，即可算出GSH減少量。

1.3統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用檢驗(yàn)，多重比較采用檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性比較B組較A組腎組織MDA濃度顯著增高，而SOD、GSH-Px、CAT濃度顯著降低（均＜0.01）。與B組比較，C、D及E組腎組織MDA水平降低及SOD水平增加（均＜0.01）。見表1。

2.2草酸鈣結(jié)晶沉積情況大體標(biāo)本上看，B組大鼠腎臟與A組相比腫脹明顯，剖面皮質(zhì)及髓質(zhì)之間分界不清，觸之有明顯的砂粒感；而經(jīng)EGCG治療后腎臟大體形態(tài)與對(duì)照組差別不明顯。通過對(duì)腎組織切片HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)結(jié)石組大鼠腎盂明顯擴(kuò)張，腎臟皮質(zhì)及髓質(zhì)內(nèi)可見結(jié)晶及結(jié)石形成，而經(jīng)EGCG治療后上述病理變化明顯減輕。腎組織結(jié)晶與EGCG治療劑量呈負(fù)相關(guān)（=―0.483，＜0.01）。見表2。

表1　5組MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性比較

表2　各組大鼠腎組織草酸鈣結(jié)晶等級(jí)評(píng)分

3　討論

腎結(jié)石可引起梗阻的導(dǎo)致腎積水以及繼發(fā)尿路感染，嚴(yán)重者可導(dǎo)致腎功能衰竭及尿源性膿毒血癥的發(fā)生，而腎結(jié)石成分最主要類型是草酸鈣結(jié)石。因此探求腎臟草酸鈣結(jié)石的形成的具體機(jī)制從而尋求抑制其生成或復(fù)發(fā)的方法具有重要意義。草酸鈣腎結(jié)石的病因復(fù)雜，到目前為止對(duì)其了解的程度仍十分有限，在控制草酸鈣腎結(jié)石的罹患率和復(fù)發(fā)率方面，仍未達(dá)到令人滿意的效果。

乙二醇法是近年較常用的制造草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型方法，以作為草酸的前體物質(zhì)，乙二醇在進(jìn)入體內(nèi)后，可在羥乙酸氧化酶的作用下生成乙醛酸，后者可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為草酸，此時(shí)動(dòng)物尿中草酸濃度增加。正常情況下腎小管尿液中新生的草酸鈣結(jié)晶很快被尿流沖走，無法停留聚集形成結(jié)石。在結(jié)石形成過程中草酸鈣結(jié)晶滯留在腎小管內(nèi)是必要的前提條件［2］。高濃度尿草酸能使腎小管上皮產(chǎn)生大量的自由基，而組織中的抗氧化酶水平和活性顯著降低。為這種氧自由基增加引起的脂質(zhì)過氧化，是細(xì)胞損傷的直接原因［3］。由于氧自由基與生物膜系統(tǒng)的不飽和脂肪酸具有高度親和性，兩者結(jié)合后使膜的不飽和脂肪酸與蛋白質(zhì)比例失調(diào)，膜的液態(tài)性、流動(dòng)性及通透性均隨之發(fā)生變化，最終造成膜的功能障礙。腎小管上皮細(xì)胞膜受損，使草酸鈣結(jié)晶能黏附于腎小管內(nèi)壁，進(jìn)而形成結(jié)石［4］。Grases等［5］在體外通過模擬腎臟的條件，證明自由基可引起上皮細(xì)胞損傷，產(chǎn)生一個(gè)有利于晶體生長(zhǎng)的環(huán)境，而抗氧化劑可抑制草酸鈣晶體的形成?？梢娺^氧化損傷是導(dǎo)致高草酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的主要機(jī)制和結(jié)石形成的主要途徑［6］。本研究草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型腎臟組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)大鼠腎皮質(zhì)及髓質(zhì)內(nèi)均有大量草酸鈣結(jié)晶形成，同時(shí)發(fā)現(xiàn)腎組織中丙二醛濃度升高，而抗氧化酶活性降低，說明該腎結(jié)石大鼠模型在草酸鈣結(jié)石形成過程中氧化應(yīng)激扮演了重要的角色。

茶多酚是綠茶提取物中多酚類物質(zhì)的總稱，具有多種較強(qiáng)的抗氧化生物學(xué)活性成分，如黃酮類、兒茶素、酚酸類以及花色苷類等［7］。兒茶素是黃烷醇的衍生物之一，可分為四類，茶多酚以EGCG含量最高［8］。EGCG分子量為458.4，結(jié)構(gòu)式為C22H18O11，其分子結(jié)構(gòu)中的三羥基結(jié)構(gòu)B環(huán)與其抗氧化能力有關(guān)。綠茶多酚其活性成分主要包括表EGCG可通過其抗氧化能力對(duì)腎組織損傷起保護(hù)作用。使用EGCG處理輸尿管閉塞動(dòng)物，腎組織中活性氧水平顯著下降，組織損傷明顯減輕，同時(shí)能夠明顯延緩腎功能下降的發(fā)生。在狼瘡腎炎動(dòng)物中使用EGCG，其腎功能、尿蛋白以及腎組織病理損傷較腎炎小鼠顯著改善［9］。以上文獻(xiàn)回顧結(jié)合氧化應(yīng)激在泌尿系草酸鈣結(jié)石的發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，推測(cè)具有抗氧化及保護(hù)腎臟作用的EGCG很可能對(duì)對(duì)草酸鈣腎結(jié)石形成具有抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)用不同劑量EGCG干預(yù)草酸鈣腎結(jié)石動(dòng)物大鼠模型成石，結(jié)果大鼠腎組織中的MDA顯著低于成石組，而抗氧化酶濃度均顯著高于成石組。腎組織中的結(jié)晶沉積情況亦隨EGCG劑量增加逐漸減少，兩者呈負(fù)相關(guān)。此結(jié)果進(jìn)一步說明氧化應(yīng)激在泌尿系草酸鈣結(jié)石的發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，而EGCG可以明顯減少誘石劑誘導(dǎo)的大鼠腎草酸鈣結(jié)石的形成。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.04.045

R692.5

A

1671-0800（2016）04-0502-03

2015-11-10

（本文編輯：鐘美春）

寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013A610267）

315100寧波，寧波市泌尿腎病醫(yī)院

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