王麗娟

(遼寧職業(yè)學(xué)院，遼寧鐵嶺 112099)

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鐵嶺某奶牛場牛乳房炎乳汁中金黃色葡萄球菌的分離鑒定與藥敏試驗

王麗娟

(遼寧職業(yè)學(xué)院，遼寧鐵嶺 112099)

為了解鐵嶺某奶牛場牛乳房炎乳汁中金黃色葡萄球菌的感染情況及對常用藥物的敏感性，采集該牛場20頭奶牛30份乳房炎的乳樣進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離鑒定，并選取臨床應(yīng)用最廣泛的12種抗菌藥物的自制藥敏片和商品化標(biāo)準(zhǔn)藥敏片，采用圓紙片瓊脂擴散法(K-B法)進(jìn)行藥敏試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離到的16株致病性金黃色葡萄球菌，對青霉素鈉、土霉素、氨芐西林鈉、阿莫西林鈉及紅霉素等藥物具有不同程度的耐受性，建議停用；對硫酸卡那霉素、硫酸鏈霉素、鹽酸林可霉素等中度敏感，可交替臨床用藥；對乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻呋及硫酸慶大霉素等高度敏感，可用于治療奶牛乳房炎的臨床用藥。本研究結(jié)果為該牛場對乳房炎金黃色葡萄球菌感染的診斷及治療藥物的選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

乳房炎；金黃色葡萄球菌；藥敏試驗；奶牛

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中最常見、危害最嚴(yán)重、最難防控的疾病之一，不僅影響奶牛的產(chǎn)乳量和乳品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟損失，而且還威脅人類健康，影響公共食品衛(wèi)生安全[1]。引起奶牛乳房炎的主要原因是多種非特定病原微生物的感染，其中以致病性金黃色葡萄球菌感染最為常見，發(fā)病率最高，且在奶牛泌乳期間最易感染，多呈慢性經(jīng)過[2]。該屬細(xì)菌易變異，對常用的多種抗生素易產(chǎn)生耐藥性，增加了乳房炎的防治難度[3]。本研究對鐵嶺某奶牛場乳房炎患牛樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離鑒定及分離菌常用藥物的敏感性檢測，旨在對該地區(qū)奶牛金黃色葡萄球菌性乳房炎的診斷及治療藥物的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器設(shè)備超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌器，干熱滅菌箱，冰箱，生物顯微鏡，恒溫培養(yǎng)箱，離心機，可調(diào)式移液器，電子天平，打孔機，游標(biāo)卡尺等。

1.1.2培養(yǎng)基及主要試劑營養(yǎng)瓊脂、50 mL/L綿羊鮮血瓊脂、卻蒲曼瓊脂、麥康凱瓊脂、M-H瓊脂平板和營養(yǎng)肉湯(100 mL/L犢牛血清)，用前自行配制；革蘭染色液、無菌生理鹽水、蒸餾水、30 mL/L過氧化氫；葡萄球菌乳膠凝集檢測試劑盒，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；葡萄球菌屬生化鑒定管、麥?zhǔn)媳葷峁?、?biāo)準(zhǔn)藥敏片，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；自制藥敏片，選擇當(dāng)?shù)嘏R床上常用的獸用抗菌藥物(鹽酸頭孢噻呋乳房注入劑、注射用氨芐西林鈉、注射用阿莫西林鈉、注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素注射液、土霉素子宮注入劑、鹽酸林可霉素注射液、恩諾沙星注射液、乳酸環(huán)丙沙星注射液、硫酸卡那霉素注射液、注射用乳糖酸紅霉素)實驗室自行制備。

1.1.3樣品來源鐵嶺某奶牛場20頭臨床型乳房炎奶?；疾∪閰^(qū)的乳樣30份。其中有10頭奶牛為2個患病乳區(qū)，其余均為1個患病乳區(qū)，各患病乳區(qū)分別采集乳樣。

1.2方法

1.2.1干燥藥敏片的制備

1.2.1.1濾紙片的制備選用質(zhì)量較好的定性濾紙，用打孔機打成直徑為6 mm的圓形紙片，每100片為1份，置于潔凈的小平皿中，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后，放入60℃干燥箱中烘干備用。

1.2.1.2藥液的配制選擇當(dāng)?shù)嘏R床上常用的12種獸用抗菌藥物，按照藥物說明，根據(jù)不同藥物每片藥敏紙片的純藥物含量要求和抗菌藥物原液(粉)中藥物的百分含量，計算出制備1份即100片藥敏紙片需要的抗菌藥物原液(粉)的重量。每片藥敏紙片的純藥物含量參照美國CLSI藥敏試驗法規(guī)(表1)。

精確稱取各抗菌藥物后，用無菌蒸餾水或磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，將各藥稀釋至所需濃度，如氨芐西林鈉1 mg/mL、環(huán)丙沙星0.5 mg/mL、紅霉素1.5 mg/mL等。

為驗證本文方法在的可行性和有效性，選取條紋密度較高的模擬工程實踐中出現(xiàn)的4倍peaks(512 pixel×512 pixel)函數(shù)進(jìn)行仿真，結(jié)果如圖2.

1.2.1.3含藥紙片的制備按每片濾紙片飽和吸水量(一般每片吸收0.01 mL)計算，加入稀釋后的藥液。無菌吸取氨芐西林鈉等稀釋后的抗菌藥液各1 mL，分別加入裝有100片濾紙片的小平皿中，事先將濾紙片攤開，充分浸濕并不時翻動，浸泡1 h～2 h，置于37℃溫箱中2 h～3 h烘干并分裝于無菌容器中密封后，4℃冰箱保存，不超過1個月。置-20℃冰箱保存，有效期一般為4個～6個月。

1.2.2乳樣的采集方法乳樣采集前，先用溫水清洗乳房，再用2 mL/L新潔爾滅擦洗乳房，最后用750 mL/L酒精棉球?qū)θ轭^進(jìn)行擦拭消毒處理。采樣者同時用750 mL/L的酒精進(jìn)行手指擦拭消毒。患病的乳室先棄去頭3把乳汁，以排除污染的雜菌，每個病例取乳樣約5 mL于無菌帶蓋的離心管中，乳樣編號后放入冰盒中冷藏保存，及時帶回實驗室。乳樣以3 000 r/min離心10 min，棄去管中上層油脂和中層液體，留取底部的沉淀物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3乳樣中病原細(xì)菌的分離

1.2.3.1顯微鏡檢查分別取每份乳樣的沉淀物涂片、自然干燥、火焰固定、革蘭染色、油鏡下檢查，根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)初步判定樣品中細(xì)菌的類型。

1.2.3.2細(xì)菌的分離培養(yǎng)無菌操作用滅菌棉簽蘸取乳樣沉淀物適量，分別涂抹接種于營養(yǎng)肉湯(含100 mL/L血清)、營養(yǎng)瓊脂平板、50 mL/L綿羊鮮血瓊脂平板、卻蒲曼瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)24 h～48 h。觀察并記錄其培養(yǎng)特性。挑取典型菌落涂片，革蘭染色、鏡檢。根據(jù)每個平板中菌落生長的形態(tài)特征、菌體形態(tài)及染色特性初步判定細(xì)菌類屬。

1.2.3.3細(xì)菌的純培養(yǎng)挑取革蘭陽性球菌、葡萄串狀樣或短鏈樣排列的單個可疑金黃色葡萄球菌菌落移植于營養(yǎng)肉湯和瓊脂斜面培養(yǎng)基進(jìn)行純化，經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h～48 h，4℃保藏備用。24 h后無細(xì)菌生長的平板，再用相應(yīng)的增菌肉湯培養(yǎng)一次，24 h～48 h后，再作檢查，以防漏檢。將剩余的乳樣置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒓兣囵B(yǎng)的菌株再進(jìn)行涂片、革蘭染色、鏡檢。

1.2.3.4細(xì)菌的生化鑒定取上述各種純化的菌株，進(jìn)行觸酶試驗、乳膠凝聚試驗、甘露醇發(fā)酵試驗等葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定。

1.2.3.4.1觸酶試驗滴1滴30 mL/L過氧化氫溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)于潔凈的載玻片上，取菌落置于30 mL/L過氧化氫溶液中攪勻，立即觀察結(jié)果。有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性，無則為陰性。

1.2.3.4.2乳膠凝聚試驗輕輕搖勻葡萄球菌乳膠測試試劑，滴1滴測試試劑于檢測板的各反應(yīng)環(huán)內(nèi)；再用專用的攪拌棒分別挑取24 h培養(yǎng)可疑菌落少許與相應(yīng)反應(yīng)環(huán)內(nèi)的乳膠測試試劑混勻，并在整個反應(yīng)環(huán)內(nèi)涂布均勻；輕搖檢測板，在2 min內(nèi)觀察凝集結(jié)果。同時用葡萄球菌陽性對照試劑作陽性對照。

1.2.3.4.3糖發(fā)酵試驗取上述各種純化的菌株，依據(jù)葡萄球菌屬細(xì)菌的微量生化鑒定管產(chǎn)品說明進(jìn)行菌種鑒定。試驗重復(fù)2次。

1.2.3.4.4藥敏試驗根據(jù)美國NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，利用藥物圓紙片瓊脂擴散法(K-B法)，使用0.5單位麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管對金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物或菌落混懸液進(jìn)行標(biāo)定并校正(調(diào)節(jié)菌液濃度為1.5×108CFU/mL)。用無菌的棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液后，在M-H瓊脂平板表面密集均勻涂布，在平皿底部標(biāo)記藥物代號，用無菌鑷子貼上藥敏紙片，輕壓紙片使其與培養(yǎng)基表面緊密接觸。每個平板貼5張，每張紙片間距不少于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm。待紙片吸濕貼緊培養(yǎng)基后，將平皿倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)16 h～18 h取出，從平皿背面用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑大小(mm)。試驗菌株對12種抗菌藥物紙片的敏感性需參照CLSI最新版本的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，以敏感(S)、中敏(I)、耐藥(R)報告結(jié)果[4]。具體判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

自制藥敏片與商品化標(biāo)準(zhǔn)藥敏片進(jìn)行效果對比試驗，方法是把同種成分的自制藥敏片與商品化標(biāo)準(zhǔn)藥敏片放在同一培養(yǎng)皿中，觀察其抑菌效果。

表1　金黃色葡萄球菌分離株對不同抗菌藥物敏感度判定標(biāo)準(zhǔn)

2　結(jié)果

2.1染色鏡檢

可見菌體呈圓球形，直徑0.5 μm～1 μm，呈葡萄串狀、雙球或短鏈狀排列，無芽胞、莢膜，革蘭染色陽性球菌，即可懷疑為葡萄球菌。

2.2培養(yǎng)特性

營養(yǎng)肉湯渾濁，管底有少量灰白色沉淀，輕搖后全部旋起并消散；營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h～48 h后，形成圓形，直徑2 mm～3 mm，表面光滑、濕潤、隆起的金黃色菌落；卻蒲曼瓊脂平板上，菌落較大，金黃色；血液瓊脂平板上，菌落較大，呈金黃色、圓形，周圍出現(xiàn)明顯的β溶血；麥康凱瓊脂平板上，無細(xì)菌生長。挑取典型菌落涂片、革蘭染色、鏡檢，其中16株結(jié)果為陽性，呈葡萄串狀排列，無芽胞、莢膜。

2.3生化鑒定結(jié)果

2.3.1觸酶試驗陰性對照無氣泡產(chǎn)生，16株分離菌株全部出現(xiàn)氣泡，即觸酶試驗結(jié)果陽性。

2.3.2乳膠凝集試驗16株分離菌均在2 min 內(nèi)出現(xiàn)凝集，為陽性，表明測試菌落為金黃色葡萄球菌菌落。

2.3.3糖發(fā)酵試驗16株分離菌的糖發(fā)酵試驗結(jié)果見表2。

表2　糖發(fā)酵試驗結(jié)果

注:“+”表示分離菌株生化反應(yīng)呈陽性(產(chǎn)酸不產(chǎn)氣)；“-”表示呈陰性。

Note：“+” represents positive biochemical reaction for isolated strain(producing acid，not produceing gas)，“-” represents negative reaction.

根據(jù)上述結(jié)果，依據(jù)《伯吉氏細(xì)菌鑒定手冊》可知，從11頭臨床型乳房炎奶牛的16個患病乳區(qū)乳樣中分離所得的菌株均為金黃色葡萄球菌。其中有5頭奶牛的2個乳區(qū)均分離到金黃色葡萄球菌。

2.3.4藥物敏感性試驗結(jié)果16株金黃色葡萄球菌的藥物敏感試驗結(jié)果見表3，自制藥敏片與商品化標(biāo)準(zhǔn)藥敏片對分離株的抑菌效果見表4。

由表3可見，金黃色葡萄球菌分離株對青霉素鈉耐藥率高達(dá)100%，這可能與該類抗菌藥過度使用有關(guān)。對土霉素、氨芐西林鈉、阿莫西林鈉以及紅霉素耐藥率分別為75%、69%、63%、56%，建議停用或不再單獨使用；對硫酸卡那霉素、硫酸鏈霉素、鹽酸林可霉素中度敏感，可在臨床上交替用藥；對乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢噻呋鈉及硫酸慶大霉素等抗生素的敏感性較高(S>80%)，推薦將這些抗菌藥物作為所檢測奶牛場的金黃色葡萄球菌乳房炎牛的臨床用藥。

從表4可見，自制藥敏片與商品化標(biāo)準(zhǔn)藥敏片雖然有些誤差，但差異不顯著(P>0.05)，可以當(dāng)作標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片進(jìn)行臨床藥敏試驗使用。

表3　16株金黃色葡萄球菌分離株對12種抗菌藥物的敏感性試驗結(jié)果

表4　12種抗菌藥物的自制藥敏片與標(biāo)準(zhǔn)藥敏片對金黃色葡萄球菌分離株的抑菌效

注:“-”表示無標(biāo)準(zhǔn)藥敏片。

Note: “-” represents no standard drug sensitive pieces.

3　討論

金黃色葡萄球菌是一種環(huán)境型傳染性病原菌，其傳播主要發(fā)生在擠奶過程，主要通過奶牛的乳頭導(dǎo)管或乳房皮膚外傷等因素侵入乳房組織引起乳腺發(fā)生炎癥反應(yīng)。平時應(yīng)注意加強飼養(yǎng)管理、改善牛場環(huán)境、擠奶設(shè)備及牛體衛(wèi)生，加大對擠奶工的技術(shù)培訓(xùn)，提高專業(yè)素質(zhì)和責(zé)任心；嚴(yán)格按擠奶程序規(guī)范操作；及早發(fā)現(xiàn)乳房炎感染牛并及時隔離給予治療；患乳房炎的奶牛嚴(yán)禁上廳擠奶，防止交叉感染[5]。

目前，臨床上主要采用抗菌藥物治療奶牛乳房炎，使得金黃色葡萄球菌產(chǎn)生了耐藥性，以及不同地區(qū)、不同奶牛場間的金黃色葡萄球菌流行類型不同，對常用的多種抗菌藥物的敏感性有較大差異，給奶牛乳房炎的治療選擇用藥造成很大困難，因此，通過金黃色葡萄球菌分離培養(yǎng)鑒定、藥物敏感試驗檢測，篩選出最佳治療藥物及時指導(dǎo)臨床生產(chǎn)實踐非常必要。

本試驗采用臨床應(yīng)用最廣泛的12種抗菌藥物自制藥敏片與商品化標(biāo)準(zhǔn)藥敏片對乳房炎乳汁中金黃色葡萄球菌進(jìn)行敏感性對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自制藥敏片與商品化標(biāo)準(zhǔn)藥敏片結(jié)果相差不大，而且自制藥敏片制作方法簡單，成本低廉，可對各種藥物、不同生產(chǎn)廠家的藥物進(jìn)行比較，選擇最敏感、吸收好、價格低的藥物，能與牛場常用藥物完全一一對應(yīng)，比較實用，值得在基層獸醫(yī)實驗室推廣應(yīng)用。

[1]王林,梅力,韋海濤,等.北京地區(qū)奶牛隱性乳房炎金黃色葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(4):124-127.

[2]楊淑華,譚克,于立輝,等.遼寧地區(qū)奶牛臨床型乳房炎病原菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2015,35(8):1548-1552.

[3]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].4版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2007.

[4]欒智華.盤錦地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014(12):77-79.

[5]王曉,俞英.中國北方奶牛金葡菌乳房炎感染現(xiàn)狀及耐藥性和流行類型研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2015,46(8):1477-1488.

Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test of Staphylococcus aureus from Milk of Mastitis Cows in a Dairy Farm of Tieling

WANG Li-juan

(Liaoning Vocational College, Tieling,Liaoning,112099,China)

In order to know the infection ofStaphylococcusaureusin the milk produced by the cows with mastitis in a dairy farm of Tieling and its sensitivity of common used drugs，30 milk samples from 20 cows with mastitis were collected.The isolation and identification ofStaphylococcusaureuswere made.The drug sensitivity test was made by the method of the circular disc agar diffusion (K-B), the test selected the 12 kinds of drugs most widely used in clinical trials which are self made drug sensitive tablets and commercial standard sensitive tablets. The results showed that 16 strains ofStaphylococcusaureuswere isolated,and different degrees of drug resistance to penicillin sodium, oxytetracycline, ampicillin, amoxicillin and erythromycin were found,these antimicrobials should be stopped;moderately sensitive to kanamycin, streptomycin, lincomcin, these antimicrobials can be alternated between clinical medications; highly sensitive to ciprofloxacin, enrofloxacin, cefotaxime ceftiofur and gentamycin, these antimicrobials can be used for clinical medication for treatment of mastitis in dairy cows. The results of the study provided a scientific basis for diagnosis and selecting drugs for treatment of mastitis in dairy cows caused byStaphylococcusaureus.

mastitis;Staphylococcusaureus; drug sensitivity test;cow

2017年全國畜牧獸醫(yī)期刊征訂目錄

2016-03-07

王麗娟(1967-)，女，遼寧瓦房店人，副教授，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)研究。

S852.611；S857.26

B

1007-5038(2016)08-0131-05