王　偉，田　浪，甘振磊，劉　琪，安欣宇，周如月，王貴平，馮曉聲*

(1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣東廣州 511400；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣東廣州 511400)

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鴨坦布蘇病毒在感染蛋鴨卵巢、脾臟及泄殖腔的分布規(guī)律

王偉1△，田浪2△，甘振磊1，劉琪1，安欣宇1，周如月1，王貴平1，馮曉聲1*

(1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣東廣州 511400；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣東廣州 511400)

探討鴨坦布蘇病毒在感染蛋鴨卵巢、脾臟及泄殖腔分布規(guī)律，為疫苗研究和篩選提供參考依據(jù)，選用210只200日齡～220日齡無鴨坦布蘇病毒感染的蛋鴨，隨機(jī)分為7組，1組～6組腿部肌肉注射鴨坦布蘇病毒液，7組腿部肌肉注射生理鹽水作為對(duì)照組，攻毒后每天觀察臨床癥狀，分別于感染后第2、5、8、11、16、21天分6批次處死，取脾臟、卵巢及泄殖腔進(jìn)行病毒分布情況檢測(cè)。結(jié)果顯示，攻毒后蛋鴨采食量、產(chǎn)蛋率均降低，并排有綠色糞便；剖檢發(fā)現(xiàn)脾臟充血、腫大，卵巢萎縮，卵泡破裂，個(gè)別出現(xiàn)卵黃性腹膜炎；通過RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間段卵巢、脾臟、泄殖腔等帶排毒情況，并結(jié)合卵巢病變情況，可知本次試驗(yàn)中不同感染劑量的鴨坦布蘇病毒在卵巢和脾臟內(nèi)分別在第11天和第5天帶毒最多，為今后疫苗的研制及免疫效果判定提供了依據(jù)。

鴨坦布蘇病毒；體內(nèi)分布；蛋鴨

鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是2010年以來在我國大部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)的主要危害蛋鴨、種鴨、種鵝、蛋雞、雛鴨等的新發(fā)病毒，它屬于黃病毒科、黃病毒屬[1-4]。主要侵害鴨的生殖系統(tǒng)[5]，致使種(蛋)鴨發(fā)熱，采食量和產(chǎn)蛋量急劇下降，可從產(chǎn)蛋高峰迅速下降至20%～30%，甚至停止產(chǎn)蛋，發(fā)病率幾乎100%，死淘率為0～12%[6-7]，對(duì)我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，目前市場(chǎng)上尚未推出疫苗來預(yù)防此病。蛋鴨、蛋雞和肉鴨感染DTMUV后，病毒主要分布在卵巢[8-10]、脾臟[11]等組織器官，且檢出率最高，剖檢病變主要為卵泡變性萎縮、卵泡出血和卵泡液化，個(gè)別出現(xiàn)卵黃性腹膜炎，脾臟充血、腫大等[8-13]。為了有效預(yù)防鴨坦布蘇病毒病，為今后評(píng)價(jià)疫苗、抗病毒藥等免疫保護(hù)與防治效果方面提供依據(jù)，探討感染不同攻毒劑量鴨坦布蘇病毒蛋鴨的卵巢、脾臟及泄殖腔帶排毒情況具有重要意義。本試驗(yàn)選擇尚未發(fā)生過此病的蛋鴨人工感染DTMUV，通過RT-PCR方法檢測(cè)不同攻毒劑量對(duì)蛋鴨的卵巢、脾臟、泄殖腔等感染情況，并結(jié)合蛋鴨卵巢的病理變化，確定該病毒攻毒后在蛋鴨的感染規(guī)律。通過該病毒在體內(nèi)的主要靶器官的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及排毒途徑，也為該病的防控提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株與試驗(yàn)用動(dòng)物鴨坦布蘇病毒由廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院在廣東省內(nèi)分離、鑒定、保存。200日齡～220日齡產(chǎn)蛋麻鴨購自廣東某養(yǎng)鴨場(chǎng)。

1.1.2主要試劑RNA提取試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑，TOYOBO公司產(chǎn)品；DNA Maker DL 2 000、2×Taq-Neo PCR預(yù)混液，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1病毒ELD50的測(cè)定病毒在Vero細(xì)胞增殖后，取適量病毒經(jīng)10倍稀釋后接種9日齡SPF雞胚，每天觀察，棄掉24 h內(nèi)死亡雞胚，接種5 d后統(tǒng)計(jì)各組死亡雞胚數(shù)，測(cè)定病毒滴度。1.2.2試驗(yàn)動(dòng)物分組與攻毒210只200～220日齡無鴨坦布蘇病毒感染的蛋鴨，預(yù)飼1周，攻毒前經(jīng)檢測(cè)鴨坦布蘇病毒及其抗體均為陰性。隨機(jī)分成7組，每組各30只。1組～6組腿部肌肉注射鴨坦布蘇病毒液，7組腿部肌肉注射生理鹽水作為對(duì)照組，每只蛋鴨注射劑量為1 mL(表1)。每組隔離分開飼養(yǎng)，攻毒后每天觀察臨床癥狀，分別于感染后2、5、8、11、16、21 d分6批次處死取病料，每次每組隨機(jī)挑選5只，放血處死。取脾臟、卵巢以及泄殖腔拭子等樣品置-20℃凍存，采用RT-PCR方法檢測(cè)病毒。

表1　分組及攻毒情況

1.2.3大體病理學(xué)觀察處死蛋鴨，觀察脾臟、卵巢等組織病理變化。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)

1.2.4.1引物的設(shè)計(jì)與合成按文獻(xiàn)[14]報(bào)道的序列合成了1對(duì)擴(kuò)增結(jié)構(gòu)蛋白(囊膜蛋白E)保守序列的引物。引物序列為：上游引物 P1：5′-GCTACGGAATTAGCGGTTGT-3′，下游引物P2：5′-TAATCCTCCATCAGCGGTGTAG-3′，擴(kuò)增目的片段大小為401 bp。

1.2.4.2病毒RT-PCR檢測(cè)按照RNA提取試劑盒(OMEGA)說明書提取病毒RNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的RT-PCR方法對(duì)脾臟、卵巢、泄殖腔糞便進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1病毒的滴度

增殖的病毒在9日齡SPF雞胚上測(cè)定的病毒滴度為105.5ELD50/mL。

2.2臨床癥狀及剖檢變化

2.2.1臨床癥狀1組試驗(yàn)鴨攻毒后2 d，采食量、產(chǎn)蛋率均開始下降，并排有綠色糞便；第5天采食顯著下降，產(chǎn)蛋率為0；第8天和第11天采食量依然低下，產(chǎn)蛋率為0，第16天采食量開始逐漸增加，卵巢病變逐漸減輕，但仍未產(chǎn)蛋。2組和3組癥狀與1組情況相似，4組、5組、6組癥狀則依次減輕，在第11天采食量開始逐漸增加，卵巢病變逐漸減輕，但仍未產(chǎn)蛋。對(duì)照組無任何肉眼可見癥狀變化。

2.2.2剖檢變化1組試驗(yàn)鴨攻毒后2 d剖檢，脾臟腫大、充血成斑駁狀；卵巢萎縮(圖1)。其他各組試驗(yàn)鴨脾臟出血，卵黃液化(圖2)，卵巢病變程度依次減輕。攻毒后5 d脾臟萎縮，卵泡破裂、卵黃液化(圖3)。其他各組試驗(yàn)鴨攻毒后5 d，脾臟輕微腫大，卵巢病變多以卵黃液化為主，個(gè)別鴨卵巢萎縮(圖4)。攻毒后8 d脾臟輕微腫大，卵巢萎縮似“葡萄狀”(圖5)。其他各組脾臟腫大，卵巢萎縮，卵泡破裂，卵黃液化。攻毒后11 d，1組試驗(yàn)鴨卵巢萎縮，卵泡發(fā)育受到抑制，卵泡出現(xiàn)壞死(圖6)。2組和3組卵巢持續(xù)成萎縮狀態(tài)，卵泡發(fā)育受到抑制。4組、5組和6組個(gè)別卵巢已有成型的卵泡形成。7組無肉眼可見癥狀。

2.3病毒RT-PCR檢測(cè)

攻毒后不同時(shí)間各組樣品PCR檢測(cè)及卵巢病變統(tǒng)計(jì)結(jié)果表2。

圖1　卵巢萎縮，脾臟充血、腫大

圖2　脾臟出血，卵黃液化

圖3　脾臟萎縮，卵泡破裂、卵黃液化

圖4　卵泡破裂、卵黃液化

圖5　脾臟輕微腫大，卵巢萎縮似“葡萄狀”

圖6　卵泡出現(xiàn)壞死

組別Groups攻毒后時(shí)間/dTimeafterchallenge2泄殖腔拭子Cloacalswabs脾臟Spleen卵巢Ovary卵巢病變Ovarianlesion5泄殖腔拭子Cloacalswabs脾臟Spleen卵巢Ovary卵巢病變Ovarianlesion8泄殖腔拭子Cloacalswabs脾臟Spleen卵巢Ovary卵巢病變Ovarianlesion第1組Group11/55/55/50/50/55/55/50/50/54/55/50/5第2組Group21/55/55/50/50/55/55/50/50/54/55/50/5第3組Group33/55/55/50/50/55/55/50/50/54/55/50/5第4組Group42/55/55/50/50/55/54/50/50/55/55/50/5第5組Group50/55/51/52/51/55/55/50/50/55/54/50/5第6組Group60/54/53/51/51/55/55/50/50/54/55/50/5第7組Group70/50/50/55/50/50/50/55/50/50/50/55/5組別Groups攻毒后時(shí)間/dTimeafterchallenge11泄殖腔拭子Cloacalswabs脾臟Spleen卵巢Oary卵巢病變Ovarianlesion16泄殖腔拭子Cloacalswabs脾臟Spleen卵巢Ovary卵巢病變Ovarianlesion21泄殖腔拭子Cloacalswabs脾臟Spleen卵巢Ovary卵巢病變Ovarianlesion第1組Group10/54/55/50/50/52/50/52/50/50/50/55/5第2組Group20/54/55/50/50/50/50/53/50/50/50/53/5第3組Group30/51/55/50/50/50/50/51/50/50/50/54/5第4組Group40/54/55/53/51/52/51/53/50/50/50/54/5第5組Group50/54/55/51/50/50/50/52/50/50/50/52/5第6組Group60/53/55/52/50/50/50/54/50/50/50/54/5第7組Group70/50/50/55/50/50/50/55/50/50/50/55/5

注：a/5(a=0,1,2,3,4,5)：表示陽性百分?jǐn)?shù)；卵巢有病變?yōu)椤?”，包括卵巢萎縮、壞死；有成型卵形成為“1”。

Note：a/5(a=0,1,2,3,4,5) indicates a positive percentage; ovary lesion as“0”, including ovarian atrophy and necrosis; forming follicle as“1”.

從表2可以看出，攻毒后第2天，1、2、3、4組泄殖腔拭子可部分檢出病毒，5、6組在第5天可檢出部分病毒，3組泄殖腔拭子檢出率最高，占60%。1、2、3組在攻毒后第2、5、8、11天陽性檢出樣本占100%，且攻毒后第11天，攻毒各組卵巢陽性檢出率最高，均達(dá)100%，4、5、6組在攻毒后第2、5、8天陰性檢出樣本占20%～80%。4組和5組在攻毒后第2、5、8天脾臟陽性檢測(cè)率最高，均達(dá)100%，1、2、3組在第8天陽性檢出率均下降20%。1、2、3組在攻毒后第2、5、8、11天，卵巢均有病變發(fā)生，發(fā)生率占100%，4組在第11天卵巢病變開始減少，5、6組則在第2天和第11天有部分成型卵形成。

3　討論

黃病毒屬的成員能引起多種動(dòng)物和人發(fā)病，且多數(shù)是由蚊和蜱等吸血昆蟲的叮咬而傳播[15-16]。我國南方流行的登革熱主要通過庫蚊進(jìn)行傳播。鴨坦布蘇病毒屬于黃病毒屬的成員，其潛在的危害有待進(jìn)一步研究。本研究關(guān)于試驗(yàn)動(dòng)物和日齡的選擇，主要針對(duì)此病對(duì)產(chǎn)蛋鴨的卵巢功能造成嚴(yán)重?fù)p害，使產(chǎn)蛋量急劇下降，故選擇200日齡～220日齡的開產(chǎn)蛋鴨作為試驗(yàn)對(duì)象。

陳雷等[17]研究表明，人工感染13日齡的雛麻鴨，1 d后即向外界排毒，一直持續(xù)到25 d。本試驗(yàn)從蛋鴨泄殖腔拭子的檢測(cè)結(jié)果來看，3組攻毒劑量的發(fā)病蛋鴨泄殖腔拭子在第2 天陽性檢出率最高，占60%，之后均未檢出陽性。其他攻毒組在第2天可檢出部分陽性，第5天至21天偶有樣品檢出陽性。以上結(jié)果顯示鴨坦布蘇病毒感染初期能經(jīng)糞便排毒，但不是最主要的排毒方式，相對(duì)于日齡較小的雛鴨，可能因其機(jī)體免疫功能尚未成熟，導(dǎo)致其排毒時(shí)間較開產(chǎn)蛋鴨長。

林健等[10]選擇經(jīng)鴨胚尿囊液培養(yǎng)的DHOV-HB株(F4代)病毒以每只約104個(gè)ELD50的劑量經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼和口服途徑感染15只產(chǎn)蛋鴨，接毒后7 d卵泡膜、脾臟可分離到病毒，感染后9 d從卵泡膜中可分離到病毒，經(jīng)證實(shí)此病對(duì)產(chǎn)蛋鴨生殖系統(tǒng)的損害最為嚴(yán)重。于春梅等[18]也證實(shí)此病感染產(chǎn)蛋雞后9 d，只在卵泡膜分離到病毒，主要影響蛋雞的生殖系統(tǒng)。周曉波等[11]選擇鵝源坦布蘇JS804株病毒建立了35日齡櫻桃谷肉鴨感染鴨坦布蘇病毒病的發(fā)病模型，并確定了最佳攻毒劑量為1.6×106TCID50，攻毒后第8天發(fā)病最嚴(yán)重，且病毒含量最高的器官是脾臟。本試驗(yàn)結(jié)合鴨坦布蘇病毒病在蛋鴨的主要分布情況，對(duì)卵巢和脾臟的帶排毒情況進(jìn)一步探討。通過對(duì)卵巢和脾臟鴨坦布蘇病毒的檢測(cè)，從表2可以看出，1、2、3組在攻毒后第2天至第11天卵巢檢出率最高，且均能達(dá)到100%，4、5、6組在攻毒后第2、5、8天陰性檢出樣本占20%～80%，但各組卵巢在攻毒后11 d檢出率均為100%。1組和2組在第8～11天時(shí)脾臟檢出率均為80%，3組脾臟在第8天時(shí)檢出率為80%，在第11天為20%，第16天和第21天均未檢測(cè)出陽性，4組和5組在攻毒后第2、5、8天陽性檢出率均為100%，之后逐漸轉(zhuǎn)為陰性，但各組脾臟在攻毒后第5天檢出率均為100%。以上數(shù)據(jù)顯示，不同攻毒劑量對(duì)蛋鴨卵巢、脾臟的感染，分別在第11天和第5天陽性檢出率最高。

臨床上，蛋鴨感染鴨坦布蘇病毒后，病理變化主要表現(xiàn)脾臟充血、腫大；卵泡出血、變性、破裂，可造成卵黃性腹膜炎。為了進(jìn)一步證實(shí)不同攻毒劑量對(duì)蛋鴨卵巢的感染情況，通過肉眼觀察臨床病變，為今后疫苗的免疫效果判定提供間接依據(jù)，本試驗(yàn)通過對(duì)不同攻毒劑量的發(fā)病蛋鴨剖檢觀察大體病理變化，從表2可以看出，攻毒各組在第5天和第8天卵巢仍處在萎縮或壞死等現(xiàn)象，發(fā)生率均為100%。1、2、3組攻毒后第11天卵巢仍存在萎縮，無正常發(fā)育卵泡形成，隨著攻毒劑量的降低，4、5、6組卵巢病變從第11天開始逐漸恢復(fù)，攻毒后21 d仍尚未開始產(chǎn)蛋，而臨床上鴨坦布蘇病毒整個(gè)發(fā)病周期約為30 d左右，本次試驗(yàn)從時(shí)間上看，攻毒起始至卵巢機(jī)能逐漸恢復(fù)基本與臨床發(fā)病過程相吻合。綜上所述，本次試驗(yàn)不同感染劑量的DTMUV在卵巢和脾臟中分別在第11天和第5天帶毒最多，為今后疫苗的研制及免疫效果判定提供了依據(jù)。

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Study on Distribution of DTMUV in Ovaries,Spleen and Cloaca of Layer Ducks

WANG Wei1，TIAN Lang2，GAN Zhen-lei1，LIU Qi1，AN Xin-yu1，ZHOU Ru-yue1，WANG Gui-ping1，F(xiàn)ENG Xiao-sheng1

(1.Guangdong Haid Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Guangzhou，Guangdong，511400，China；2.GuangdongHaidGroupCo.,Ltd，Guangzhou，Guangdong，511400，China)

This study mainly discussed the distribution regulation of DTMUV in ovary,spleen and cloaca of infected layer ducks for the reference basis of vaccine research and screening.This study selected 210 layer ducks with the age of 200-220 days and non-infected DTMUV were randomly divided into 7 groups,1-6 groups with intramuscular injection of DTMUV,control group with normal saline. The clinical symptoms were observed after challenge.After infection in 2,5,8,11,16,21 days, the ducks were killed and the spleen,ovary and cloaca were collected.The results of this experiment revealed that layer ducks were lower in the intakes and laying rates after challenge.The autopsy found that spleen hyperemia,swelling,shrunken oaries,ruptured follicle,and yolk peritonitis occurred.RT-PCR was used to detect the virus contents in ovaries,spleens and cloaca of infected ducks in different time, and combined with ovarian lesions.The results showed that DTMUV contents in the ovaries and spleen were the most in 11th day and 5th day. The study laid the foundation for the future development and immune effect determination of vaccines.

Duck Tembusu virus;invivodistribution;layer duck

2016-01-05

廣州市番禺區(qū)珠江科技新星專項(xiàng)項(xiàng)目(2013-專15-6.07)

王偉(1988-)，男，安徽亳州人，碩士，主要從事禽類傳染病研究。△同等貢獻(xiàn)作者 *通訊作者

858.32;S852.659.6

A

1007-5038(2016)08-0065-05