代云紅，唐亞男，吳　晗，潘華遠(yuǎn)，張　陽(yáng)，陳　冰（皖南醫(yī)學(xué)院：.臨床學(xué)院；.手術(shù)學(xué)教研室；3.病理學(xué)教研室，安徽蕪湖400）

·論著·

1型糖尿病大鼠模型的建立及相關(guān)病理學(xué)形態(tài)觀察*

代云紅1，唐亞男1，吳晗1，潘華遠(yuǎn)1，張陽(yáng)2，陳冰3△（皖南醫(yī)學(xué)院：1.臨床學(xué)院；2.手術(shù)學(xué)教研室；3.病理學(xué)教研室，安徽蕪湖241001）

目的探討鏈佐星（STZ）誘導(dǎo)大鼠1型糖尿病模型的構(gòu)建方法及觀察相關(guān)臟器病理學(xué)形態(tài)。方法采用不同劑量STZ（50、70、90 mg/kg）一次性腹腔注射后建立大鼠1型糖尿病模型45只，分別作為50、70、90 mg/kg組，每組15只；另選取15只大鼠不注射STZ作為對(duì)照組。在造模前，造模后3、7、14、21 d分別測(cè)定各組大鼠空腹血糖值，第21天處死各組存活大鼠，取胰腺、心臟、肺臟、腎臟制成石蠟切片，應(yīng)用蘇木精-伊紅染色進(jìn)行鏡下觀察。結(jié)果不同劑量組大鼠血糖值均達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)，70 mg/kg組大鼠第21天均成活，50、90 mg/kg組大鼠于第7天開始出現(xiàn)死亡，第21天成活率分別為60.0%（9/15）和13.3%（2/15）；不同劑量組大鼠胰腺、腎臟病理形態(tài)學(xué)變化均較對(duì)照組明顯，而心臟、肺臟病理形態(tài)學(xué)變化不明顯。結(jié)論70 mg/kg一次性腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型較穩(wěn)定，胰腺、腎臟形態(tài)學(xué)變化均明顯。

疾病模型，動(dòng)物；糖尿病，1型；大鼠；血糖；病理學(xué)

當(dāng)前，非傳染性慢性疾病已成為全球死亡和疾病負(fù)擔(dān)的主要病因［1］。而糖尿病作為主要的疾病之一，近年來(lái)在中國(guó)成年人中總患病率約為11.6%，已成為我國(guó)重要的公共衛(wèi)生問題［2］。國(guó)外有研究表明，1型糖尿病患者血糖控制不佳相關(guān)死亡風(fēng)險(xiǎn)增加8～10倍［3］。因此，構(gòu)建1型糖尿病動(dòng)物模型進(jìn)行科學(xué)研究具有深遠(yuǎn)意義。目前，建立1型糖尿病的方法有手術(shù)切除胰腺法、化學(xué)藥物誘導(dǎo)法及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等。而手術(shù)切除胰腺法對(duì)動(dòng)物傷害過大，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物價(jià)格昂貴，限制了二者的實(shí)際應(yīng)用?；瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)法中較常見者為應(yīng)用鏈佐星（streptozocin，STZ）、四氧嘧啶等，其中STZ法已成為目前廣泛采用的方法，但成模時(shí)間為48 h至2個(gè)月，模型穩(wěn)定性也不一致［4-5］。因此，本研究采用一次性腹腔注射不同劑量STZ的方法，鑒定血糖及進(jìn)行相關(guān)腎臟、胰腺等病理形態(tài)學(xué)觀察研究1型糖尿病大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建，以期尋找一種價(jià)格便宜、效果穩(wěn)定的模型構(gòu)建方式。

1　材料與方法

1.1材料清潔級(jí)雄性Wistar雄性大鼠60只（體質(zhì)量150～180 g）購(gòu)于皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［動(dòng)物合格證號(hào)：scxk（皖）2014-0001］，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，室溫控制于22～25℃，相對(duì)濕度為35%～75%，用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，正常飲食。STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。三諾安準(zhǔn)血糖儀及配套血糖試紙購(gòu)自長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司。Sartorius電子分析天平為德國(guó)產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1檸檬酸緩沖液的配制將檸檬酸2.10 g加雙蒸水100 mL配成甲液，檸檬酸鈉（枸櫞酸鈉）2.94 g加雙蒸水配成乙液，將甲、乙液按1∶1混合，調(diào)pH值為4.2，隨后進(jìn)行滅菌處理。

1.2.2動(dòng)物分組及模型制作將45只大鼠作為模型組，分別一次性腹腔注射STZ 50、70、90 mg/kg作為50、70、90 mg/kg組，每組15只；注射STZ前16 h禁食，不禁飲。另選取15只大鼠不注射STZ作為對(duì)照組。分別于造模前，造模后3、7、14、21 d在大鼠尾尖取血測(cè)定各組大鼠空腹血糖值。于21 d頸椎脫臼處死各組存活大鼠，剖腹后觀察大鼠各臟器肉眼改變，分別取胰腺、肺臟、腎臟、心臟用10%甲醛固定、脫水、包埋并進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡觀察。由高年資病理醫(yī)生閱片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1模型組與對(duì)照組大鼠空腹血糖值比較造模后3、7、14、21 d對(duì)照組大鼠空腹血糖值未明顯升高，模型組大鼠空腹血糖值明顯升高，與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　模型組與對(duì)照組大鼠空腹血糖值比較（±s）

表1　模型組與對(duì)照組大鼠空腹血糖值比較（±s）

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05。

組別對(duì)照組模型組n 0 d 3 d 7 d　14 d　21 d 15 45 4.81±0.84 5.30±1.16 5.43±1.39 16.82±6.00a5.31±1.12 17.35±5.40a5.23±0.84 19.94±2.94a5.12±1.19 21.61±5.62a

2.2不同劑量STZ對(duì)糖尿病大鼠模型的影響70、90 mg/kg組成模率均為93.3%，50 mg/kg組為80.0%，三組成模率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。70 mg/kg組大鼠第21天成活率為100.0%，50、90 mg/kg組大鼠于第7天開始出現(xiàn)死亡，第21天成活率分別為60.0%、13.3%，與70 mg/kg組成活率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2　不同劑量STZ對(duì)糖尿病大鼠模型的影響［n（%）］

2.3各組大鼠一般狀態(tài)比較模型組大鼠出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿、消瘦等，并逐漸表現(xiàn)為精神萎靡、食欲減退、煩躁等。對(duì)照組大鼠精神狀況良好，飲食及飲水情況正常，體質(zhì)量隨時(shí)間漸增。

2.4各組大鼠病理檢查結(jié)果比較模型組大鼠胰腺、腎臟病理形態(tài)學(xué)變化均較對(duì)照組明顯，而心臟、肺臟病理形態(tài)學(xué)變化不明顯。

2.4.1各組大鼠胰腺病理形態(tài)學(xué)變化比較對(duì)照組大鼠胰島數(shù)目較多，界限清楚，為橢圓形或圓形細(xì)胞團(tuán)；胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目也較多；模型組大鼠胰島數(shù)目減少或消失，邊界不清，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞核表現(xiàn)為大小不一、形狀不規(guī)則，見圖1。

圖1　各組大鼠胰腺病理形態(tài)學(xué)變化比較（HE染色，400×）

2.4.2各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)變化比較對(duì)照組大鼠腎小體數(shù)目及體積正常，腎小管未見變性等改變，腎間質(zhì)未見纖維化。模型組大鼠部分腎小球體積增大，腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多，腎小管上皮出現(xiàn)細(xì)胞水腫，腎間質(zhì)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖2。

圖2　各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)變化比較（HE染色，400×）

3　討　論

老年人群、城市居民及經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)糖尿病患病率較高。中國(guó)成年糖尿病患者數(shù)可能高達(dá)1.14億［2］。且糖尿病并發(fā)癥多種多樣，臨床治療花費(fèi)大、周期長(zhǎng)［6］。特別是1型糖尿病患者血糖若控制不佳則死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，因此，建立穩(wěn)定、便宜的動(dòng)物模型對(duì)糖尿病防治的研究意義重大。

本研究結(jié)果表明，注射STZ后第3天開始模型組大鼠空腹血糖值明顯升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與國(guó)內(nèi)部分研究結(jié)果相似［7-8］。

目前，在STZ建立1型糖尿病動(dòng)物模型中大多數(shù)研究集中在成模大鼠胰島的一般表現(xiàn)或血糖檢測(cè)的觀察，而對(duì)其他器官的形態(tài)學(xué)研究較少［9-10］。本研究觀察了大鼠胰腺、心臟、肺臟、腎臟等形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果表明，模型組大鼠胰腺、腎臟病理形態(tài)變化均較對(duì)照組明顯，可作為成模的輔助表現(xiàn)，而心臟、肺臟病理形態(tài)學(xué)變化不明顯，考慮可能是成模時(shí)間較短所致。

作者認(rèn)為，本模型的構(gòu)建成功的關(guān)鍵在于劑量的選擇及STZ的配制，特別是檸檬酸緩沖液的質(zhì)量、濃度及pH值要符合實(shí)驗(yàn)要求。同時(shí)，STZ藥物滅菌處理和配制完成后10 min內(nèi)注射可能影響到造模的成功率和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存率，且在注射藥物后應(yīng)保障動(dòng)物水和食物的供應(yīng)，進(jìn)行有創(chuàng)操作時(shí)注意消毒等因素均可影響大鼠模型生存率。本研究結(jié)果表明，應(yīng)用不同劑量STZ（50、70、90 mg/kg）一次性腹腔注射均可成功誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠模型，但70 mg/kg組存活率較高，50、90 mg/kg組存活率較低，90 mg/kg組可能是因?yàn)閯┝窟^大，引起大鼠臟器過度損害，不能耐受，最終導(dǎo)致死亡；值得注意的是，50 mg/kg組存活率也較低，考慮可能是由于只是破壞部分胰島β細(xì)胞功能，造成外周組織對(duì)胰島素不敏感，即胰島素抵抗，使大鼠體內(nèi)胰島β細(xì)胞分泌更多的胰島素進(jìn)行工作，從而出現(xiàn)高胰島素血癥。血液中的高胰島素反過來(lái)進(jìn)一步加重胰島素抵抗，最終使胰島β細(xì)胞衰竭，繼而引起大鼠死亡。

總之，70 mg/kg一次性腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型較穩(wěn)定，成模率及成活率均較高，可作為1型糖尿病造模的適宜劑量。

［1］ Chackerian B，F(xiàn)rietze KM.Moving towards a new class of vaccines for non-infectious chronic diseases［J］.Expert Rev Vaccines，2016，15（5）：561-563.

［2］Xu Y，Wang L，He J，et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults［J］.JAMA，2013，310（9）：948-958.

［3］Gregg EW，Li Y，Wang J，et al.Changes in diabetes-related complications in the United States，1990-2010［J］.N Engl J Med，2014，370（16）：1514-1523.

［4］Marangoni MN，Brady ST，Chowdhury SA，et al.The co-occurrence of myocardial dysfunction and peripheral insensate neuropathy in a streptozotocininduced rat model of diabetes［J］.Cardiovasc Diabetol，2014，13：11.

［5］Wang S，Li Y，Zhao J，et al.Mesenchymal stem cells ameliorate podocyte injury and proteinuria in a type 1 diabetic nephropathy rat model［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2013，19（4）：538-546.

［6］Martin CL，Albers JW，Pop-Busui R，et al.Neuropathy and related findings in the diabetes control and complications trial/epidemiology of diabetes interventions and complications study［J］.Diabetes Care，2014，37（1）：31-38.

［7］李友山，鄭琪，冀凌云，等.改良STZ法制備糖尿病足潰瘍大鼠模型［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2016，43（1）：158-160.

［8］徐靖，鄭陽(yáng)，王西墨，等.殘存胰島功能對(duì)1型糖尿病大鼠胃轉(zhuǎn)流術(shù)后血糖改變的影響［J］.中華胃腸外科雜志，2012，15（8）：859-861.

［9］農(nóng)慧，盛慶壽，梁健，等.STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的研究［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27（1）：69-72.

［10］李田樂，李彤，胡曉旻，等.心功能不全合并糖尿病大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)［J］.天津醫(yī)藥，2016，44（2）：196-199.

Establishment of type 1 diabetic rat model and observation of related pathological morphology*

Dai Yunhongl，Tang Yalanl，Wu Hanl，Pan Huayuanl，Zhang Yang2，Chen Bing3△（l.Clinical College；2.Teaching and Researching Section of Operative Surgery；3.Department of Pathology，Wannan Medical College，Wuhu，Anhui 24l00l，China）

ObjectiveTo study the construction method of Streptozotocin（STZ）-induced type 1 diabetes mellitus（T1DM）rat model and to observe the related organs pathological morphology.MethodsForty-five cases of T1DM rat model were established by once intraperitoneal injection of different doses（50，70，90 mg/kg）of STZ，which were respectively served as the 50，70，90 mg/kg groups，15 cases in each group；other 15 rats without injection of STZ were selected as the control group.The fasting blood glucose values of these rats were detected before the model construction and on 3，7，14，21 d after the model construction.All survival rats were killed on 21 d.The pancreas，heart，lungs and kidneys were taken for preparing the paraffin sections and performed the HE staining for conducting the optical microscopic observation.ResultsThe rat blood glucose values of different doses of group reached the model standard.The 70 mg/kg group was survived on 21 d，while the 50，90 mg/kg groups began to die on 7 d and the 21 d survival rates were 60.0%（9/15）and 13.3%（2/15）respectively；the pathological morphological changes of the rat pancreas and kidneys in different doses of groups were obvious compared with those in the control group，while which of heart and lung had no significant morphological changes.ConclusionOnce intraperitoneal injection of 70 mg/kg for inducing DM rat model is more stable and the morphologicalchanges of the pancreas and kidney are obvious.

Disease models，animal；Diabetes mellitus，type 1；Rats；Blood glucose；Pathology

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.17.002

A

1009-5519（2016）17-2624-03

2014年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（201410368043）；皖南醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)培育基金項(xiàng)目（wk201408）。

代云紅（1993-），在讀本科生，主要從事糖尿病病理相關(guān)研究。

，E-mail：281993214@qq.com。

2016-06-12）