張?jiān)?，楊志靈，楊海靈

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江南卷柏Phi類谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶的分子特性

張?jiān)?，楊志靈，楊海靈

北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083

谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶 (Glutathione-transferase, GST) 在幫助植物抵抗各種脅迫中發(fā)揮重要作用。該研究從江南卷柏中克隆到兩個(gè)Phi類GST基因，分別命名為和，兩個(gè)基因均編碼215個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因在江南卷柏根、莖和葉中均有表達(dá)。將這兩個(gè)基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白并純化，酶學(xué)性質(zhì)分析表明SmGSTF1和SmGSTF2對(duì)CDNB、NBD-Cl和NBC等3種底物都有活性。SmGSTF1對(duì)Fluorodifen和Cum-OOH也有活性，而SmGSTF2對(duì)它們沒有活性。酶動(dòng)力學(xué)分析表明SmGSTF1和SmGSTF2對(duì)GSH有較高的親和力，而對(duì)CDNB的親和力都相對(duì)較低。在不同pH及溫度條件下對(duì)SmGSTF1和SmGSTF2重組蛋白進(jìn)行活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)蛋白在pH 7?8.5，45?55 ℃溫度范圍內(nèi)有較高的催化活性。研究推測(cè)，SmGSTF1和SmGSTF2可能在江南卷柏的抗逆生理過程中有重要的作用。

江南卷柏，谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶，基因表達(dá)，酶學(xué)性質(zhì)

蕨類植物起源于距今4億年前，相比較苔蘚植物，蕨類植物孢子體內(nèi)部有明顯的維管組織的分化，因而在原始維管植物的進(jìn)化中具有重要意義[1]。江南卷柏是蕨類植物的現(xiàn)存種之一，在中國(guó)廣泛分布于長(zhǎng)江流域和長(zhǎng)江以南各地[2]，是一種常用的具有清熱活血作用的藥用植物[3]。對(duì)其進(jìn)行研究有助于理解蕨類植物適應(yīng)更復(fù)雜陸地環(huán)境的作用機(jī)制。

谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶 (Glutathione-transferase，GST，EC 2.5.1.18) 是一類具有多種生理功能的蛋白質(zhì)超家族，廣泛存在于哺乳動(dòng)物、植物、鳥類、昆蟲、寄生蟲及微生物體內(nèi)。最早在20世紀(jì)70年代，就在玉米中發(fā)現(xiàn)了GST[4-6]，隨后植物GST的基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化分析、表達(dá)模式和生物學(xué)功能等得到了廣泛的研究[7-10]。GST在生物體內(nèi)主要參與植物的解毒代謝，它能催化外源或內(nèi)源的親電子化合物與還原型谷胱甘肽 (Reduced glutathione) 結(jié)合形成R-SG復(fù)合物，增加其親水性，使其能夠被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞膜，達(dá)到解毒的作用[4-6]。植物GST基因家族主要分為8個(gè)類型，分別是Tau、Phi、DHAR、Zeta、Theta、Lambda、TCHQD和EF1Bγ[11]，其中Phi類GST是植物特有的類型。植物中Tau、Phi和Zeta類GST的晶體結(jié)構(gòu)已得到解析，蛋白結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)植物GST的三維結(jié)構(gòu)都比較保守[12]，但其負(fù)責(zé)與特異性底物結(jié)合的C末端區(qū)域結(jié)構(gòu)變化較大，這也說明不同的GST能結(jié)合特定底物而發(fā)揮不同的生理功能[13]。Phi類GST對(duì)于植物抵抗逆境脅迫具有重要作用，例如，在擬南芥中過量表達(dá)一個(gè)Phi類GST基因能顯著提高其植株對(duì)紫外線的抗性[14]；在煙草中過量表達(dá)玉米的Phi類GST基因明顯增強(qiáng)了植株對(duì)除草劑的抗性[15]。

先前已經(jīng)有對(duì)苔蘚植物 (如小立碗蘚)、裸子植物 (如油松) 和被子植物 (如楊樹) 中Phi類GST的研究[11,16-17]，但缺乏對(duì)于蕨類植物中Phi類GST的相關(guān)研究。本研究從江南卷柏中克隆得到兩個(gè)Phi類GST基因，對(duì)它們的系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)模式，以及所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和生化活性進(jìn)行了深入的研究，為揭示Phi類GST在植物響應(yīng)環(huán)境脅迫中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的江南卷柏取自重慶縉云山，用于RNA的提取。

1.2 江南卷柏Phi類GST的鑒定

以已發(fā)表的小立碗蘚Phi類GST蛋白序列為模板[17]，在NCBI的江南卷柏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行TBLASTN搜索，然后對(duì)搜索得到的序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.3 江南卷柏和基因的克隆

將江南卷柏植株洗凈，取約50 mg新鮮葉片，按照植物總RNA提取試劑盒 (BioTeKe公司) 說明書提取江南卷柏葉的總RNA，然后用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)和基因序列，分別設(shè)計(jì)引物對(duì)SmGSTF1-EX1/EX2和 SmGSTF2-EX1/EX2，以江南卷柏葉cDNA為模板，用Q5高保真DNA聚合酶 (NEB公司) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用DNA快速純化/回收試劑盒 (鼎國(guó)公司) 回收目的條帶。純化后的PCR片段連接到pEASY-Blunt載體 (全式金公司)，并轉(zhuǎn)化1-T1感受態(tài)細(xì)胞 (全式金公司)。在X-gal/IPTG Amp平板上挑取多個(gè)菌落，進(jìn)行菌落PCR，并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.4 Phi類GST系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析

將SmGSTF1和SmGSTF2，以及其他植物Phi類GST蛋白序列通過Clustal X 1.83進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，然后在BioEdit中進(jìn)行手動(dòng)校對(duì)。利用MEGA 5.0的neighbour-joining (NJ) 模型構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000。

1.5和的表達(dá)模式分析

使用植物總RNA 提取試劑盒 (BioTeKe公司) 提取江南卷柏根、莖和葉3個(gè)部位的RNA，然后將RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (TaKaRa公司) 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)引物SmGSTF1-SP1/SP2和SmGSTF2-SP1/SP2，分別以江南卷柏根、莖和葉的cDNA為模板，以江南卷柏基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行半定量RT-PCR，以研究和在不同組織的表達(dá)情況 (表1)。PCR反應(yīng)程序是：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，分別進(jìn)行24、26、28個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將PCR產(chǎn)物送出測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物是否為目的基因。

表1 本研究所用的引物

Table 1 Primers used in this study

1.6 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白結(jié)構(gòu)模擬

以擬南芥的Phi類GST (PDB:1GNW) 的X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)為模板，在SWISS-MODEL上進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)模擬，對(duì)模擬結(jié)果進(jìn)一步用prolife-3D程序進(jìn)行驗(yàn)證，選取最優(yōu)的模擬結(jié)構(gòu)。

1.7 SmGSTF1和SmGSTF2重組蛋白的表達(dá)和純化

以SmGSTF1-EX1/EX2、SmGSTF2-EX1/EX2為引物，以葉cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段。用限制性內(nèi)切酶HⅠ和Ⅰ對(duì)PET-30a載體進(jìn)行雙酶切。利用無縫克隆試劑盒 (中美泰和公司) 將目的基因連接到雙酶切后的載體上，再將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中。挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序，然后將測(cè)序驗(yàn)證無突變的重組表達(dá)菌接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，以1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)至600為0.6左右，加入IPTG (終濃度為0.1 mmol/L) 誘導(dǎo)蛋白在大腸桿菌BL21中表達(dá)，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液4 ℃、10 000×離心3 min收集菌體，加入適量緩沖液A (20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4， pH 7.5) 進(jìn)行重懸，在冰上進(jìn)行超聲波破碎10 min，將破碎后的菌液在4 ℃、10 000×離心10 min，取少量菌液、超聲破碎后的離心上清液和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。用緩沖液A平衡Ni 柱 (購(gòu)自于Amersham Pharmacia Biotech公司)，將超聲破碎離心后的上清液上柱，待蛋白結(jié)合30 min后，用緩沖液A洗脫雜蛋白，再用緩沖液B (0.5 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.5) 洗脫目的蛋白，收集目的蛋白洗脫峰進(jìn)行下一步酶學(xué)活性分析。

1.8 SmGSTF1和SmGSTF2重組蛋白的酶學(xué)活性檢測(cè)

參照Habig等[18]的方法測(cè)定重組蛋白對(duì)CDNB、DCNB和NBC的催化活性，參照Ricci等[19]的方法測(cè)定重組蛋白對(duì)NBD-Cl的催化活性，參照Edwards等[20]的方法測(cè)定重組蛋白對(duì)DHA、fluorodifen和Cum-OOH的催化活性。在25 ℃下，使用紫外分光光度計(jì) (Evolution 300)進(jìn)行所有的測(cè)活反應(yīng)。以CDNB和GSH為底物，每5 ℃作為一個(gè)梯度，測(cè)定重組蛋白在15?65 ℃之間的活性。參照Yuen等[21]的方法，在pH 5?10范圍內(nèi)測(cè)定重組蛋白在不同pH下的催化活性。

通過測(cè)定重組蛋白在不同CDNB和GSH濃度下的催化活性分析其動(dòng)力學(xué)常數(shù)。分析重組蛋白對(duì)于GSH的動(dòng)力學(xué)時(shí)，CDNB的濃度保持1.0 mmol/L不變，測(cè)定重組蛋白在不同GSH濃度 (0.1?1.0 mmol/L) 時(shí)的催化活性。分析重組蛋白對(duì)于CDNB的動(dòng)力學(xué)時(shí)，保持GSH濃度為1.0 mmol/L不變，測(cè)定其在不同CDNB濃度 (0.6?4.0 mmol/L) 時(shí)的催化活性。利用Hyper32程序，通過線性回歸分析獲得其酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 江南卷柏Phi類GST基因的克隆與基因結(jié)構(gòu)分析

以江南卷柏cDNA為模板，利用引物SmGSTF1-EX1/EX2和SmGSTF2-EX1/EX2克隆得到和的cDNA序列。和都包含648個(gè)堿基的開放閱讀框，編碼215個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì) (圖1)，預(yù)測(cè)的蛋白分子量分別為24.03 kDa和23.99 kDa。SmGSTF1和SmGSTF2之間只有4個(gè)氨基酸差異，氨基酸序列相似性為98.14%。通過保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增得到的2個(gè)基因都具有Phi類GST的保守結(jié)構(gòu)域，說明我們擴(kuò)增得到的是Phi類GST基因。和基因組序列全長(zhǎng)都是768 bp，都含有2個(gè)內(nèi)含子，2個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度都為60 bp。

圖1 SmGSTF1和SmGSTF2的氨基酸序列

2.2 江南卷柏Phi類GST基因的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析

將江南卷柏Phi類GST和苔蘚植物小立碗蘚、裸子植物油松、單子葉植物水稻、以及雙子葉植物擬南芥和毛果楊的Phi類GST共同進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示江南卷柏的兩個(gè)Phi類GST與其他物種的Phi類GST聚在一起，而且其位于系統(tǒng)發(fā)育樹的內(nèi)部，說明本研究擴(kuò)增得到的2個(gè)基因?yàn)镻hi類GST (圖2)。和聚在一起，說明和是在江南卷柏與其他物種分化之后通過基因重復(fù)產(chǎn)生的。

2.3 江南卷柏和基因的組織表達(dá)模式分析

采用半定量RT-PCR方法研究和基因在江南卷柏不同組織 (根、莖和葉) 中的表達(dá)分布。研究發(fā)現(xiàn)和基因在江南卷柏根、莖和葉中均表達(dá)，且這2個(gè)基因在所有的循環(huán)中都有表達(dá) (圖3)，說明和可能是組成型表達(dá)基因，在江南卷柏的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

2.4 江南卷柏SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的三維結(jié)構(gòu)

利用SWISS-MODEL網(wǎng)站模擬江南卷柏SmGSTF1和SmGSTF2的三維結(jié)構(gòu) (圖4A)。優(yōu)化后的構(gòu)象用Profile-3D進(jìn)行校驗(yàn)，可以看出絕大部分氨基酸殘基得分都是正值 (圖4B)，位于合理的范圍，表明模擬的結(jié)構(gòu)具有比較高的可信度。SmGSTF1和SmGSTF2的三維結(jié)構(gòu)包括2個(gè)結(jié)構(gòu)域：由α螺旋和β折疊組成的N末端結(jié)構(gòu)域 (N-domain) 以及由6個(gè)α螺旋組成的C末端結(jié)構(gòu)域 (C-domain)。蛋白結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)2個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)高度相似。

圖4 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白三維結(jié)構(gòu)的比較

2.5 江南卷柏SmGSTF1和SmGSTF2重組蛋白的表達(dá)和純化

將重組表達(dá)載體pET30a/SmGSTF1和pET30a/SmGSTF2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SmGSTF1和SmGSTF2重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá) (圖5)。將重組蛋白經(jīng)Ni柱親和層析純化并進(jìn)行蛋白凝膠電泳，SDS-PAGE結(jié)果顯示重組蛋白的分子量與預(yù)測(cè)的SmGSTF1和SmGSTF2蛋白大小一致，而且雜帶較少，表明純化蛋白的純度較高。

圖5 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在大腸桿菌BL21中的表達(dá)和純化

2.6 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的底物活性分析

SmGSTF1和SmGSTF2蛋白對(duì)不同底物的催化活性如表2所示，SmGSTF1和SmGSTF2對(duì)CDNB、NBD-Cl和NBC都具有酶學(xué)活性，對(duì)DCNB和DHA沒有催化活性。另外SmGSTF1對(duì)Fluorodi 和Cum-OOH有活性，而SmGSTF2對(duì)它們沒有活性。我們發(fā)現(xiàn)，同一蛋白對(duì)不同底物的活性相差很大，如SmGSTF2對(duì)CDNB的活性是其對(duì)NBC的22.3倍。不同蛋白對(duì)同一底物的活性變化也很大，例如，SmGSTF1和SmGSTF2對(duì)CDNB的活性相差不大，而SmGSTF1對(duì)NBC的活性是SmGSTF2的14.67倍。

表2 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的酶學(xué)活性

Table 2 Specific enzymatic activities of the recombinant SmGSTF1 and SmGSTF2 towards different substrates

Values shown are±, calculated from three replicates, n.d. represents no detected.

2.7 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的動(dòng)力學(xué)分析

分別以GSH和CDNB為底物，對(duì)SmGSTF1和SmGSTF2蛋白進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果如表3所示。米氏常數(shù)m表示酶對(duì)底物的親和力，我們發(fā)現(xiàn)SmGSTF1和SmGSTF2蛋白對(duì)GSH的m值遠(yuǎn)小于它們對(duì)CDNB的m值，說明它們對(duì)GSH比CDNB有更高的親和力，且SmGSTF1相比于SmGSTF2對(duì)GSH有更高的親和力。catm表示酶對(duì)底物的催化效率，我們發(fā)現(xiàn)，SmGSTF1對(duì)GSH的催化效率是SmGSTF2的1.94倍，而它們對(duì)CDNB的催化效率沒有差別。

表3 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白對(duì)GSH和CDNB的動(dòng)力學(xué)

Table 3 Kinetic constants of SmGSTF1 and SmGSTF2 towards GSH and CDNB (Values shown are±, calculated from three replicates)

2.8 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的pH依賴性和溫度依賴性分析

以CDNB和GSH為底物，對(duì)SmGSTF1和SmGSTF2蛋白進(jìn)行pH依賴性分析，結(jié)果如 圖6所示。pH依賴性顯示，在pH 5.0?8.0時(shí)，其催化活性逐漸升高，在pH 7.0?8.5時(shí)，兩個(gè)蛋白都可以保持80%以上的相對(duì)活性，且在pH 8.0時(shí)達(dá)到最高活性，pH 9.5時(shí)仍都能保持40%以上的相對(duì)活性，說明SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在偏堿性的條件下有更高的催化作用。

圖6 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在不同pH下的活性

以CDNB為底物，檢測(cè)SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在不同溫度下的催化活性，溫度依賴性結(jié)果如圖7所示，我們發(fā)現(xiàn)SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在較高的溫度下有比較高的催化活性，在15?45 ℃的范圍內(nèi)，SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的催化活性不斷增高。在40?55 ℃時(shí)，兩種蛋白都保持了80%以上的相對(duì)活性，并在45 ℃時(shí)達(dá)到最高活性，且在65 ℃也仍保持40%以上的相對(duì)活性。

圖7 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在不同溫度下的活性

3 討論

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶在植物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，如響應(yīng)環(huán)境脅迫，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抵抗病原菌入侵等[22-26]。根據(jù)我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，在雙子葉植物毛果楊中共有9個(gè)Phi類GST基因，單子葉植物水稻中有17個(gè)Phi類GST基因，裸子植物油松中有7個(gè)Phi類GST基因，苔蘚植物小立碗蘚中有10個(gè)Phi類GST基因[16-17]，而本研究中江南卷柏只有兩個(gè)Phi類GST基因，說明相對(duì)于其他類型植物，蕨類植物可能需要更少的Phi類GST基因。另外，在毛果楊的9個(gè)Phi類GST基因中有7個(gè)是組成型表達(dá)[11]，油松中的7個(gè)Phi類GST基因都是組成型表達(dá)[16]，本研究克隆到的2個(gè)江南卷柏Phi類GST基因在根、莖和葉中均有表達(dá)，可能是組成型表達(dá)基因，預(yù)示著Phi類GST基因可能在江南卷柏生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。

系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，和在進(jìn)化樹上聚在一起，而且兩個(gè)基因的序列高度相似，氨基酸序列相似性為98.14%，表明它們可能是在江南卷柏與其他類型植物分化之后最近通過基因重復(fù)產(chǎn)生的，然而蛋白活性分析發(fā)現(xiàn)，SmGSTF1蛋白對(duì)CDNB、NBD-Cl、NBC、Fluorodifen和Cum-OOH都有活性，而SmGSTF2蛋白只對(duì)CDNB、NBD-Cl和NBC有活性，說明這兩個(gè)蛋白的底物譜已經(jīng)發(fā)生了分化。對(duì)NBD-Cl的催化活性，SmGSTF1是SmGSTF2的1.89倍，對(duì)NBC的催化活性，SmGSTF1是SmGSTF2的14.67倍，蛋白生化活性差異預(yù)示著SmGSTF1和SmGSTF2存在著功能分化。

酶動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SmGSTF1蛋白對(duì)CDNB的親和力是SmGSTF2 的2.4倍，然而由于SmGSTF1對(duì)CDNB的轉(zhuǎn)換數(shù)cat值比SmGSTF2高，導(dǎo)致兩種蛋白對(duì)CDNB的催化效率catm值沒有差別，說明在SmGSTF1和 SmGSTF2對(duì)CDNB的催化反應(yīng)中，與底物結(jié)合以及與底物結(jié)合后所發(fā)生的電子轉(zhuǎn)移或者產(chǎn)物的釋放速率對(duì)于兩個(gè)蛋白的催化功能都很重要。

蕨類植物是最早脫離水體束縛，最早適應(yīng)陸地生態(tài)環(huán)境和最早出現(xiàn)維管組織的類群。蕨類植物從水生到陸生，體內(nèi)必然存在一套機(jī)制來適應(yīng)復(fù)雜的陸地環(huán)境。對(duì)SmGSTF1和SmGSTF2在不同pH和溫度條件下進(jìn)行活性分析發(fā)現(xiàn)，它們?cè)趐H 6.0?9.5，以及30?65 ℃范圍內(nèi)均具有較高的催化活性，表明這兩個(gè)蛋白能在比較寬的環(huán)境變化條件下發(fā)揮功能，預(yù)示著SmGSTF1和SmGSTF2對(duì)于江南卷柏適應(yīng)復(fù)雜的陸地環(huán)境具有重要作用。

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Molecular characteristics of two Phi glutathione-transferases in

Yuanjie Zhang, Zhiling Yang, and Hailing Yang

,,100083,

Glutathione-transferase (GST) is important in plants to resist various stresses. In this study, two Phi GST genes (and) were cloned from.andgenes encode proteins of 215 amino acid residues. Gene expression analysis showed that the two genes were expressed in roots, stems and leavesThe recombinant SmGSTF1 and SmGSTF2 proteins were overexpressed in, and purified by Ni-affinity chromatography. SmGSTF1 and SmGSTF2 had the catalytic activity towards 1-Chloro-2,4-Dieitrobenzene, 4-Chloro-7-nitro-1,2,3-benzoxadiazole (NBD-Cl), and 4-Nitrobenzyl chloride substrates. SmGSTF1 also had the activity towards Fluorodifen and Cumyl hydroperoxide (Cum-OOH), whereas SmGSTF2 not. The enzyme kinetics analysis showed that SmGSTF1 and SmGSTF2 had high affinity towards glutathione, and low affinity towards 1-Chloro-2, 4-Dieitrobenzene. The enzymatic activity of SmGSTF1 and SmGSTF2 had high catalytic activity between pH 7 and 8.5, and between 45 and 55 °C. SmGSTF1 and SmGSTF2 may have an important role in the resistance ofagainst stress.

, glutathione-transferase, gene expression, enzymatic activity

October 16, 2015; Accepted: January 6, 2016

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Zhang YJ, Yang ZL, Yang HL. Molecular characteristics of two Phi glutathione-transferases in. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 927–936.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31270641).

Corresponding author: Hailing Yang. Tel/Fax +86-10-62590843; E-mail: yhailing77@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31270641) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160126.0933.002.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)