王 偉，李 莎，張夢丹，高 穎，薛書銀，陳可塑，王中越，陳 龍，（.南京中醫(yī)藥大學藥學院國家科技部規(guī)范化中藥藥理實驗室，江蘇南京 0046；.南京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房呼吸科，江蘇南京 000；.泰州中國醫(yī)藥城中醫(yī)藥研究院，江蘇泰州 500）

·論著·

liguzinediol基于肌漿網鈣泵促進鈣釋放發(fā)揮正性肌力作用

王 偉1，李 莎1，張夢丹1，高 穎1，薛書銀1，陳可塑2，王中越3，陳 龍1，3
（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院國家科技部規(guī)范化中藥藥理實驗室，江蘇南京 210046；2.南京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房呼吸科，江蘇南京 210002；3.泰州中國醫(yī)藥城中醫(yī)藥研究院，江蘇泰州 225300）

目的 研究liguzinediol（LZDO）正性肌力動力學特點及其作用機制。方法 ①大鼠在體實驗，經左側頸外靜脈緩慢推注LZDO 20 mg·kg-1，連續(xù)記錄30 min左心室壓力-容積環(huán)。②采用大鼠離體心臟，分別灌流咖啡因0.5 mmol·L-1以及咖啡因0.5 mmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1，記錄其左心室收縮力。③心肌細胞鈣釋放實驗，分別灌流毒胡蘿卜素2 μmol·L-1以及毒胡蘿卜素2 μmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1，記錄其肌漿網鈣釋放。④采用灌流后的心臟，分離肌漿網膜蛋白之后，測定LZDO（1，10和100 μmol·L-1）對肌漿網鈣轉運ATP酶（SERCA2a）活性作用。結果 ①除心率及舒張末期容積外，LZDO 20 mg·kg-1顯著減少收縮末期容積，顯著增加收縮末期壓力、每搏輸出量、射血分數、心輸出量、左室壓力最大上升速率及搏出功（P＜0.05）。②咖啡因0.5 mmol·L-1灌流5 min，大鼠離體心臟心率、左心室發(fā)展壓及左心室內壓最大上升速率增加，灌流30 min后各指標均降低。而LZDO 100 μmol·L-1則能對抗咖啡因0.5 mmol·L-130 min的這種降低作用（P＜0.05）。③毒胡蘿卜素2 μmol·L-1顯著降低心肌細胞鈣釋放，從標準化的正常灌流液組（100±5）%降低到（51±5）%（P＜0.05），而LZDO 100 μmol·L-1未能對抗毒胡蘿卜素的作用〔（49± 4）%〕。④LZDO（10和100 μmol·L-1）顯著增加心肌肌漿網鈣泵活性，從正常灌流液組0.98±0.10分別增加到1.17±0.20及（1.43±0.09）μmol Pi·g-1·h-1，呈現濃度依賴性（r=0.85，P＜0.05）。結論 LZDO通過增加鈣泵活性提高肌漿網鈣濃度梯度，從而間接增加鈣釋放而發(fā)揮正性肌力作用。基于其作用機制，LZDO有可能被開發(fā)為臨床上使用的正性肌力藥物。

liguzinediol；鈣釋放；強心藥；肌漿網鈣轉運ATP酶類

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.003

Liguzinediol（LZDO）化學名為2，5-二羥甲基-3，6-二甲基吡嗪，是川芎嗪（ligustrazine）的一種衍生物。由于其對位二羥基的結構，LZDO呈現出了對離體及在體心臟的正性肌力作用［1-3］?；谶@種作用，LZDO獲得了中國（授權專利號：CN101361740B）及美國專利（授權專利號：US 8158630B2）。

我們前期研究表明，在一系列川芎嗪衍生化合物中，LZDO呈現出了良好的正性肌力活性［4］，其作用靶點可能為鈣泵［1］。基于其正性肌力的藥理作用，LZDO能增強多柔比星模型大鼠下降的心肌收縮力［2］。此外，在大鼠體內LZDO呈現出了良好的代謝特點，水溶性高，生物利用度達95%［5］。然而先前的研究并未闡明LZDO對整體大鼠心肌收縮力作用的動力學特點，及作用靶點的直接證據。本研究在前期研究的基礎上，研究LZDO對在體大鼠心臟左心室壓力-容積環(huán)的影響，分析在其作用下大鼠左心室壓力與容積的關系；探索LZDO與鈣泵及肌漿網鈣釋放的關系，進一步確證其作用靶點。

1　材料與方法

1.1試劑和主要儀器

自制LZDO（純度為99.5%）；咖啡因，毒胡蘿卜素及其他試劑均購自美國Sigma-Aldrich公司。PowerLab多導生理記錄儀（澳大利亞 AD Instruments；型號：PowerLab 8/35），Millar放大器（美國MILLAR公司，型號：735-2083 Rev.F），心室內壓和壓力容積導管（美國MILLAR公司，型號：大鼠SPR-901）。Zeiss LSM 710（德國卡爾蔡司公司）倒置共聚焦顯微鏡系統(tǒng)。試劑盒由南京建成生物有限公司提供。

1.2在體大鼠左心室壓力-容積關系曲線記錄

健康清潔級雄性SD大鼠，體質量250～300 g，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證：SCXK（蘇）2007-0008。ip給予20%烏拉坦5 mL·kg-1，在麻醉狀態(tài)下分離右側頸總動脈及左側頸外靜脈，定標壓力-容積導管壓力。LZDO （20 mg·kg-1）溶于0.1 mL生理鹽水經左側頸外靜脈緩慢推注，連續(xù)記錄LZDO作用30 min。實驗結束后用30%鹽水及自身血液進行體積定標。實驗結果用AD Instruments的Labchart 8軟件分析，指標包括：心率（heart rate，HR）、收縮末期容積（end-systolic volume，Ves）、舒張末期容積（enddiastolic volume，Ved）、收縮末期壓力（endsystolic pressure，Pes）、每搏輸出量（stroke volume，SV）、射血分數（ejection fraction，EF）、心輸出量（cardiac output，CO）、左心室壓力最大上升速率 （peak rate of rise of left ventricular pressure，+dp/dtmax）及搏出功（stroke work，SW）。預實驗表明，單獨0.1 mL生理鹽水經左側頸外靜脈緩慢推注不影響大鼠上述左心室壓力-容積關系動力學參數（n＞20）。

1.3離體大鼠左心室收縮力記錄

采用的大鼠及麻醉的方式同在體實驗，實驗方法同前［3］。采用Langendorff裝置，充氧（95%O2+ 5%CO2）條件下，離體心臟灌流（mmol·L-1：NaCl 117，KCl 5.7，CaCl21.8，MgCl21.7，NaHCO34.4，NaH2PO41.5，HEPES 20，葡萄糖11），用NaOH調pH至7.4，溫度為（37.5±0.5）℃，灌流壓80 cm H2O（1 cmH2O=0.098 kPa）。將壓力感受器探頭經左心房插入左心室，經壓力換能器與RM6240型多道生理信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）相連用于記錄左心室收縮曲線?？Х纫?.5 mmol·L-1灌流持續(xù)30 min，分別記錄5 min及30 min時的作用。隨后共同灌流咖啡因0.5 mmol·L-1和LZDO 100 μmol·L-110 min，并記錄心率HR、左心室發(fā)展壓（left ventricular developed pressure，LVDP）、左心室內壓最大上升速率+dp/dtmax的變化。

1.4激光共聚焦測定左心室心肌細胞鈣釋放

實驗方法同我們前期研究［3］。分離大鼠左心室心肌細胞，在37℃條件下與Fluo-3（5 μmol·L-1，上海東仁化學科技有限公司）共同孵育30 min，加載好熒光染料的細胞置于倒置共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的載物臺上。以0.5 Hz及1.5倍閾強度（～10 V）的局部場脈沖刺激細胞。共聚焦顯微鏡的成像方式為線掃描，采樣速率為2 ms/線，共聚焦線掃描在局部場刺激開始前200 ms開始，起始部分作為刺激前的本底對照。實驗獲得圖像用IDL（Research Systems，Boulder，CO）程序處理，鈣瞬變的大小以標準熒光強度F/F0表示，其中F0表示靜息狀態(tài)的熒光強度。

1.5心肌肌漿網鈣泵活性測定

采用心臟灌流的方法（同1.3法），LZDO（0，1，10，100 μmol·L-1）灌注離體心臟10 min后，快速剪取離體心臟左心室心肌組織，稱重，液氮中研碎后按10 mL·g-1的比例加入勻漿液（mmol·L-1：NaHCO310，NaN35，Tris?HCl 15，pH 6.8）進行勻漿，并在8289×g條件下離心20 min去除細胞碎片，取上清液32 300×g離心45 min，將沉淀混懸于緩沖液（mmol·L-1：KCl 600，Tris?HCl 10，pH 6.8）中，再次32 300×g離心45 min，沉淀即為肌漿網膜，混懸于的緩沖液（mmol·L-1：蔗糖250，組氨酸10）中［6］。用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。根據超微量Ca2+-ATP酶測定說明書分酶促反應和定磷反應2步測定肌漿網鈣轉運ATP酶（sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA2a）活性。

1.6統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1LZDO對大鼠左心室收縮動力學的作用

圖1為大鼠靜脈注射LZDO 20 mg·kg-1前后代表性的左心室壓力-容積環(huán)，表明LZDO增加左心室收縮壓、舒張期末期容積、做功面積。表1中數據顯示，除HR及Ved外，Ves容積顯著減少，Pes，SV，EF，CO，+dp/dtmax及SW顯著增加（P＜0.05）。

2.2LZDO對抗咖啡因引起的收縮力下降的作用

圖2為咖啡因及LZDO灌流前后，大鼠離體心臟左心室收縮力變化的代表性曲線。表2表明，咖啡因0.5 mmol·L-1作用5 min后，HR，LVDP 和+dp/dtmax均增加，30 min后均降低（P＜0.05）。而LZDO 100 μmol·L-1能對抗咖啡因0.5 mmol·L-130 min引起的收縮力減弱（P＜0.05），提示LZDO能對抗咖啡因耗竭心肌肌漿網鈣濃度的作用。

Fig.1 Representative recording of steady-state left ventricular pressure-volume（P-V）loops before and after administration of liguzinediol（LZDO）20 mg·kg-1in rats.

Tab.1 Effect of LZDO on kinetic parameters of left ven?tricular contractility before and after administration of LZDO 20 mg·kg-1in rats

Fig.2 Representative traces of contractility from rat left ventricles before and after administration of caffeine and LZDO in isolated rat hearts.Caffeine 0.5 mmol·L-1（up to 30 min）and caffeine 0.5 mmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1were perfused sequentially.

Tab.2 Effect of LZDO on contractility of left ventricles in isolated rat hearts

2.3LZDO對大鼠左心室心肌細胞鈣釋放的影響

我們先前的研究表明，LZDO 100 μmol·L-1自灌流2 min開始明顯增加大鼠左心室心肌細胞的鈣釋放，作用持續(xù)到30 min時鈣釋放從標準化正常灌流液組（100±4）%增加到（138±7）%及（139±12）% （P＜0.05，n=5）［3］。本次實驗發(fā)現，鈣泵抑制劑毒胡蘿卜素明顯抑制鈣釋放，從標準化的正常灌流液組（?100±5）%降低到（51±5）%（P＜0.05，n=4）。其抑制作用于30 min后達到穩(wěn)定（圖3）。LZDO 100 μmol·L-1灌流5 min后未能對抗毒胡蘿卜素抑制鈣釋放的作用。

2.4LZDO對肌漿網鈣泵活性的作用

LZDO（0，1，10和100 μmol·L-1）灌注離體心臟后，表3結果顯示LZDO 10和100 μmol·L-1處理過心臟的肌漿網膜中SERCA2a酶活性呈現濃度依賴性的增加（r=0.83，P＜0.05）。

Tab.3 Effect of LZDO on activities of sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase（SERCA2a）of left ventricular myocytes from isolated rat hearts

3　討論

本研究發(fā)現，LZDO在整體大鼠的正性肌力作用的特點，LZDO不僅增加左心室壓力，而且減少收縮期心室的殘留量提高心臟的EF，在HR不變的條件下實現CO的增加；LZDO增加肌漿網鈣釋放，是通過增加肌漿網鈣泵活性。雖然先前的研究推測LZDO發(fā)揮正性肌力作用可能基于增加肌漿網鈣泵活性，但缺少直接證據［1-2］。本研究通過蘭尼堿受體（ryanodine receptors，RyR）激動劑咖啡因灌流實驗，顯示LZDO具有對抗咖啡因的肌漿網鈣耗竭作用，間接證明LZDO具有增加肌漿網鈣濃度梯度的作用。并通過鈣泵抑制劑毒胡蘿卜素，證明了LZDO促進肌漿網鈣釋放被毒胡蘿卜素所阻斷，間接證明LZDO的作用靶點為鈣泵。而通過測定鈣泵活性，獲得了LZDO具有促進鈣泵活性的直接證據。

鈣誘導性鈣釋放（Ca2+induced Ca2+release， CICR）是心肌細胞收縮的觸發(fā)點，L型鈣通道開放導致少量的鈣離子從細胞外進入細胞內，引起肌漿網上的RyR開放，稱為CICR［7-8］。大量的鈣進入胞漿引起心肌收縮，與此同時鈣泵將鈣從胞漿泵入肌漿網并導致心肌舒張［9-10］。咖啡因能引起RyR持續(xù)大量開放，起初引起胞漿鈣濃度急劇增加，隨之因耗竭肌漿網內的鈣而導致鈣釋放下降。毒胡蘿卜素能抑制鈣泵活性，阻止鈣從胞漿泵入肌漿網，使肌漿網的鈣濃度下降。LZDO通過提高鈣泵活性增加肌漿網鈣的濃度，間接增加鈣釋放。

然而，鈣泵受到受磷蛋白（phospholamban，PLB）的調控，磷酸化的PLB解除對鈣泵的抑制作用，而去磷酸化PLB對鈣泵具有抑制作用［11］。蛋白激酶A及鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ磷酸化PLB，而蛋白磷酸酶使PLB去磷酸化。因此，本研究還無法確定LZDO是直接激活鈣泵，還是通過其他途徑（如蛋白激酶A、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ及蛋白磷酸酶）發(fā)揮正性肌力作用。更詳細的作用靶點的確定需進一步研究。

臨床上用于心衰的藥物有利尿藥［12］、β腎上腺素受體拮抗藥［13］、心臟正性肌力藥［14］、血管緊張素轉換酶抑制劑［15］、血管緊張素受體阻斷劑和醛固酮拮抗藥［16］等，而臨床心臟正性肌力藥物為強心苷類、磷酸二酯酶抑制劑類及多巴胺。由于嚴重的不良反應，心臟正性肌力藥只有強心苷類常用于臨床。即使被認為是較為安全的強心苷類，臨床上仍然容易導致心律失常［17］。LZDO發(fā)揮心臟正性肌力的靶點為鈣泵，與目前臨床使用的正性肌力的靶點不同，而且高濃度條件下不易產生心律失常［3］，可作為具有潛力的抗心衰藥物進行深入研究。

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Liguzinediol exerts positive inotropic effect by enhancing Ca2+release from sarcoplasmic reticulum mediated by sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase

WANG Wei1，LI Sha1，ZHANG Meng-dan1，GAO Ying1，XUE Shu-yin1，CHEN Ke-su2，WANG Zhong-yue3，CHEN Long1，3
（1.National Standard Laboratory of Pharmacology for Chinese Materia Medica，School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China；2.Department of Respiratory Disease，Inpatient Wards for Senior Cadres，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Nanjing 210002，China；3.Institute of Chinese Medicine of Taizhou China Medical City，Taizhou 225300，China）

OBJECTlVE To explore kinetic features and its underlying mechanism of the positiveinotropic effect of liguzinediol（LZDO）in rats.METHODS①An In vivo study was made to record the effect of LZDO 20 mg·kg-1injected for 30 consecutive min from the left external jugular vein on pressurevolume relationships.②Ex vivo study was used to record the antagonistic effect of LZDO on reduced contractility induced by caffeine.Caffeine and LZDO were perfused as follows：normal perfusion solution，caffeine 0.5 mmol·L-1，and then caffeine 0.5 mmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1.③ Ca2+transient from cardiomyocyte sarcoplasmic reticulum（SR）was measured to analyze the effect of LZDO on Ca2+release blocked by thapsigargin.Thapsigargin and LZDO were perfused as follows：normal perfusion solution，thapsigargin 2 μmol·L-1，and then thapsigargin 2 μmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1. ④The SR vesicles were prepared and the effect of LZDO（1，10 and 100 μmol·L-1）on sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase（SERCA2a）activity was determined according to the ultramicro-Ca2+-ATP enzyme kit.RESULTS① LZDO 20 mg·kg-1significantly reducedtheend-systolicvolume（Ves）and enhanced the end-systolic pressure（Pes），stroke volume（SV），ejection fraction（EF），cardiac output（CO），peak rate of rise of left ventricular pressure（+dp/dtmax）and stroke work（SW）（P＜0.05）. However，LZDO 20 mg·kg-1did not significantly change the heart rate（HR）or the end-diastolic volume （Ved）.② Caffeine 0.5 mmol·L-1significantly enhanced HR，left ventricular developed pressure （LVDP），and+dp∶dtmaxat 5 min after caffeine and decreased at 30 min.However，LZDO 100 μmol·L-1restored the reduced HR，LVDP，and+dp/dtmaxinduced by caffeine at 30 min（P＜0.05）.③Thapsigargin 2 μmol·L-1significantly reduced the SR Ca2+transient from perfusion solution group（100±5）%to（51± 5）%（P＜0.05）and LZDO 100 μmol·L-1failed to restore the decreased Ca2+transient〔（49±4）%〕. Normalized Ca2+transients were reduced by thapsigargin 2 μmol·L-1and thapsigargin 2 μmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1.④ LZDO（10 and 100 μmol·L-1）significantly increased the activities of SERCA2a in perfusion solution group 0.98±0.10 to 1.17±0.20 and（1.43±0.09）μmol Pi·g-1·h-1，respectively（P＜0.05）.CONCLUSlON LZDO can enhance SR Ca2+gradient by activating the SERCA2a and might be developed to serve as a potential positive inotropic agent in clinical settings.

liguzinediol；Ca2+release；cardiotonic agents；sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase

The project supported by Natural Science Foundation for High Education of Jiangsu Province （14KJA360002）；and Natural Science Foundation of Jiangsu Province（BK20131262）

CHEN Long，E-mail：longchen@njutcm.edu.cn，Tel：（025）85811193，13584058521

R972，R285.5

A

1000-3002-（2016）03-0197-06

2015-12-01接受日期：2016-02-20）

（本文編輯：喬 虹）

江蘇省自然科學基金（BK20131262）；江蘇省高校自然科學研究重大項目（14KJA360002）

王 偉，男，碩士研究生，主要從事藥物正性肌力機制研究，E-mail：631897525@qq.com，Tel：（025）85811193，15105107024

陳 龍，E-mail：longchen@njutcm.edu.cn，Tel：（025）85811193，13584058521，