郭健敏，陳 雨，周 云，韓 重，楊 威（1.廣東省生物資源應(yīng)用研究所藥物非臨床評(píng)價(jià)研究中心，廣東廣州 510990；2.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東廣州 510990；3.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院藥理系，廣東廣州 510006）

呋喃二烯對(duì)人胃腺癌MGC-803細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

郭健敏1，2，陳 雨2，3，周 云2，3，韓 重1，2，楊 威1，2
（1.廣東省生物資源應(yīng)用研究所藥物非臨床評(píng)價(jià)研究中心，廣東廣州 510990；2.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東廣州 510990；3.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院藥理系，廣東廣州 510006）

目的 研究呋喃二烯（FDE）在體外對(duì)人胃腺癌MGC-803細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。方法 FDE 46.29～740.74 μmol·L-1與MGC-803細(xì)胞孵育48 h，MTT法測(cè)定FDE對(duì)細(xì)胞存活的抑制率；FDE 92.58～370.32 μmol·L-1與MGC-803細(xì)胞作用24 h，光鏡下及Hoechst 33342熒光染色分別觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，羅丹明123染色和DCFH-DA熒光探針?lè)謩e檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的改變和活性氧的產(chǎn)生。結(jié)果 MTT結(jié)果表明，F(xiàn)DE 46.29～740.74 μmol·L-1對(duì)MGC-803存活具有明顯抑制作用，作用24，48和72 h時(shí)IC50分別為347.91，257.41和101.01 μmol·L-1。流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)果顯示，F(xiàn)DE在92.58～370.32 μmol·L-1作用24 h，能顯著促進(jìn)MGC-803細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)DE可使MGC-803細(xì)胞周期阻滯于S期。羅丹明123和DCFH-DA染色結(jié)果顯示，當(dāng)藥物濃度為370.37 μmol·L-1時(shí)，F(xiàn)DE使細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位降低（P＜0.05），對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度的細(xì)胞比例與對(duì)照組的比值為0.85∶1，使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加，活性氧水平為對(duì)照組的1.30倍（P＜0.05）。結(jié)論 FDE可抑制人胃腺癌MGC-803細(xì)胞存活，并誘導(dǎo)其凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制可能與激活線粒體凋亡通路、影響細(xì)胞周期和抑制DNA的生物合成相關(guān)。

呋喃二烯；MGC-803細(xì)胞；胃癌；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；線粒體膜電位；活性氧

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.006

胃癌是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民生命健康的惡性腫瘤之一，其死亡率在各類(lèi)腫瘤中仍居前位。化療作為晚期胃癌治療的主要手段，在一定程度上能夠延長(zhǎng)患者生存期，提高生存率，改善生存質(zhì)量，但目前仍未有突破性進(jìn)展［1］。中醫(yī)學(xué)以辨證論治為核心，針對(duì)胃癌患者的不同情況辨證用藥，在延長(zhǎng)患者生存期，提高生存率，改善生存質(zhì)量，抗腫瘤生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移及配合化療增效減毒等方面有一定作用［2］。因此，中藥現(xiàn)代化在治療胃癌和防治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，或是配合化療增效減毒等均具有重要意義。

呋喃二烯（furanodiene，F(xiàn)DE）又名蓬獲術(shù)環(huán)二烯，是從抗腫瘤中藥溫莪術(shù)油中分離得到的單體主成分。有研究表明，其對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞具有選擇性增殖抑制作用［3］。本課題組應(yīng)用多種腫瘤細(xì)胞，觀察了FDE體外抑制細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果顯示，F(xiàn)DE對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。關(guān)于FDE對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞抑制作用及作用機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)FDE抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖作用及機(jī)制進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1藥物、細(xì)胞、主要試劑和儀器

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

MGC-803細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基（添加10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素混合液）于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶85%時(shí)傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度3×107L-1，每孔100 μL，接種于96孔板，24 h后加入100 μL的終濃度分別為46.29，92.59，185.18，370.37和740.74 μmol·L-1的FDE，分別作用24，48 和72 h后，每孔加20 μL MTT（5 g·L-1），繼續(xù)作用4 h后，棄上清液，并加入DMSO 150 μL溶解反應(yīng)產(chǎn)物，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值（absorbance，A490 nm），計(jì)算對(duì)細(xì)胞存活的抑制率。存活抑制率（%）=（A490 nm對(duì)照組-A490 nm藥物組）/A490 nm對(duì)照組）×100%。根據(jù)所得的FDE 5個(gè)濃度梯度的細(xì)胞存活抑制率繪制曲線，計(jì)算在3個(gè)不同作用時(shí)間點(diǎn)下FDE誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡50%時(shí)的濃度，即IC50值。

1.4光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

取1×106對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MGC-803細(xì)胞接種于6孔板，每孔1 mL。24 h后每孔加入FDE 1 mL，終濃度分別為92.59，185.18和370.37 μmol·L-1，作用24 h后吸出培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞2次，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5熒光顯微鏡下Hoechst33242染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取1×106個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，24 h后加入不同濃度的FDE（終濃度92.59，185.18和370.37 μmol·L-1）作用24 h后，吸出培養(yǎng)液，PBS洗2次。每孔加入500 μL Hoechst33242染色液，避光孵育30 min后用PBS洗1次，4%多聚甲醛固定15 min，在熒光顯微鏡下觀察拍照。正常的細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。

1.6AnnexinⅤ-FlTC/Pl雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取1×106對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，加入不同濃度的FDE（終濃度92.59，185.18和370.37 μmol·L-1）作用24 h后收集細(xì)胞，PBS洗2次，將細(xì)胞重懸于200 μL結(jié)合緩沖液中，加入10 μL AnnexinⅤ-FITC，室溫避光孵育15 min，加入300 μL結(jié)合緩沖液和5 μL PI，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

取1×106對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，加入終濃度分別為92.59，185.18和370.37 μmol·L-1的FDE作用24 h后收集細(xì)胞，2000×g離心5 min，PBS洗2次，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇（-20℃預(yù)冷），混勻，4℃過(guò)夜固定。2000×g離心5 min，PBS洗3次，加入500 μL PI（終濃度50 mg·L-1）避光20 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)活性氧

取1×106對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，加入終濃度分別為92.59，185.18和370.37 μmol·L-1的FDE作用24 h后收集細(xì)胞，2000×g離心5 min，PBS洗2次后重懸，加入DCFH-DA熒光探針，室溫下避光染色30 min，離心棄上清，用PBS洗2次，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化。

1.9流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位

取1×106對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，加入終濃度分別為92.59，185.18和370.37 μmol·L-1的FDE作用24 h后收集細(xì)胞，2000×g離心5 min，用無(wú)血清RPMI 1640洗2次，重懸細(xì)胞，加入羅丹明123染色液，使其最終濃度為10 mg·L-1，37℃避光孵育30 min后離心，棄去上清液，用PBS洗2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1FDE對(duì)MGC-803細(xì)胞存活的抑制作用

隨著FDE濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)DE對(duì)MGC-803細(xì)胞存活的抑制作用增強(qiáng)（表1）。FDE作用24，48和72 h時(shí)，IC50分別為347.91，257.41 和101.01 μmol·L-1。

2.2FDE對(duì)MGC-803細(xì)胞形態(tài)和凋亡形成的影響

普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DE作用24 h，MGC-803細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞碎裂，染色質(zhì)濃縮，同時(shí)細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯減少（圖1）。Hoechst33242染色結(jié)果如圖2顯示，細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞呈淡藍(lán)色熒光，可見(jiàn)完整的細(xì)胞核。FDE作用24 h后，藍(lán)色熒光明顯加深且藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量增多，可見(jiàn)到細(xì)胞染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核呈致密濃染和碎塊狀，顏色發(fā)白，同時(shí)可看到細(xì)胞核的邊緣化及凋亡小體。

Tab.1 Effect of furanodiene（FDE）on survival of MGC-803 cells detected with MTT assay

Fig.1 Effect of FDE treatment for 24 h on morphologi?cal changes of MGC-803 cells（×400）.Morphological chang?es were observed under optical microscope.↑：cell debris.

Fig.2 Effect of FDE for 24 h on morphological changes on MGC-803 cells（Hoechst 33242，×400）.Morphological changes　were　observed　underfluorescence　microscope.↑：apoptotic MGC-803 cells.

2.3FDE對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

AnnexinⅤ-FITC/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（圖3）表明，F(xiàn)DE作用24 h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞凋亡率（6.3±4.4）%比較，F(xiàn)DE 92.59，185.18和370.37 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），分別為（14.1±5.4）%，（31.8± 5.7）%和（36.2±4.2）%（n=3），具有濃度效應(yīng)關(guān)系（r= 0.936，P＜0.05），其中FDE為370.37 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞凋亡率是對(duì)照組的5.76倍。

Fig.3 Effect of FDE for 24 h on apoptosis of MGC-803 cells detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

2.4FDE對(duì)MGC-803細(xì)胞周期的影響

如圖4和表2所示，F(xiàn)DE作用24 h，MGC-803細(xì)胞周期分布發(fā)生了明顯變化（P＜0.05）。當(dāng)FDE濃度為370.37 μmol·L-1時(shí)，S期細(xì)胞所占的百分比增至對(duì)照組的1.66倍，表明FDE可使MGC-803細(xì)胞阻滯于S期。

Fig.4 Effect of FDE treatment for 24 h on cell cycle of MGC-803 distribution detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

Tab.2 Effect of FDE on apoptosis and cell cycle of MGC-803 cells

2.5FDE對(duì)MGC-803細(xì)胞活性氧水平和線粒體膜電位的影響

表3和圖5結(jié)果表明，細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞活性氧水平較低，F(xiàn)DE作用24 h后，隨著藥物濃度增大細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高（r=0.975，P＜0.05），當(dāng)PDE濃度為370.37 μmol·L-1時(shí)，活性氧水平是細(xì)胞對(duì)照組的1.30倍。表3和圖6結(jié)果表明，F(xiàn)DE作用24 h PDE誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，隨著濃度的增加，熒光信號(hào)的強(qiáng)度逐漸減弱（P＜0.05），表明線粒體膜電位下降（P＜0.05）。流式檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)藥物濃度為370.37 μmol·L-1時(shí)，對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度的細(xì)胞比例與對(duì)照組之比為0.85∶1。

Tab.3 Effect of FDE treatment for 24 h on reactive oxygenspecies（ROS）and mitochodrial membrane potential（MMP）of MGC-803 cells

Fig.5 Effect of FDE treatment for 24 h on intracellular level of ROS　in　MGC-803cells detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

Fig.6　Effect of FDE treatment for 24 h on MMP in MGC-803 cells detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

3　討論

FDE最初是由日本學(xué)者Hikino等［4］從莪術(shù)中分離鑒定得到，國(guó)內(nèi)外學(xué)者又相繼證明FDE還存在于白術(shù)［5］、沒(méi)藥［6］和珊瑚［7］中。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)DE具有顯著的抑制腫瘤活性，并表現(xiàn)出很強(qiáng)的選擇性［8-9］。

本研究使用MTT法分別檢測(cè)FDE作用24，48 和72 h后對(duì)MGC-803細(xì)胞存活的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)DE隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)MGC-803細(xì)胞存活有明顯的抑制作用。細(xì)胞形態(tài)觀察和Hoechst33242熒光染色可見(jiàn)，F(xiàn)DE對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、線粒體膜電位、活性氧變化以及細(xì)胞周期變化等，進(jìn)一步研究FDE對(duì)MGC-803細(xì)胞存活抑制作用的作用機(jī)制。結(jié)果提示，F(xiàn)DE可以明顯誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡，并呈明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系；可降低線粒體膜電位，提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)于S期，從而促進(jìn)MGC-803細(xì)胞的凋亡［10］。上述結(jié)果提示，F(xiàn)DE可以使MGC-803細(xì)胞阻滯于S期，阻止其進(jìn)入G2期和M期，從而抑制MGC-803細(xì)胞的增殖并使其凋亡［11-12］。由此可知，F(xiàn)DE抗腫瘤的作用機(jī)制可能是通過(guò)作用于DNA合成而誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞發(fā)生凋亡，使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯于S期，降低腫瘤細(xì)胞的增殖活性，推測(cè)FDE具有一定的研究開(kāi)發(fā)前景。

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lnduction of furanodiene on apoptosis of human gastric adenocarcinoma MGC-803 cells

GUO Jian-min1，2，CHEN Yu2，3，ZHOU Yun2，3，HAN Zhong1，2，YANG Wei1，2
（1.Center for Drug Non-clinical Evaluation and Research，Guangdong Institute of Applied Bioresources，Guangzhou 510990，China；2.Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co.，Ltd.，Guangzhou 510990，China；3.Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

OBJECTlVE To investigate the effect of furanodiene（FDE），a diterpene derived from the medicinal plant Zedoary，on apoptosis of human gastric cancer MGC-803 cells induced in vitro. METHODS MGC-803 cells were treated with FDE 46.29～740.74 μmol·L-1for 24，48 and 72 h，and the cell viability was detected with MTT assay.Cell morphology was observed by light microscopy and Hoechst33342 staining.Flow cytometry was used to detect cell apoptotic rate and cell cycle.Rh123 staining and fluorescence probe DCFH-DA were employed to detect the changes in mitochondrial membrane potential（MMP）and reactive oxygen species（ROS）.RESULTS MTT Results showed that FDE 46.29-740.74 μmol·L-1exhibited significantly higher cytotoxicity to gastric cancer MGC-803 cells. IC50for MGC-803 of 24，48 and 72 h treatment was 347.91，257.41 and 101.01 μmol·L-1，respectively. Treatment with FDE 92.58-370.32 μmol·L-1for 24 h also caused significant morphological changes in MGC-803 cells.AnnexinⅤ-FITC/PI double staining showed that the apoptotic rate increased after FDE 92.58-370.32 μmol·L-1treatment for 24 h（P＜0.05）.FDE enabled MGC-803 cell cycle arrest in S phase.DCFHDA staining showed that FDE resulted in an increase in intracellular ROS levels（P＜0.05）when PDE concentration was 370.37 μmol·L-1（P＜0.05）.MMP decreased after FDE treatment when PDE concen?tration was 370.37 μmol·L-1（P＜0.05）.CONCLUSlON FDE Possesses potent tumor selected toxicity and can induce apoptosis of MGC-803 cells through cell cycle arresting，which is related to inhibition of DNA biosynthesis.

furanodiene；MGC-803 cells；gastric cancer；apoptosis；cell cycle；mitochondrial membrane potential；reactive oxygen species

The project supported by National Science and Technology Major Project（2013ZX09103001012）

YANG Wei，E-mail：yangwei0719@163.com，Tel：（020）22698388

R979.1

A

1000-3002-（2016）03-0215-06

2016-01-12接受日期：2016-02-26）

（本文編輯：齊春會(huì)）

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2013ZX0910-3001012）

郭健敏（1987-），女，碩士研究生，主要從事新藥藥理與毒理學(xué)研究，E-mail：hihiqinqin@qq.com；楊 威（1978-），男，研究員，主要從事新藥藥理毒理研究。

楊 威，E-mail：yangwei0719@163.com，Tel：（020）22698388