孫鑫鵬，高善頌，韓先杰

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109)

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獺兔源銅綠假單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗

孫鑫鵬，高善頌，韓先杰*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109)

為了確定某獺兔養(yǎng)殖場獺兔發(fā)病的主要病原菌，分析該病原菌的耐藥性，本試驗對青島市某獺兔養(yǎng)殖場送檢的病死兔進(jìn)行病理剖檢，并從肺臟中分離得到1株細(xì)菌，隨后進(jìn)行分離菌形態(tài)觀察、生化試驗、細(xì)菌16 S rRNA基因測序。該株分離菌為革蘭陰性桿菌，博檢革蘭陰性細(xì)菌鑒定系統(tǒng)的生化鑒定結(jié)果為銅綠假單胞菌，細(xì)菌的16 S rRNA基因序列經(jīng)同源性比較，與銅綠假單胞菌同源性為100%。藥敏試驗結(jié)果表明該株分離菌對多種頭孢類、喹諾酮類藥物高度敏感。細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗結(jié)果為臨床用藥治療該病提供參考依據(jù)。

獺兔；銅綠假單胞菌；分離鑒定；藥敏試驗

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)又名綠膿桿菌，為假單胞菌屬細(xì)菌，具有重要的醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)學(xué)意義。目前已有多種動物發(fā)生銅綠假單胞菌病的報道[1-6],它給這些動物的養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了較大危害，但鮮有關(guān)于獺兔感染銅綠假單胞菌病的報道。2014年8月，青島市某獺兔養(yǎng)殖場獺兔發(fā)病，患兔精神沉郁，食欲減退或廢絕，呼吸困難，發(fā)病已持續(xù)2周左右，造成50余只獺兔死亡，給養(yǎng)殖場造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。為探明病因，進(jìn)一步做好該病的防治工作，本文對病死獺兔進(jìn)行了致病菌分離鑒定與藥敏試驗，以期為養(yǎng)兔場控制該病提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料某獺兔場送檢的病死獺兔，無菌采集具有明顯病變的肺臟。

1.1.2主要試劑PCR試劑(10×PCR buffer、dNTPs、DNA Marker DL 2 000、ExTaq酶)，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；博檢革蘭陰性細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；通用型柱式基因組提取試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、十六烷三甲基溴化銨瓊脂，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；綿羊鮮血瓊脂平板(80 ml/L)為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室自制。

1.1.3實驗動物小鼠，體重約20 g，購自青島大吳富城養(yǎng)殖有限公司；普通級大白兔，體重約2.0 kg，購自青島康大兔業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)無菌操作從病死兔的肺臟中分離細(xì)菌，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和綿羊鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h～24 h后觀察。挑取單個菌落進(jìn)行染色、鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)。

1.2.2生化試驗按照博檢革蘭陰性菌鑒定系統(tǒng)說明書對細(xì)菌純培養(yǎng)物進(jìn)行生化鑒定并在數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中對細(xì)菌種屬進(jìn)行確認(rèn)。

1.2.316 S rRNA基因的PCR擴增按照通用型柱式基因組提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA。參照文獻(xiàn)報道的方法合成1對用于擴增細(xì)菌16 S rRNA基因序列的引物[7]，上游引物：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；下游引物：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT -3′，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系(25 μL)：包括DNA模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ExTaq酶0.5 μL，dNTP 2.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，去離子水17.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 S，54℃ 30 S，72℃ 1.5 min，33個循環(huán)；72℃ 7 min；12℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4PCR產(chǎn)物測序與DNA序列分析純化、回收PCR產(chǎn)物，送交寶生物工程(大連)有限公司測序，利用NCBI的Blast工具將分離菌的16 S rRNA的基因序列進(jìn)行同源性比對。

1.2.5藥敏試驗參照Kirby-Bauer瓊脂擴散法進(jìn)行分離菌的藥敏試驗[8]，參照文獻(xiàn)報道進(jìn)行藥物敏感性的判定[8-9]。

1.2.6動物試驗將分離菌的純培養(yǎng)物接種于LB肉湯中37℃培養(yǎng)18 h～24 h，并計算活菌數(shù)。選取3只健康小鼠，每只腹腔注射菌液4.5×107CFU(0.25 mL菌液)；另取3只體重相近的健康小白鼠，每只腹腔注射等量滅菌LB肉湯。小鼠攻毒后連續(xù)觀察7天，記錄其臨床癥狀及死亡情況。選取6只健康普通級大白兔，3只腹腔注射菌液1.13×108CFU(2 mL菌液)，另3只實驗兔腹腔注射等量的滅菌LB肉湯作為對照，試驗兔攻毒后連續(xù)觀察3 d，記錄其死亡時間和病變。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌分離及形態(tài)觀察

分離菌株37℃培養(yǎng)18 h～24 h后，在營養(yǎng)瓊脂平板上形成中等大小的菌落，培養(yǎng)基顯淡綠色，且具有特殊的芳香氣味；在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上形成扁平、灰白色菌落；在麥康凱瓊脂平板上形成無色、半透明的小菌落；在血液瓊脂平板上，形成中心較暗、有溶血環(huán)的灰色大菌落。分離出的細(xì)菌純培養(yǎng)物接種于LB肉湯中37℃培養(yǎng)18 h～24 h后，菌液呈綠色。細(xì)菌培養(yǎng)物經(jīng)革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下可見多呈單個排列、中等大小的革蘭陰性桿菌。

2.2生化試驗結(jié)果

博檢革蘭陰性細(xì)菌鑒定系統(tǒng)生化試驗結(jié)果見表1，將細(xì)菌生化試驗結(jié)果在線輸入“博檢革蘭陰性細(xì)菌鑒定系統(tǒng)”，結(jié)果顯示“id%=98.16，T=0.98，R=59.98，銅綠假單胞菌，此鑒定結(jié)果可信賴”。

表1　分離菌株的生化試驗結(jié)果

注：“+”陽性；“-”.陰性。

Note:"+" positive;"-" negative.

2.3分離菌16 S rRNA基因的PCR擴增

分離菌16 S rRNA基因序列的PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在1 500 bp左右出現(xiàn)目的條帶(圖1)，與預(yù)期大小相符。

2.4基因測序分析

利用NCBI的BLAST工具與數(shù)據(jù)庫中登錄的序列進(jìn)行了同源性比對分析，結(jié)果顯示該菌株與銅綠假單胞菌序列(GenBank序列號KM386632)同源性為100%，因此可確定分離菌株為銅綠假單胞菌。

2.5藥敏試驗

分離菌各種藥敏紙片的抑菌直徑測量結(jié)果見表2。結(jié)果表明該株分離菌對頭孢他啶、環(huán)丙沙星等多種藥物高度敏感，對恩諾沙星和新霉素中度敏感，對卡那霉素等藥物耐藥。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.分離菌；2.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1.Isolated bacterial strain;2.Negative control

圖1　PCR擴增分離菌16 S rRNA基因結(jié)果

注：S.高度敏感；I.中介；R.耐藥。

Note:S.Sensitive;I.Intermediate;R.Resistance.

2.6動物試驗

在動物試驗中，試驗組小鼠表現(xiàn)為精神沉郁、聚堆、很少活動，在24 h～48 h內(nèi)全部死亡。對照組小鼠經(jīng)連續(xù)觀察7 d，全部健康存活。死亡小鼠眼觀主要病變?yōu)榉闻K出血，肝臟、脾臟腫大，腸道黏膜充血。在大白兔回歸試驗中，試驗組兔接種菌液后10 h開始表現(xiàn)體溫升高，精神萎靡，不愿活動，呼吸急促、鼻孔流出分泌物，與發(fā)病獺兔臨床癥狀基本相似。接種細(xì)菌后約20 h死亡1只，其余2只在接種細(xì)菌后約32 h全部死亡。對照組兔在試驗觀察期間均健康存活。死亡兔眼觀病變主要為肺臟表面有出血點，肝臟腫大，小腸腸腔充滿液狀內(nèi)容物，與送檢病死獺兔剖檢病變大體相同。取死亡小鼠、兔的肺、肝接種營養(yǎng)瓊脂平板與十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板，均分離到與原接種菌同樣的細(xì)菌。

3　討論

銅綠假單胞菌是一種人獸感染的重要條件致病菌，它廣泛分布于水、空氣、土壤等自然環(huán)境及正常人、畜的皮膚、腸道和呼吸道，可在創(chuàng)傷局部感染化膿，也可全身感染引起敗血癥[10]。本研究的病料來自2014年8月青島某獺兔養(yǎng)殖場的發(fā)病獺兔，臨床檢查發(fā)現(xiàn)發(fā)病獺兔后肢均有皮膚破潰，有的已經(jīng)形成痂皮。剖檢病變主要為肺腫脹、出血，肝臟和腎臟腫脹、淤血，小腸充滿液狀內(nèi)容物。根據(jù)臨床癥狀、解剖病變結(jié)果，進(jìn)一步結(jié)合細(xì)菌分離、生化試驗和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，最終確診為銅綠假單胞菌感染，分離菌對小鼠和實驗兔有一定的致病力。

從發(fā)病獺兔分離的銅綠假單胞菌對多種頭孢類藥物、多種喹諾酮類藥物和氨基糖苷類藥物高度敏感，對恩諾沙星和新霉素中度敏感，對卡那霉素等藥物耐藥。建議養(yǎng)殖場對發(fā)病獺兔按照3 mg/kg～5 mg/kg肌注慶大霉素，每天1次，連用3 d；其他獺兔用左氧氟沙星(25 mg/L水)全群飲水投藥。同時用新潔爾滅進(jìn)行消毒，每天1次，連續(xù)消毒5 d～7 d。經(jīng)過采取上述措施，3 d左右患病兔食欲、精神有所好轉(zhuǎn)，沒有出現(xiàn)新的發(fā)病病例。

消化道、呼吸道和傷口是兔銅綠假單胞菌病主要的感染途徑[11]。對發(fā)病兔的臨床檢查，發(fā)現(xiàn)發(fā)病獺兔后肢均有皮膚破潰，據(jù)此推測該場獺兔銅綠假單胞菌病的感染和傳播途徑很可能是后肢的皮膚傷口。獺兔的生物學(xué)因素、獺兔的體型、兔舍的環(huán)境和兔籠底板結(jié)構(gòu)等因素均可引起獺兔后肢發(fā)生皮膚破潰，進(jìn)而增加了感染某些細(xì)菌(如銅綠假單胞菌、葡萄球菌等)的機會。為了有效地預(yù)防獺兔的銅綠假單胞菌病，建議養(yǎng)兔場主要采取以下措施：① 平時加強飼養(yǎng)管理，保持籠舍的清潔衛(wèi)生；② 選用表面平整、無銳利物的兔籠底板；③ 當(dāng)發(fā)現(xiàn)家兔局部皮膚破潰時，要及早對傷口進(jìn)行處理，根據(jù)傷口的情況分別采取消毒藥清洗、涂擦抗生素軟膏、消毒紗布包扎等措施，防止銅綠假單胞菌經(jīng)傷口感染。

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Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test ofPseudomonasaeruginosafrom Rex Rabbits

SUN Xin-peng，GAO Shan-song，HAN Xian-jie

(College of Animal Science and Technology，Qingdao Agriculture University， Qingdao，Shandong，266109，China)

In order to identify the main bacterial pathogens from the diseased Rex rabbits at a farm and analyze the drug sensitivity,some diseased Rex rabbits from one farm in Qingdao were dissected.A bacterial strain was isolated from the lungs of the Rex rabbits,and was identified by morphological characteristics,biochemical tests and 16 S rRNA sequencing.The bacterial isolate was Gram-negative bacillus,and was identified asPseudomonasaeruginosaby Bojian Gram-negative bacteria identification system.The 16 S rRNA sequence of the bacteria shared 100% homology withPseudomonasaeruginosaby the method of homology comparison.The drug sensitivity test indicated that the bacterial isolate was highly sensitive to most kinds of the cephalosporins and aminoglycosides.The result can provide a reference for clinical medication to treat thePseudomonasaeruginosainfection.

Rex rabbit；Pseudomonasaeruginosa；isolation and identification；drug sensitivity test

2015-11-03

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系毛皮動物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊項目(SDAIT-18-011-12)；山東省應(yīng)用型人才培養(yǎng)特色名校建設(shè)大學(xué)生科技創(chuàng)新項目

孫鑫鵬(1994-)，男，山東煙臺人，本科生。*通訊作者

S852.617

B

1007-5038(2016)08-0128-04