王穎，任吉龍，宋玉然，海棠，周琪，劉忠華

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不同培養(yǎng)體系對(duì)鼠-豬異種嵌合胚胎發(fā)育和嵌合能力的比較

王穎1,2，任吉龍2，宋玉然2，海棠2，周琪2，劉忠華1

1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030 2 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所 干細(xì)胞與生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

近年來(lái)，隨著干細(xì)胞分化與再生醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，異種嵌合已成為當(dāng)前干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題，并有望為未來(lái)解決器官移植供體來(lái)源嚴(yán)重短缺等再生醫(yī)學(xué)難題開(kāi)辟新的方向。異種嵌合以及異種器官再造過(guò)程中面臨眾多科學(xué)問(wèn)題和技術(shù)難題，而異種嵌合過(guò)程中嵌合胚胎時(shí)期的選擇，后續(xù)培養(yǎng)液的選擇以及這些環(huán)節(jié)所造成的供體細(xì)胞與受體胚胎之間的發(fā)育平衡成為建立異種器官再造的第一個(gè)科學(xué)問(wèn)題。豬由于具有與人類(lèi)器官大小相似、繁殖快等特點(diǎn)，成為異種嵌合最適合的潛在研究對(duì)象。為了提高鼠-豬異種嵌合胚胎中小鼠供體細(xì)胞——誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞 (Induced pluripotent stem cells, iPSCs) 的存活率和增殖率，我們嘗試以iPSCs培養(yǎng)液 (N2B27) 以及N2B27→PZM-3梯度更換的培養(yǎng)液 (N2B27(3.5 h)) 作為研究異種嵌合胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)的對(duì)象，并與豬胚胎培養(yǎng)液 (PZM-3，Porcine zygotic medium)體系下發(fā)育進(jìn)行比較，從而評(píng)價(jià)了這3種培養(yǎng)液在8-細(xì)胞和囊胚期注射后，對(duì)嵌合胚胎后續(xù)發(fā)育的影響及嵌合情況。結(jié)果顯示，8-細(xì)胞期注射后，PZM-3不僅對(duì)嵌合胚胎的后續(xù)發(fā)育較為有利，更有利于小鼠iPS嵌合到豬胚胎中；囊胚期注射后3種培養(yǎng)體系下GFP陽(yáng)性嵌合率差異不顯著，但其嵌合率顯著低于8-細(xì)胞期嵌合率。結(jié)果表明，PZM-3培養(yǎng)體系更有利于鼠-豬異種嵌合胚胎的體外發(fā)育，對(duì)8-細(xì)胞期胚胎進(jìn)行嵌合操作有益于提高鼠-豬異種嵌合后胚胎的嵌合率。

異種嵌合，誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞，嵌合注射，體外發(fā)育，豬

嵌合體 (Chimera) 是由不同遺傳組成的細(xì)胞或者組織構(gòu)成的嵌合生物個(gè)體。隨著對(duì)發(fā)育生物學(xué)和干細(xì)胞領(lǐng)域研究的不斷深入，嵌合個(gè)體的制備已成為研究干細(xì)胞體內(nèi)分化能力的有效方法之一[1]。通過(guò)四倍體嵌合補(bǔ)償技術(shù)獲得誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞 (Induced pluripotent stem cells, iPSCs) 來(lái)源的小鼠[2-3]，使得四倍體嵌合成為干細(xì)胞多能性檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。目前除小鼠外，大鼠[4]、兔[5]、羊[6]和牛[7]、豬[8]等哺乳動(dòng)物已獲得嵌合個(gè)體，這對(duì)胚胎細(xì)胞發(fā)育分化的研究和特殊物種基因保存、動(dòng)物育種、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究等眾多領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。此外，由嵌合體本質(zhì)屬性——組織嵌合所衍生而來(lái)，通過(guò)物種間嵌合體的制備，研究其組織、器官在生理、生化、代謝水平甚至疾病病理、發(fā)病模式的遺傳相關(guān)性的問(wèn)題，近年來(lái)已逐漸成為廣大研究學(xué)者關(guān)注的新熱點(diǎn)。目前，已得到成活的異種嵌合體有山羊-綿羊嵌合體[9]、小鼠-大鼠嵌合體[10]、黃牛-水牛及馬-斑馬屬間嵌合體，以及小鼠-人[11]，小鼠-猴子嵌合胎兒[12]；除此之外，已有報(bào)道表明，利用大鼠ES/iPS的全能性對(duì)胰腺器官缺陷小鼠模型進(jìn)行胚胎嵌合補(bǔ)償，獲得了大鼠胰腺對(duì)缺陷小鼠補(bǔ)償?shù)某苫钚∈髠€(gè)體[13]，并通過(guò)卵裂球嵌合方法，使胰腺缺陷豬胚胎獲得了由不同遺傳背景正常豬胚胎發(fā)育而來(lái)的豬胰腺，出生后能夠正常存活的豬只個(gè)體[14]，這些胰腺器官伴隨著胚胎個(gè)體發(fā)育而分化、成熟，并在異源缺陷個(gè)體體內(nèi)發(fā)揮正常的生理作用。由此可見(jiàn)，異種嵌合動(dòng)物的研究可以為未來(lái)探索臨床醫(yī)學(xué)疾病的發(fā)病機(jī)理帶來(lái)新方向和新方法，尤其為解決目前器官移植面臨的諸多問(wèn)題提供了新的治療方案[15]。

小鼠作為一種常用的嚙齒類(lèi)模式動(dòng)物，成為眾多學(xué)者和研究人員熱衷的研究對(duì)象，針對(duì)其細(xì)胞多能性的研究也較為透徹。豬，作為一種重要的偶蹄類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，因其在解剖學(xué)、生理學(xué)以及器官發(fā)育和疾病作用機(jī)制方面與人類(lèi)有諸多相似性，近年來(lái)成為人類(lèi)疾病在臨床前研究以及未來(lái)器官替代來(lái)源等方面較為理想的動(dòng)物模型。因此，以豬、鼠這兩種親緣較遠(yuǎn)的模式動(dòng)物作為研究異種嵌合體的對(duì)象，對(duì)研究異種嵌合體特異性生理生化和疾病機(jī)理，未來(lái)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物-豬異種嵌合動(dòng)物的生產(chǎn)，甚至是在豬體內(nèi)得到人源化器官奠定基礎(chǔ)。模擬人類(lèi)自體免疫系統(tǒng)對(duì)異源 (種) 組織、細(xì)胞的免疫攻擊作用，以及新藥物開(kāi)發(fā)、毒性檢測(cè)等，具有重要的臨床前研究?jī)r(jià)值。

制備嵌合體的常用方法主要有聚合法和顯微注射法。聚合法是將目的干細(xì)胞或發(fā)育階段的胚胎 (8-細(xì)胞期) 與去除透明帶的早期胚胎 (4-，8-細(xì)胞期或桑椹期的胚胎) 置于培養(yǎng)微環(huán)境，利用細(xì)胞/胚胎-胚胎表面分子相互作用并伴隨胚胎發(fā)育進(jìn)程發(fā)育至嵌合個(gè)體的方法[16-18]。由于胚胎聚合法耗時(shí)較長(zhǎng)，且對(duì)培養(yǎng)條件要求較高，因此，目前實(shí)驗(yàn)制備過(guò)程多選用顯微注射法[19]。顯微注射法是指通過(guò)顯微操作將目的干細(xì)胞注入早期胚胎 (8-細(xì)胞、桑椹、囊胚期) 從而得到嵌合體的方法，其中，因桑椹胚期是由8-細(xì)胞向囊胚發(fā)育的中間胚胎狀態(tài)，在生成過(guò)程中卵裂球高度致密化，而在操作過(guò)程中可能會(huì)對(duì)胚胎造成損傷，造成因?qū)嶒?yàn)操作而導(dǎo)致胚胎死亡率升高。因此，在實(shí)際操作中主要以8-細(xì)胞、囊胚期注射制備嵌合體較為常用。

本研究以小鼠iPSCs為嵌合供體細(xì)胞，對(duì)豬8-細(xì)胞、囊胚期胚胎進(jìn)行顯微注射后，分別于豬胚胎培養(yǎng)液 (PZM-3)，小鼠iPSCs培養(yǎng)液 (N2B27) 以及在N2B27培養(yǎng)3.5 h后轉(zhuǎn)移至PZM-3 (N2B27(3.5 h)) 3種培養(yǎng)體系培養(yǎng)，并分析、比較了8-細(xì)胞、囊胚期注射方法在3種體外發(fā)育體系下對(duì)鼠-豬異種嵌合胚胎體外發(fā)育及嵌合率的影響，并用胚胎體外貼壁方法對(duì)鼠-豬異種嵌合胚胎中小鼠多能性維持進(jìn)行了初步探索，以期對(duì)后續(xù)異種嵌合發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞功能提供初步證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用豬卵巢來(lái)自北京市第五肉聯(lián)集團(tuán)有限公司。小鼠iPSCs來(lái)源于本研究組。

1.2 方法

1.2.1 小鼠iPSCs的培養(yǎng)及傳代

實(shí)驗(yàn)所用iPSCs系為1011，是由B6D2F1小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)得到的Oct4-GFP表達(dá)的多潛能干細(xì)胞系。其培養(yǎng)方法為復(fù)蘇1011細(xì)胞于絲裂霉素C預(yù)先處理得到的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞來(lái)源的飼養(yǎng)層上，所用培養(yǎng)液為N2B27(成分詳見(jiàn)Gu等[20]實(shí)驗(yàn)方法)，每日換液；培養(yǎng)至第3天，用Tryple消化并吹打，按1∶3比例重新接種于新鮮鋪被飼養(yǎng)層上，完成傳代培養(yǎng)。

1.2.2 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)及孤雌激活

從屠宰場(chǎng)獲得豬卵巢置于裝有提前預(yù)熱至30?35 ℃的生理鹽水 (含青霉素和硫酸鏈霉素) 的保溫桶里2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。抽取卵巢表面直徑為3?6 mm卵泡，收集內(nèi)容物 (含COCs、卵泡液、顆粒細(xì)胞等) 用HEPES-緩沖液 (PVA-TL-HEPEs)洗滌沉淀5 min；重復(fù)2遍后，在倒置顯微鏡下挑取包裹帶有完整卵丘細(xì)胞層的卵母細(xì)胞，用口吸管撿出放于38.5 ℃、5% CO2進(jìn)行成熟培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)液為改進(jìn)的TCM199加10%卵泡液。成熟培養(yǎng)42?44 h后，于1 mg/mL透明質(zhì)酸酶中吹打至卵丘細(xì)胞完全脫離，挑取卵周隙明顯、胞質(zhì)均勻、第一極體形態(tài)良好卵母細(xì)胞備用。將挑選得到的成熟卵母細(xì)胞依次放于預(yù)先浸于融合液的電極間，用直流電擊 (1.2 kV/cm，30 μs，2次脈沖) 對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，激活后的胚胎放于PZM-3中38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)，所用融合液為含1.0 mmol/L Ca2+和0.1 mmol/L Mg2+的3%甘露醇溶液；融合儀為德國(guó)Eppendorf公司的22331系統(tǒng)。

1.2.3 顯微注射1011細(xì)胞系

選取生長(zhǎng)良好的1011細(xì)胞集落，Tryple消化作用2?3 min，,吹打至單個(gè)細(xì)胞，放置于預(yù)先1%明膠鋪被的皿中，37 ℃、5% CO2處理20 min去除飼養(yǎng)層細(xì)胞，制備iPSCs細(xì)胞懸液作為嵌合供體細(xì)胞備用。挑取孤雌激活后3 d的8-細(xì)胞期胚胎，及6 d囊胚期胚胎用于嵌合胚胎受體，將iPSCs和胚胎受體放于操作液中，固定針吸取胚胎，注射針吸取8?10個(gè)細(xì)胞，注射入8-細(xì)胞期胚胎透明帶下的卵裂球間隙或囊胚腔中。所用固定針內(nèi)徑為30 μm，注射針直徑為20 μm，操作液為含5 mg/mL BSA的TCM199，顯微操作系統(tǒng)為Eppendorf的NKⅡ。

1.2.4 嵌合胚胎的體外培養(yǎng)

操作后胚胎分別放于PZM-3、N2B27，以及N2B27培養(yǎng)3.5 h后轉(zhuǎn)入PZM-3這3種培養(yǎng)體系，38.5 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。孤雌激活當(dāng)天為d0，培養(yǎng)至d7統(tǒng)計(jì)各個(gè)培養(yǎng)體系下囊胚數(shù)目，顯微鏡下觀察綠色熒光的嵌合表達(dá)情況。

1.2.5 熒光分析統(tǒng)計(jì)嵌合率

將不同培養(yǎng)體系下收集得到的囊胚于4% PFA (多聚甲醛) 過(guò)夜固定，0.05% Triton透膜后，用10 mg/L Hoechst33342染色，壓片后于激光共聚焦顯微鏡 (德國(guó)蔡司公司) 下觀察。

1.2.6 單囊胚DNA提取及PCR檢測(cè)

1011細(xì)胞系，豬野生型組織分別按DNA提取試劑盒 (天根試劑盒) 提取DNA，挑取各個(gè)實(shí)驗(yàn)組囊胚以及注射后未培養(yǎng)的d6囊胚進(jìn)行單囊胚DNA提取，具體方法可參考Wang等[21]實(shí)驗(yàn)步驟；以小鼠基因序列特異引物 (表1) 進(jìn)行PCR測(cè)定,實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5軟件中通用程序中2WAY ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1基因特異引物序列

Table 1 Primer sequences ofgene

1.2.7 嵌合囊胚體外貼壁及觀察

將PZM-3培養(yǎng)體系下，d7嵌合囊胚去透明帶后接種于預(yù)先鋪被的飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)5 d后顯微鏡下觀察其貼壁情況、每天換液，并注意觀察其熒光表達(dá)情況。所用顯微鏡為倒置顯微鏡DMI 3000B (德國(guó)LEICA公司)，熒光激發(fā)器EL6000。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠-豬8-細(xì)胞期嵌合胚胎在3種培養(yǎng)體系下發(fā)育率的比較

以豬孤雌8-細(xì)胞期胚胎為胚胎受體，小鼠iPSCs (1011細(xì)胞系) 為嵌合供體細(xì)胞 (圖1A) 顯微操作后分別培養(yǎng)于N2B27、PZM-3、N2B27 (3.5 h) 這3種培養(yǎng)體系培養(yǎng)，以未注射的豬孤雌8-細(xì)胞期胚胎為對(duì)照，每組120枚胚胎，各重復(fù)3次，到d7統(tǒng)計(jì)發(fā)育數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖1B所示，N2B27培養(yǎng)體系下，大部分胚胎發(fā)育停滯，未能發(fā)育至囊胚；PZM-3培養(yǎng)體系下嵌合胚胎的囊胚率顯著 (<0.05) 高于N2B27 (3.5 h)體系 (22%±2.6% vs 3.3%±1.5%)，證明其對(duì)嵌合胚胎的后續(xù)發(fā)育較為有利。

圖1 嵌合供體細(xì)胞及不同體系下8-細(xì)胞注射發(fā)育情況

2.2 8-細(xì)胞期、d6囊胚期注射在不同培養(yǎng)體系下小鼠細(xì)胞增殖情況及嵌合率比較

8-細(xì)胞期、d6囊胚期胚胎分別注射8?10個(gè)miPSCs后進(jìn)行培養(yǎng)至d7，于熒光顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察 (圖2)。為精確確定GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例，收集不同培養(yǎng)體系下2種嵌合注射時(shí)期發(fā)育得到的囊胚，通過(guò)4% PFA固定，Hoechst細(xì)胞核染色，封片，觀察后統(tǒng)計(jì)、比較不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)下的小鼠GFP陽(yáng)性細(xì)胞在異種嵌合囊胚的占比 (嵌合率)。結(jié)果如表2所示，8-細(xì)胞注射后，GFP陽(yáng)性細(xì)胞均有不同比例增殖，PZM-3嵌合率顯著高于N2B27 (3.5 h) 體系培養(yǎng)體系 (<0.001)，且如圖3所示，內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (Inner cell mass, ICM) 中有GFP熒光表達(dá)細(xì)胞分布，值得注意的是，N2B27體系下所檢測(cè)均為囊胚類(lèi)似物，其GFP熒光表達(dá)較強(qiáng)，而豬胚胎細(xì)胞很少；囊胚期注射后，GFP陽(yáng)性細(xì)胞增殖能力較差，且在3種培養(yǎng)體系下嵌合率差異不顯著。

圖2 8-細(xì)胞、囊胚期嵌合注射后在3種培養(yǎng)體系下體外發(fā)育及GFP蛋白表達(dá)結(jié)果 (100 μm)

表2 不同胚胎嵌合時(shí)期和培養(yǎng)體系對(duì)嵌合胚胎內(nèi)小鼠iPSCs細(xì)胞增殖及嵌合比率的影響(±)

Table 2 Numbers of mouse iPSCs and chimeric rates in chimeric embryos at different chimeric stages & in different culture systems (±)

Different superscripts in the same column show significant differences; a, b indicate<0.001.

圖3 體外不同發(fā)育體系下囊胚嵌合情況

2.3 鼠-豬嵌合胚胎的DNA鑒定

分別收集3種培養(yǎng)體系下8-細(xì)胞期注射得到的d7囊胚，囊胚期嵌合操作培養(yǎng)前、后的胚胎為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行單囊胚DNA提取，以小鼠基因設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行嵌合胚胎的PCR檢測(cè)，同時(shí)以嵌合供體細(xì)胞系1011、豬野生型DNA為對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)圖4所示，實(shí)驗(yàn)組均不同程度的檢測(cè)到小鼠特異性序列的存在，同1011陽(yáng)性對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果一致。

圖4 嵌合單囊胚DNA檢測(cè)結(jié)果

2.4 鼠-豬嵌合胚胎的建系

為研究鼠-豬異種嵌合胚胎培養(yǎng)體系對(duì)小鼠來(lái)源iPSCs潛能性的影響，將8-細(xì)胞期胚胎注射后得到的d7囊胚，消化去除透明帶，接種于飼養(yǎng)層上進(jìn)行胚胎貼壁培養(yǎng)，于N2B27培養(yǎng)5 d，結(jié)果如圖5所示，可見(jiàn)嵌合胚胎貼壁后形成的細(xì)胞集落，從形態(tài)學(xué)角度來(lái)講，該形態(tài)既不同于小鼠iPSCs克隆形態(tài)，也不同于豬ICM貼壁后形成的細(xì)胞集落，因此，可能是豬與小鼠2種細(xì)胞所形成的混合狀態(tài)，且小鼠來(lái)源Oct4-GFP熒光表達(dá)細(xì)胞增殖較快且分布集中，表明體外異種嵌合胚胎培養(yǎng)體系可以支持小鼠iPS潛能性的維持。

圖5 嵌合囊胚貼壁7 d觀察 (50 μm)

3 討論

嵌合體，是由不同遺傳組成有機(jī)整合形成的統(tǒng)一個(gè)體。應(yīng)用嵌合體的這一屬性，對(duì)嵌合體的研究，甚至是人-動(dòng)物異種嵌合模式，可以為研究臨床疾病的發(fā)病機(jī)理帶來(lái)新的研究方向和方法，為未來(lái)器官移植提供新的治療方案[22]。然而，由于目前得到的人源多潛能性干細(xì)胞潛能還存在一定的局限性，且人-動(dòng)物異種嵌合動(dòng)物勢(shì)必會(huì)涉及倫理學(xué)問(wèn)題[23]，以及異種嵌合可能會(huì)涉及到制備方法的選擇、胚胎發(fā)育時(shí)程差異、異源組織、器官之間可能發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)[24]等問(wèn)題，解決這些相關(guān)問(wèn)題還需要進(jìn)一步摸索和研究。因此，選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間進(jìn)行異種嵌合研究較為適宜。其中，豬作為重要的農(nóng)畜類(lèi)動(dòng)物之一，由于其與人類(lèi)具有極為相似的解剖學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)特征[25]，已作為探究人類(lèi)生命科學(xué)以及疾病機(jī)理不可或缺的模式生物；而小鼠作為最普遍、常用的模式動(dòng)物，在干細(xì)胞多能性維持及分化等方面的研究較為深入。因此，以豬、鼠兩種模式動(dòng)物作為異種嵌合研究具有重要的生物學(xué)意義。本研究以小鼠iPSCs作為嵌合供體細(xì)胞，豬孤雌激活后胚胎為嵌合受體胚胎，探索8-細(xì)胞、囊胚期兩個(gè)時(shí)期注射后形成的嵌合胚胎在體外3種培養(yǎng)體系中的發(fā)育、嵌合情況及小鼠iPSCs在嵌合胚胎內(nèi)多能性維持等問(wèn)題。

已有研究發(fā)現(xiàn)，嵌合體體內(nèi)嵌合效率的高低與供、受體種系[26]及嵌合胚胎受體時(shí)期 (8-細(xì)胞[18]、桑椹胚[17]以及囊胚階段的胚胎[16]) 有關(guān)，哺乳動(dòng)物傳統(tǒng)發(fā)育生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，8-細(xì)胞時(shí)期胚胎由于來(lái)源于4-細(xì)胞胚胎期的均等分裂，其各個(gè)卵裂球仍具有全能性；當(dāng)進(jìn)入桑椹期，胚胎內(nèi)各細(xì)胞因位置及連接因子的變化已開(kāi)始發(fā)生早期分化，且細(xì)胞連接致密化；隨著細(xì)胞的進(jìn)一步分裂，并按照膜表面分子特異表達(dá)進(jìn)行重排，繼而出腔形成具有胚胎發(fā)育潛能的內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (Inner cell mass, ICM) 和與母源組織進(jìn)行接觸的胚外組織——上滋外胚層 (Trophectoderm, TE)。因此，目前普遍認(rèn)為8-細(xì)胞及囊胚期胚胎作為小鼠嵌合體的供體胚胎是較為適宜的。一些研究組通過(guò)比較這兩種時(shí)期胚胎對(duì)嵌合體生成的影響，發(fā)現(xiàn)以8-細(xì)胞胚胎進(jìn)行嵌合注射得到的嵌合小鼠會(huì)獲得較高的嵌合體，與囊胚期嵌合相比甚至可以獲得更高的嵌合率 (80% vs 20%)，尤其在生殖系內(nèi)[27]。然而，由于豬胚胎干細(xì)胞面臨著建系難度大、多能性差[28]等諸多問(wèn)題，無(wú)法有效開(kāi)展豬嵌合體的研究。近年來(lái)隨著iPSCs研究的興起，為豬多能性干細(xì)胞的建立另辟蹊徑，2010年，首次獲得iPSCs嵌合豬個(gè)體，但未能嵌合進(jìn)入生殖嵴[29]；2013年，雖然通過(guò)調(diào)整重編程因子以轉(zhuǎn)換豬iPSCs的多能性狀態(tài)，但只得到嵌合胎兒[30]。因此，豬嵌合體研究目前仍然因?yàn)闊o(wú)法得到與小鼠ES多能性相媲美的多能干細(xì)胞而停滯不前。本實(shí)驗(yàn)基于傳統(tǒng)發(fā)育生物學(xué)理論研究，并借鑒對(duì)小鼠嵌合體制備方法的認(rèn)識(shí)，通過(guò)對(duì)8-細(xì)胞、囊胚期豬孤雌胚胎與小鼠iPSCs的異種嵌合操作，研究這兩種注射于不同胚胎時(shí)期的嵌合胚胎,在不同體外培養(yǎng)體系的體外發(fā)育情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8-細(xì)胞期注射后，維持小鼠iPSCs潛能及增殖能力的培養(yǎng)體系——N2B27，不能維持嵌合胚胎的后續(xù)發(fā)育，表現(xiàn)為發(fā)育阻滯，而iPSCs在胚胎透明帶下無(wú)限增殖進(jìn)而形成類(lèi)囊胚結(jié)構(gòu)；為促進(jìn)嵌合供體iPSCs的早期增殖，體外N2B27處理3.5 h后再進(jìn)入PZM-3培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)iPSCs增殖不顯著，而對(duì)8-細(xì)胞期胚胎的后續(xù)發(fā)育有一定負(fù)面影響 (嵌合囊胚率3.3%±1.5% vs 對(duì)照組囊胚率5.0%±2.0%)；PZM-3培養(yǎng)體系下，嵌合囊胚能夠正常發(fā)育，且伴隨熒光的適量表達(dá)，由于顯微操作會(huì)對(duì)胚胎造成一定損傷的原因，嵌合囊胚率略低于對(duì)照組 (22%±2.6% vs 27.3%±2.5%) (圖1B)，但顯著高于以上兩組平行實(shí)驗(yàn)發(fā)育率。由此可以看出，對(duì)8-細(xì)胞期豬胚胎進(jìn)行異種嵌合注射，PZM-3培養(yǎng)是維持嵌合胚胎體外發(fā)育的重要培養(yǎng)條件。

繼而發(fā)現(xiàn)，影響異種嵌合胚胎的嵌合程度的高低主要取決于受體胚胎發(fā)育是否與供體細(xì)胞增殖相平衡。在研究對(duì)兩種胚胎時(shí)期嵌合注射后，異種嵌合胚胎在3種培養(yǎng)體系下嵌合率的比較后發(fā)現(xiàn)，3種培養(yǎng)體系下發(fā)育得到的囊胚均有不同程度嵌合，尤其在ICM內(nèi)有iPSCs嵌合表達(dá)，其中，囊胚期注射得到的嵌合胚胎在3種培養(yǎng)體系下GFP陽(yáng)性嵌合比率差異不顯著； 8-細(xì)胞期嵌合胚胎在PZM-3的嵌合率 (38.9%±10.3%)顯著高于其他兩種培養(yǎng)體系 (N2B27(3.5 h)，21.8%±2.5%；N2B27，0)，這可能與8-細(xì)胞期胚胎相對(duì)于早期囊胚期而言，胚胎發(fā)育的必需營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)維持其后續(xù)發(fā)育進(jìn)程至關(guān)重要，且在8-細(xì)胞期進(jìn)行嵌合注射為iPSCs延長(zhǎng)了增殖時(shí)間，這可能是8-細(xì)胞期注射優(yōu)于囊胚期注射的原因之一；其次，在最適于豬胚胎發(fā)育的PZM-3體系下，8-細(xì)胞期注射組的嵌合率明顯優(yōu)于囊胚期注射組，這可能說(shuō)明：異種嵌合胚胎體外發(fā)育過(guò)程中，選擇處于發(fā)育早期的8-細(xì)胞期作為嵌合受體胚胎可能為小鼠iPSCs提供更為適宜的生長(zhǎng)、增殖內(nèi)環(huán)境，利于iPSCs伴隨胚胎后續(xù)發(fā)育與胚胎進(jìn)行有機(jī)嵌合；而對(duì)早期囊胚注射后，iPSCs的增殖及嵌合程度不顯著，這可能與嵌合胚胎的內(nèi)環(huán)境改變有關(guān)。

進(jìn)一步地，通過(guò)對(duì)體外鼠-豬異種嵌合囊胚的重新建系，研究異種嵌合胚胎體外發(fā)育體系對(duì)小鼠iPSCs潛能性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從形態(tài)學(xué)角度上，得到的鼠-豬ESCs簇不同于小鼠iPSCs克隆形態(tài)，這可能與豬胚胎ICM與小鼠iPSCs在胚胎發(fā)育進(jìn)程中進(jìn)行細(xì)胞重排，及異源細(xì)胞表面分子相互作用存在差異有關(guān)，并且，小鼠iPSCs來(lái)源的熒光細(xì)胞在重建的集落中分布較為集中，表明小鼠來(lái)源iPSCs潛能性在異種嵌合胚胎體外發(fā)育體系得以維持，并伴隨豬胚胎發(fā)育進(jìn)程而生長(zhǎng)、增殖。這一發(fā)現(xiàn)，為PZM-3有利于鼠-豬異種嵌合胚胎中鼠源細(xì)胞的潛能性維持提供佐證，為鼠-豬異種嵌合體的進(jìn)一步研究提供了重要理論基礎(chǔ)。

異種嵌合研究，無(wú)疑成為當(dāng)前干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)研究的新課題，對(duì)解決修復(fù)受損器官及可供移植器官短缺等重大臨床醫(yī)學(xué)問(wèn)題具有重要意義。本研究通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，8-細(xì)胞期嵌合注射并在PZM-3培養(yǎng)條件下更有利于嵌合細(xì)胞的增殖及鼠-豬嵌合胚胎發(fā)育。本研究將為異種嵌合的后續(xù)研究提供良好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為下一步實(shí)現(xiàn)異種嵌合體的生成甚至異種嵌合體在臨床醫(yī)學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。

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development and chimeric efficiency of mouse-porcine interspecies chimeric embryos in different culture systems

Ying Wang1,2, Jilong Ren2, Yuran Song2, Tang Hai2, Qi Zhou2, and Zhonghua Liu1

1,,150030,,2,,,100101,

With the advancements of stem cells and regenerative medicine, interspecies chimera has become a hot topic and will pave a new way of providing donor sources in organ transplantation. However, the interspecies chimera is confronted with a number of scientific questions and technical obstacles, including selections of appropriate embryonic stage and appropriate culture medium; those factors will deeply influence the developmental balance between donor cells and receptor embryos. Due to its relatively rapid reproductive cycle and similar organ size to human’s, porcine is a very potential donor candidate to study these questions. To compare the development and chimeric efficiency of interspecies embryos, we tested and evaluated three different culture systems, PZM-3 (Porcine zygotic medium), culture medium for iPSCs (N2B27) and 3.5 h of N2B27 before PZM-3 (N2B27(3.5 h)), and two different embryonic stages, 8-cell and blastocyst in mouse-porcine chimeric embryos using parthenogenetically activated porcine embryos and mouse induced pluripotent stem cells (miPS). The results showed that, PZM-3 was beneficial for both development of chimeric embryos and miPSCs proliferation in porcine embryos in the 8-cell injection group. After early blastocyst injection, the chimeric efficiency did not appear significantly different among the three culture systems but was lower than 8-cell injection. In summary, the results suggest that 8-cell injection and PZM-3 culture medium are more beneficial to thedevelopment and chimeric efficiency of mouse-porcine chimeric embryos.

interspecies chimera, induced pluripotent stem cells, chimeric injection, embryo development, porcine

October 15, 2015; Accepted: November 24, 2015

王穎, 任吉龍, 宋玉然, 等. 不同培養(yǎng)體系對(duì)鼠-豬異種嵌合胚胎發(fā)育和嵌合能力的比較. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(7): 975–985.

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Supported by: National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2012CBA01300).

Corresponding author: Zhonghua Liu. Tel/Fax: +86-451-55191747; E-mail: liu086@126.com

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2012CBA01300) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)