牟慶璇，胡美榮，陳飛，江賢章，陶勇，黃建忠

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采用混合策略提高葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的表達(dá)水平

牟慶璇1，胡美榮2，陳飛1，江賢章1，陶勇2，黃建忠1

1 福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108 2 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

為了提高葡萄糖氧化酶 (GOD) 在畢赤酵母中的表達(dá)水平，提出了甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)和共表達(dá)分子伴侶二硫鍵異構(gòu)酶 (PDI) 和透明顫菌血紅蛋白 (VHb) 兩種策略。利用對(duì)照菌株X33/pPIC9k–GOD 在5 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)時(shí)，采用甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)，GOD最終酶活為456 U/mL，比只采用甲醇作為單一碳源誘導(dǎo)時(shí)GOD最終酶活提高了20%。利用整合伴侶蛋白菌株X33/pPIC9k-GOD/pPICZ-PDI-VHb在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，采用甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)，GOD最終酶活達(dá)到716 U/mL，蛋白濃度為7.4 g/L。研究結(jié)果對(duì)提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)有重要參考價(jià)值。

畢赤酵母，葡萄糖氧化酶，二硫鍵異構(gòu)酶，透明顫菌血紅蛋白酶，山梨醇

葡萄糖氧化酶 (Glucose oxidase，GOD)，又名β-D-葡萄糖氧化還原酶，系統(tǒng)編號(hào)EC1.1.3.4，能夠?qū)Ｒ坏膶ⅵ?D-葡萄糖氧化，同時(shí)產(chǎn)生過氧化氫和葡萄糖酸。高純度的葡萄糖氧化酶為淡黃色粉末[1]，一般酶制劑中還含有過氧化氫酶，構(gòu)成葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶復(fù)合體，共同起作用[1-3]。葡萄糖氧化酶在食品、醫(yī)藥、分析化學(xué)、臨床化學(xué)和畜牧業(yè)等行業(yè)應(yīng)用十分廣泛。

黑曲霉來源的GOD分子量為138 kDa，兩個(gè)亞基的分子量約70 kDa。其最適pH為6.7，最適反應(yīng)溫度為30 ℃，max值為35.71 μmol/min，m值為35.74 mmol/L[4]。

目前研究的GOD主要來源于青霉菌或黑曲霉。在之前的報(bào)道中，在瑞氏木霉和產(chǎn)黃青霉中表達(dá)GOD，最終酶活分別為25 U/mL、11.45 U/mL和 17.2 U/mL[5-6]。Gu等[2]通過在畢赤酵母中共表達(dá)分子伴侶SEC53、CNE1和GCN4，使GOD酶活達(dá)到1 972.9 U/mL，基本達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，這也是目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高酶活。

二硫鍵異構(gòu)酶 (Protein disulfide isomerase，PDI)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含量最豐富的蛋白之一，主要催化氧化反應(yīng)幫助蛋白形成正確的折疊結(jié)構(gòu)而分泌到胞外，它可以明顯提高異源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)。Li等[7]在畢赤酵母中過表達(dá)PDI使人白細(xì)胞蛋白酶抑制劑 (SLPI) 的產(chǎn)量提高5倍，SLPI的生物活性也有所提高。

畢赤酵母在高密度發(fā)酵時(shí)需要消耗大量氧氣，溶氧水平直接影響異源蛋白的表達(dá)，因此透明顫菌來源的血紅蛋白 (hemoglobin，VHb) 作為一種氧調(diào)節(jié)蛋白，可以結(jié)合游離氧，從而使發(fā)酵液中的氧含量提高[8]。Wang等[9]在畢赤酵母中過表達(dá)VHb蛋白，在低溶氧條件下，使耶羅維亞酵母脂肪酶 (YlLIP2) 產(chǎn)量比沒有VHb蛋白時(shí)提高1.8倍，同時(shí)生物量也有明顯提高。Wang等[10]在枯草桿菌中表達(dá)VHb使那他霉素的含量在1 L發(fā)酵罐中產(chǎn)量為8.2 g/L，比野生菌提高了131.3%。

在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，甲醇的添加是外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵原因之一，但甲醇濃度過高對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用。混合碳源補(bǔ)料可在一定程度上補(bǔ)充碳源的不足，又可避免高濃度甲醇可能引起的毒害作用。山梨醇對(duì)醇氧化酶 (Alcohol oxidase，AOXI) 轉(zhuǎn)錄的抑制較弱，能減緩目標(biāo)蛋白的胞外降解，降低有毒副產(chǎn)物的積累[11-12]，現(xiàn)已逐漸成為畢赤酵母高密度發(fā)酵過程中最常用的輔助碳源。Ding等[13]通過甲醇/山梨醇混合流加控制溶氧的方式，使豬圓環(huán)病毒cap蛋白在10 L發(fā)酵罐中的產(chǎn)量提高至198 mg/L。

PDI和VHb能夠提高外源蛋白的表達(dá)水平，但尚未見到在提高GOD表達(dá)水平方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，通過在受體菌X33/pPIC9k-GOD中整合分子伴侶蛋白PDI和VHb，提高GOD的表達(dá)，在高密度發(fā)酵過程中，利用甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)的方式提高GOD的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌克隆菌株T1購自全式金公司；酵母表達(dá)菌株X33購自Invitrogen；畢赤酵母工程菌X33/pPIC9k-GOD由實(shí)驗(yàn)室保存；VHb基因由南京金斯瑞公司合成。

1.2 方法

基因組提取、酶切、連接等常規(guī)分子生物學(xué)操作參照《分子克隆手冊(cè)》[14]進(jìn)行。

1.2.1 融合表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)PDI基因序列設(shè)計(jì)寡核苷酸鏈，合成引物 (表1)。

表1 基因PCR擴(kuò)增引物列表

Table 1 PCR primers of molecular

通過PCR技術(shù)利用引物P1和P2以畢赤酵母基因組為模板擴(kuò)增出PDI基因序列，將PDI和VHb片段與pPICZ載體連接，構(gòu)建質(zhì)粒pPICZ-PDI和pPICZ-VHb。轉(zhuǎn)化T1感受態(tài)細(xì)胞，獲得正確的融合載體。將pPICZ-VHb利用引物P3和P4擴(kuò)增出含有AOX啟動(dòng)子、VHb基因以及終止子區(qū)域的目的片段，與Ⅰ線性化的重組質(zhì)粒pPICZ-PDI進(jìn)行同源重組，采用Gibson連接方法，構(gòu)建pPICZ-PDI-VHb。轉(zhuǎn)化T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆獲得融合質(zhì)粒。

1.2.2 陽性轉(zhuǎn)化子的獲得

將3個(gè)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pPICZ-PDI、pPICZ-VHb、pPICZ-PDI-VHb進(jìn)行Ⅰ線性化后分別電轉(zhuǎn)X33/pPIC9k-GOD，構(gòu)建菌株X33/pPIC9k- GOD/pPICZ-VHb、X33/pPIC9k-GOD/pPICZ-PDI、X33/pPIC9k-GOD/pPICZ-PDI-VHb，涂布在終濃度250 μg/mL G418和50 μg/mL Zeocin的YPD雙抗平板上，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS–PAGE檢測(cè)

培養(yǎng)基和誘導(dǎo)方法參照文獻(xiàn)[15]。將重組菌株X33/pPIC9k-GOD和分別整合分子伴侶PDI、VHb、PDI-VHb的X33/pPIC9k-GOD菌株進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)，收集上清測(cè)定酶活。

1.2.4 GOD酶活測(cè)定

GOD酶活測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[16]。

1個(gè)酶活力單位是指在37 ℃、pH 5.0條件下，在1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol葡萄糖生成1 μmol葡萄糖酸和H2O2所需的酶量。

1.2.5 Bradford法測(cè)定蛋白濃度

蛋白濃度測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[17]。

1.2.6 5 L發(fā)酵罐放大表達(dá)GOD

高密度發(fā)酵培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[15]。等培養(yǎng)基中的甘油耗盡溶氧上升后，以18.15 mL/(h·l) 的速率流加含有1.2% () PTM1的50% () 甘油，待600到150–200時(shí)停止流加甘油，饑餓培養(yǎng)0.5–2 h，以5 g/(h·l) 的速率流加含有1.2% () PTM1的100%甲醇，用濃氨水 (28%) 控制pH為6.0，同時(shí)以 20∶1 (，甲醇∶山梨醇) 的速率流加山梨醇，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量控制溶氧在10%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶水平檢測(cè)分子伴侶對(duì)GOD表達(dá)影響

將X33/pPIC9k–GOD菌株作為對(duì)照菌株，與分別整合分子伴侶菌株X33/pPIC9k-GOD/pPICZ- PDI、X33/pPIC9k-GOD/pPICZ-VHb和X33/pPIC9k- GOD/pPICZ-PDI-VHb (圖1) 按照上述條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。對(duì)照菌株酶活13 U/mL，整合VHb的GOD菌株酶活為18 U/mL，整合PDI的GOD菌株酶活為29 U/mL，同時(shí)整合VHb、PDI的GOD菌株酶活達(dá)到33 U/mL (圖2)。圖3可知，整合分子伴侶的菌株蛋白表達(dá)均較空白多，其中整合PDI-VHb菌株蛋白表達(dá)最多。

圖2 共表達(dá)分子伴侶對(duì)GOD酶活的影響

圖3 SDS-PAGE分析分子伴侶對(duì)GOD表達(dá)的影響

2.2 5 L發(fā)酵罐表達(dá)GOD

2.2.1 甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)對(duì)GOD表達(dá)的影響

未來怎樣通過合理的布局產(chǎn)品庫存，采用不押款、零庫存且相對(duì)較低的價(jià)格銷售，減少農(nóng)民投入，這不是農(nóng)資行業(yè)一直要實(shí)現(xiàn)的事情嗎？這些年，農(nóng)資產(chǎn)品隨著政策，市場(chǎng)的變化，探索者各式各樣的銷售方式，賒銷是分銷商最頭疼的事情。

將對(duì)照菌株X33/pPIC9k-GOD按照上述條件采用甲醇流加與甲醇/山梨醇混合碳源流加的方式進(jìn)行5 L高密度發(fā)酵。發(fā)酵上清進(jìn)行SDS-PAGE分析 (圖4)，甲醇/山梨醇混合碳源流加能夠提高GOD表達(dá)，但是同時(shí)也增加了雜蛋白的表達(dá)量?？瞻拙瓴捎眉状颊T導(dǎo)下罐酶活為384 U/mL (圖5 B)，蛋白濃度為3.2 g/L (圖4 A)；采用甲醇/山梨醇混合碳源流加下罐酶活為456 U/mL (圖5 B)，蛋白濃度為 5.1 g/L (圖4 B)。酶活提高20%，蛋白濃度提高60%。

圖5 甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵GOD空白對(duì)照菌株、甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)發(fā)酵GOD空白對(duì)照菌株和甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)發(fā)酵共表達(dá)PDI-VHb菌株在5 L發(fā)酵罐中生物量 (A) 和酶活 (B) 分析

2.2.2 高密度發(fā)酵中分子伴侶對(duì)GOD表達(dá)的影響

將對(duì)照菌株X33/pPIC9k-GOD和整合伴侶蛋白的X33/pPIC9k-GOD/pPICZ-PDI-VHb菌株按甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)方式進(jìn)行5 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)。發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS–PAGE分析 (圖4)，整合分子伴侶的菌株蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照菌株。對(duì)照菌株下罐酶活為456 U/mL (圖5 B)，蛋白濃度為5.1 g/L (圖4 B)；整合伴侶蛋白GOD菌株下罐酶活達(dá)到 716 U/mL (圖5B)，蛋白濃度為7.4 g/L (圖4 C)。酶活提高60%，蛋白濃度提高50%。共表達(dá)分子伴侶PDI和VHb可以明顯提高GOD的表達(dá)水平。

3 討論

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有高水平的外源蛋白表達(dá)能力，分泌的重組蛋白有易于純化及便于大規(guī)模發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，是異源表達(dá)GOD的最佳選擇。本文在工程菌X33/pPIC9k-GOD中共表達(dá)分子伴侶PDI-VHb得到菌株X33/pPIC9k- GOD/pPICZ-PDI-VHb。在5 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)過程中，采用甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)的策略，GOD最終酶活為456 U/mL，比甲醇誘導(dǎo)提高了20%；采用共表達(dá)伴侶蛋白PDI–VHb和甲醇/山梨醇誘導(dǎo)的混合策略，GOD最終酶活為716 U/mL，比對(duì)照菌株提高90%。這說明，分子伴侶PDI和VHb以及甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)確實(shí)可以提高GOD的表達(dá)。

山梨醇是一種非抑制性碳源，山梨醇與甲醇共同誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)時(shí)，二者具有不同的代謝途徑，山梨醇的加入可以緩解甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)表達(dá)能量不足的壓力和甲醇積累造成細(xì)胞毒性的問題。在高密度發(fā)酵GOD過程中，甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)方式能夠提高GOD表達(dá)量，這與之前報(bào)道的結(jié)果一致。在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，過表達(dá)PDI能夠提高蛋白表達(dá)過程中二硫鍵的生成，過表達(dá)VHb蛋白能緩解細(xì)胞生長過程中溶氧的限制作用，還能增加高密度發(fā)酵過程中的生物量，這給目的產(chǎn)物與生物量正相關(guān)的發(fā)酵試驗(yàn)提供新思路。

本文通過整合分子伴侶促進(jìn)蛋白正確折疊和甲醇/山梨醇混合碳源誘導(dǎo)明顯地提高GOD蛋白表達(dá)，這為廉價(jià)生產(chǎn)GOD提供了新的方法。本實(shí)驗(yàn)室將繼續(xù)探索其他的方法和策略，進(jìn)一步提高葡萄糖氧化酶的表達(dá)水平，以滿足其在飼料、檢測(cè)和精細(xì)化工生產(chǎn)等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

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High-level production of glucose oxidase by recombinantusing a combined strategy

Qingxuan Mu1, Meirong Hu2, Fei Chen1, Xianzhang Jiang1, Yong Tao2, and Jianzhong Huang1

1 College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, Fujian, China 2 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Scienses, Beijing 100101, China

To enhance the production of glucose oxidase by recombinant, two strategies were developed, which were namely co-feeding of methanol and sorbitol and co-expressing of the protein disulfide isomerase (PDI) andhemoglobin (VHb). The volumetric activity reached 456 U/mL by using the strain X33/pPIC9k-GOD, in 5 liter fermentator, with the co-feeding of methanol and sorbitol, it was 0.2 fold higher than that only feeding by methanol. The improved strain was obtained by co-expressing PDI-VHb with GOD. While fermented in a 5 liter fermentator by feeding methanol and sorbitol, the activity of the improved strain reached 716 U/mL with a yield of 7 400 mg/L total soluble protein concentration. These results indicated that heterologous protein expression level can be enhanced by optimizing fermentation condition and co-expression molecular chaperon in.

,glucose oxidase, protein disulfide isomerase,hemoglobin, sorbitol

October 23, 2015; Accepted: January 8, 2016

牟慶璇, 胡美榮, 陳飛, 等. 采用混合策略提高葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的表達(dá)水平. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(7): 986–990.

Mu QX, Hu MR, Chen F, et al. High–level production of glucose oxidase by recombinantusing a combined strategy. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 986–990

Supported by: Key Technologies of Industrialization Project in Fujian (No. [2010] 358).

Corresponding author: Jianzhong Huang. Tel: +86-591-22868212; E-mail: hjz@fjnu.edu.cn

福建省產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)項(xiàng)目 (No. 閩財(cái)指[2010]358號(hào)) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)