趙　珺，張文廣，蘇　蕊，劉志紅，張燕軍，王　樂，付紹印，李金泉

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；2 內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010)

?

內(nèi)蒙古絨山羊骨骼肌蛋白差異表達(dá)譜分析

趙珺1，2，張文廣1，蘇蕊1，劉志紅1，張燕軍1，王樂1，付紹印1，李金泉1

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；2 內(nèi)蒙古化工職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010)

【目的】 研究內(nèi)蒙古絨山羊背最長肌、臂三頭肌和臀肌的蛋白差異表達(dá)譜?！痉椒ā?以3只在相同背景下飼養(yǎng)的絨山羊成年母羊?yàn)檠芯繉ο螅涝缀笕”匙铋L肌、臂三頭肌和臀肌3個(gè)部位骨骼肌，采用差異雙向電泳方法建立蛋白質(zhì)譜，找出17個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，并進(jìn)行質(zhì)譜分析?！窘Y(jié)果】 成功鑒定并匹配到 15個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中9個(gè)與山羊肌肉發(fā)育相關(guān)。背最長肌中發(fā)現(xiàn)的位于FGF2反義鏈的蛋白的功能主要是獨(dú)立控制FGF2的表達(dá)，同時(shí)具有激素調(diào)節(jié)和抗增殖的作用；背最長肌和臂三頭肌中發(fā)現(xiàn)的輕鏈肌球蛋白(MyLC)家族成員，其類型在2種肌肉組織中不同，功能是控制肌肉收縮。背最長肌和臂三頭肌中的MyLC蛋白分子質(zhì)量存在差異?！窘Y(jié)論】 建立了絨山羊骨骼肌差異蛋白譜，挖掘到了與肉質(zhì)相關(guān)的蛋白，其主要為控制肌肉收縮的結(jié)構(gòu)蛋白。

絨山羊；骨骼?。徊町惖鞍?；質(zhì)譜分析

在當(dāng)前農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)由粗放型向集約型過渡的情況下，單純地發(fā)展絨山羊或肉羊已經(jīng)不符合發(fā)展需要，發(fā)展絨肉兼用品種勢在必行。內(nèi)蒙古絨山羊以其優(yōu)質(zhì)的羊絨品質(zhì)而著稱，其所產(chǎn)山羊絨質(zhì)地柔軟、潔白、細(xì)度及光澤度好，同時(shí)內(nèi)蒙古絨山羊又具有肉質(zhì)鮮美、膽固醇含量低、富含多種必需氨基酸和不飽和脂肪酸等特性，如其肉用特性相關(guān)的分子機(jī)理得到挖掘，則對現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義，在產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)還能填補(bǔ)國內(nèi)對絨山羊肉質(zhì)系統(tǒng)研究的空白。國外學(xué)者對山羊肉的品質(zhì)研究起步較早，并取得了一定的進(jìn)展[1-2]。我國對羊肉的研究起步較晚，并且多集中在肉的產(chǎn)量和其生長速度方面[3]，對品質(zhì)的研究較少，應(yīng)用高通量技術(shù)(蛋白質(zhì)組技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組技術(shù))對山羊肉品質(zhì)的研究則更少?；蚪M在生物體內(nèi)相對比較穩(wěn)定，但其轉(zhuǎn)錄及翻譯受到許多因素的影響和制約。蛋白質(zhì)的表達(dá)也具有一定的可調(diào)節(jié)性，表達(dá)產(chǎn)物功能更活躍，更接近生物體本質(zhì)。因此，相對于轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，蛋白質(zhì)組學(xué)在肉類研究中的優(yōu)越性更為明顯。蛋白質(zhì)組學(xué)可以解決蛋白磷酸化、糖基化和水解、裂解等難題[4]。差異蛋白質(zhì)組學(xué)，又稱為比較蛋白質(zhì)組學(xué)，通常是對重大生理過程的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行比較，以對某些關(guān)鍵蛋白進(jìn)行定性和功能分析，從而揭示生物在生長發(fā)育過程中或在受到外界環(huán)境刺激后的反應(yīng)機(jī)理。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，雙向電泳是最重要的技術(shù)手段，但存在操作繁雜的缺點(diǎn)，實(shí)際工作中若要達(dá)到熟練應(yīng)用比較困難。然而雙向電泳在反映蛋白質(zhì)的種類、表達(dá)水平的變化等方面表現(xiàn)突出，因此被廣泛應(yīng)用[5]。動(dòng)物骨骼肌的生長發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，受到分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精確調(diào)節(jié)，其分子機(jī)制目前還不完全清楚，利用差異蛋白表達(dá)譜技術(shù)則能更好地闡明骨骼肌差異蛋白的功能和結(jié)構(gòu)。目前，差異蛋白質(zhì)組學(xué)在豬肉品質(zhì)研究中的應(yīng)用較多，且多數(shù)研究認(rèn)為肌肉的差異受環(huán)境因素的影響較少，主要體現(xiàn)在與糖酵解代謝相關(guān)的酶活性的差異上[6]。本研究利用基于雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，研究內(nèi)蒙古絨山羊背最長肌、臂三頭肌和臀肌的蛋白差異表達(dá)譜，初步篩選與肌肉發(fā)育相關(guān)的差異蛋白，旨在為從蛋白水平探討絨山羊肌肉發(fā)育的分子基礎(chǔ)提供依據(jù)，為揭示內(nèi)蒙古絨山羊的肉質(zhì)特色提供重要依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象新鮮的絨山羊背最長肌、臀三頭肌和臀肌采自內(nèi)蒙古白絨山羊種羊場。取3只成年周歲母羊，屠宰后取所需肌肉組織臨時(shí)用液氮保存，后存放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑磷酸鹽抽提緩沖液(PBS)、Bradford工作液、10×蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、1×蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、SDS，均為Sigma公司產(chǎn)品；尿素、硫脲、CHAPS、DTT、考馬斯亮藍(lán)蛋白含量測定試劑盒，均為Amresco公司產(chǎn)品；蛋白上樣緩沖液、甘氨酸、Tris、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)(CBB)G-250，均為Amresco公司產(chǎn)品；IPG干膠條(17 cm)、40 g/L Bio-lyte(pH 3～10)、碘乙酰胺、2-D clean up Kit試劑盒和礦物油，均為Bio.Ra公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純試劑，其中磷酸、硫酸銨、乙醇、冰醋酸購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司，甘油購自國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.1.3主要儀器高速冷凍離心機(jī)(德國HERMLE)，超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(江蘇寧波新芝)，酶標(biāo)儀(北京Biotek Synergy2)，等電聚焦儀、垂直電泳儀和圖像分析軟件(美國Bio-Rad公司)，掃描儀(UMAX)等。

1.2樣品制備及純化

采用液氮研磨加超聲破碎并純化的方法提取肌肉蛋白。取出-80 ℃保存的山羊肌肉樣品，迅速置于冰上。將肌肉樣品剪碎并稱取30 mg，在研缽中液氮研磨，分裝于EP管內(nèi)，按每g加入10 mL的比例加入裂解液，冰浴超聲波破碎：超聲5 s，間隔9 s，共10 min；冰浴30 min；4 ℃下15 000 r/min離心15 min；吸取上清(即總蛋白質(zhì))，采用2-D clean up kit試驗(yàn)劑盒進(jìn)行純化，BCA法測定蛋白濃度。

1.3內(nèi)蒙古絨山羊骨骼肌差異表達(dá)蛋白的電泳檢測

1.3.1第一向等電聚焦(Isoelectric focusing，IEF)從-20 ℃冰箱中取出長17 cm、pH 4～7的IPG干膠條，室溫溶解10 min；同時(shí)取出水化上樣液，待室溫溶解后加入2.5 μL 40 g/L Bio-lyte(pH 4～7)混勻。將混合水化上樣液與蛋白樣品溶液按體積比4∶1混勻作為上樣液。取150 μL上樣液(蛋白質(zhì)量濃度為200 mg/L)加入聚焦槽中，將IPG的保護(hù)膜撕下，膠面朝下，對準(zhǔn)正負(fù)級，滴加礦物油覆蓋，進(jìn)行IEF，設(shè)置等電聚焦程序?yàn)椋?0 V水化12 h；250 V線性升壓1 h，4次；1 000 V快速升壓30 min；1 000 V快速升壓2 h；10 000 V快速升壓到70 000 V，500 V不超過72 h。

1.3.2第二向電泳(SDS-PAGE)1)灌制二向凝膠。選擇適合17 cm IPG膠條的垂直電泳槽，按照Bio-Rad說明書安裝垂直電泳系統(tǒng)，在100 mL燒杯中配制12%的分離膠。

2)IPG膠條的平衡。IEF結(jié)束后，取出IPG膠條，膠面朝上進(jìn)行2次平衡，第1次將膠條放入平衡緩沖液Ⅰ(0.375 mol/L Tris-HCL (pH 8.8)、6 mol/L 尿素、20 g/L甘油、2 g/L SDS、2 g/L DTT)中，水平搖床緩慢振搖15 min；第2次換平衡緩沖液Ⅱ(0.375 mol/L Tris-HCL(pH 8.8)、6 mol/L尿素、20 g/L甘油、2 g/L SDS、2.5 g/L 碘乙酰胺)平衡15 min。

3)膠條的轉(zhuǎn)移和封膠。在等待膠條平衡的過程中，用濾紙將電泳槽內(nèi)已聚合的凝膠上層水分吸干待用；待2次平衡結(jié)束之后，取出膠條，用1×新鮮配制的電泳緩沖液淋洗其背面及側(cè)面，隨后將膠面朝上浸入到1×新鮮配制的電泳緩沖液中待用，使用前吸干膠條背面多余的液體。在凝膠的上方加入1～2 mL低熔點(diǎn)封膠液，用小鑷子將膠條膠面朝上推入凝膠(使膠條與凝膠的膠面完全貼合，不要留有間隙)。待封膠液徹底凝固之后將凝膠轉(zhuǎn)入到電泳槽中。

4)在電泳槽中加入1×電泳緩沖液，接通電源開始第二向電泳分離，先150 V電泳約5 min，再恒定電壓250 V電泳約4 h，直至溴酚蘭前沿達(dá)到底部邊緣時(shí)停止電泳，將凝膠小心從玻璃板上剝離，做好標(biāo)記。

1.3.3染色及脫色將凝膠在固定液(體積分?jǐn)?shù)40%乙醇、體積分?jǐn)?shù)10%醋酸)中固定4 h后，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中，搖床上振搖過夜，次日取出用超純水脫色直至背景無色。

1.3.4圖像掃描與分析脫色后的凝膠用UMAX進(jìn)行掃描，設(shè)定適當(dāng)?shù)姆直媛?一般為300 dpi)和對比度，保存2-DE圖像，用PDQuest 2.0軟件進(jìn)行分析。

1.4差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定

對挖取得到的差異蛋白點(diǎn)用胰酶分解后，進(jìn)行MALDI-TOF/MS質(zhì)譜分析，獲得肽指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting,PMF),通過數(shù)據(jù)庫搜索與蛋白文庫進(jìn)行比對分析，獲得蛋白質(zhì)的具體信息。

1.4.1蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解(1)斑點(diǎn)切取。用剪刀將 200 μL槍頭尖端剪掉1～2 cm，孔的直徑為 2～3 mm，用修剪后的吸頭從凝膠上戳取蛋白質(zhì)點(diǎn)，再轉(zhuǎn)入200 μL離心管中(離心管滅菌后浸泡于體積分?jǐn)?shù)為 75%的乙醇，用時(shí)取出自然干燥)。(2)脫色、脫水。每管加入 100 μL 脫色液(體積分?jǐn)?shù)為50% 的乙腈、25 mmol/L 碳酸氫銨)，室溫放置 30 min，吸去脫色液，重復(fù)以上步驟脫色至膠塊無色透明；加入 60 μL 乙腈使凝膠脫水 10 min。(3)酶解。每塊凝膠用胰蛋白酶溶液(10 ng/μL溶于25 mmol/L碳酸氫銨溶液中)覆蓋；冰浴30 min，去除多余酶液，加入25 μL 25 mmol/L 碳酸氫銨，37 ℃消化過夜；加體積分?jǐn)?shù)為5% 的甲酸(FA)終止反應(yīng)。將肽段溶液在凍干機(jī)中真空低溫凍干，以備質(zhì)譜鑒定。

1.4.2MALDI-TOF/TOF上機(jī)消化膠點(diǎn)樣品，將 1 μL 肽溶液點(diǎn)于Anchorchip靶板上；在室溫下晾干液滴，再點(diǎn)上 0.1 μL 基質(zhì)(CHCA)；將靶板置于質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測，設(shè)置儀器的參數(shù)為：檢測模式為反射模式，分辨率為50 000。默認(rèn)每張一級譜圖選擇5個(gè)母離子進(jìn)行二級鑒定。

1.4.3數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)庫的選擇是基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)鑒定策略中的重要一步，最終鑒定到的蛋白質(zhì)序列都來源于被選擇的數(shù)據(jù)庫。

本研究使用的數(shù)據(jù)庫為NCBI capra hircus(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein?term=txid9925%5BOrganism%5D&cmd=search)，去除冗余數(shù)據(jù)后有27 519條序列。

2　結(jié)果與分析

2.1內(nèi)蒙古絨山羊蛋白差異表達(dá)的雙向電泳分析

將雙向電泳獲得的山羊背最長肌、臂三頭肌及臀肌3個(gè)部位的2-DE圖像進(jìn)行分析，以差異倍數(shù)為2倍作為判定標(biāo)準(zhǔn)，絨山羊3個(gè)部位經(jīng)分析獲得差異表達(dá)蛋白點(diǎn)共17個(gè)(圖1)。其中4、8、9、10、13、15、16號來自背最長肌，1、2、3、5、6、11號來自臂三頭肌，7、12、14、17號來自臀肌。

圖 1　內(nèi)蒙古絨山羊3個(gè)部位骨骼肌差異蛋白2-DE圖M.蛋白標(biāo)樣；A.背最長肌；B.臂三頭肌；C.臀?。?～17.差異表達(dá)蛋白Fig.1　2-DE of three skeletal muscles of Inner Mongolia cashmere goatM.Protein Marker;A.Longissimus muscle；B.Triceps muscle；C.Glutaeus；1-17.Differential expressed proteins

2.2內(nèi)蒙古絨山羊骨骼肌肌肉組織蛋白質(zhì)譜分析

17個(gè)蛋白點(diǎn)除5、6號外，其余15個(gè)蛋白點(diǎn)可以匹配到對應(yīng)的蛋白質(zhì)(得分>50,置信度P<0.05,序列覆蓋范圍>20%)，結(jié)果見表1。

表 1　內(nèi)蒙古絨山羊骨骼肌差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定Table 1　MALDI-TOF-MS of different skeletal muscles for cashmere

注：蛋白點(diǎn)編號同圖1。

Note：Spot number is same with Fig 1.

由表1可知，這15個(gè)蛋白點(diǎn)均來自山羊，根據(jù)3個(gè)功能本體(細(xì)胞組分、分子功能和生物過程)對差異蛋白進(jìn)行GO功能注釋分類，差異蛋白的分子功能以鈣結(jié)合、催化為主。1、2、3、7、8、10、13、15、16號匹配的蛋白與肌肉發(fā)育相關(guān)，其中評分較高的差異蛋白點(diǎn)主要為輕鏈肌球蛋白家族，說明3個(gè)部位肌肉的生長發(fā)育主要受輕鏈肌球蛋白的影響。

3　討　論

雙向電泳技術(shù)需要大量的試驗(yàn)摸索，不同的研究對象從蛋白提取、加樣量、一向電泳程序到電泳條件和最后的染色都需要反復(fù)的嘗試[7-8]，即便是同樣的研究對象在作平行時(shí)也很難獲得一致的結(jié)果，所以對于雙向電泳而言，條件的建立和優(yōu)化更為重要。本研究正式試驗(yàn)前對上述所涉及的過程進(jìn)行了優(yōu)化，最后在優(yōu)化的條件下進(jìn)行試驗(yàn)得到了比較可靠的2-DE圖譜。首先，利用液氮研磨法、超聲破碎結(jié)合蛋白質(zhì)純化的方式制備樣品，效果優(yōu)于單純的液氮研磨法，純化可以有效地去除樣品中的雜質(zhì)，尤其是其中的鹽分，其可以增加導(dǎo)電性，影響聚焦過程，因此純化是必要的。另外，在膠條長度和pH值選擇方面，一般雙向電泳中，7 cm膠條分辨率差、上樣量小、聚焦時(shí)間短，適合做預(yù)試驗(yàn)，而長膠條分辨率高、上樣量大，適合于分析復(fù)雜樣品和正式試驗(yàn)，其膠圖蛋白點(diǎn)清晰便于質(zhì)譜鑒定。在pH 的選擇方面，發(fā)現(xiàn)pH為4～7時(shí)得到的蛋白點(diǎn)比pH為3～10更加集中。因此本研究選擇17 cm、pH 4～7的IPG干膠條進(jìn)行試驗(yàn)。此外，上樣量也是影響雙向電泳結(jié)果的因素之一，如果上樣量小，得到的蛋白點(diǎn)數(shù)少，無法呈現(xiàn)低豐度蛋白，而上樣量過大則會(huì)影響等電聚焦，圖譜會(huì)呈簇狀，不利于后續(xù)蛋白點(diǎn)的分離。本研究預(yù)試驗(yàn)通過設(shè)置不同的上樣量梯度對上樣量進(jìn)行摸索，發(fā)現(xiàn)上樣量以150 μL(蛋白質(zhì)量濃度200 mg/L)為好。在染色方面，考慮到后續(xù)的質(zhì)譜鑒定，采用考馬斯亮蘭染色。結(jié)果表明，采用上述條件得到的膠圖穩(wěn)定性和重復(fù)性都比較好。

3個(gè)部位骨骼肌差異蛋白質(zhì)的分子功能主要以結(jié)合、催化和代謝為主。其中在臀肌中高表達(dá)的蛋白7，屬于銅鋅超氧化物歧化酶家族，其具有助于減少核靶催化活性的棕櫚?；顽牾；约耙种葡噜彽你~催化位點(diǎn)活性等功能。有研究認(rèn)為，琥珀酸脫氫酶的增多標(biāo)志著肌纖維有氧代謝旺盛，這是紅肌纖維的重要特征，表明肌纖維易轉(zhuǎn)變?yōu)槁±w維[9]，據(jù)此可知山羊臀肌的肉質(zhì)比較細(xì)嫩。在背最長肌中高表達(dá)的蛋白15是Nudt 6，其基因位于FGF2基因相反的鏈，被認(rèn)為是2反義基因，其與FGF2基因表達(dá)呈反向關(guān)系，表明Nudt 6反義轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)FGF2表達(dá)。Nudt 6基因也被證明有激素調(diào)節(jié)和抗增殖作用，具有獨(dú)立FGF2表達(dá)的垂體行為。FGF2是堿性成纖維細(xì)胞生長因子，研究發(fā)現(xiàn)在肌肉組織中應(yīng)用FGF2可以提高肌肉的收縮應(yīng)力和松弛應(yīng)力[10]。說明Nudt 6基因?qū)∪獾氖湛s應(yīng)力有調(diào)控作用，可以作為肉質(zhì)的候選基因進(jìn)行深入研究。

肌球蛋白是一個(gè)含有多種同功蛋白的家族，由高度保守的多基因編碼，是骨骼肌的主要收縮蛋白。肌球蛋白分子由2個(gè)肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain,MyHC)和4個(gè)肌球蛋白輕鏈(Myosin light chain,MyLC)組成。肌球蛋白輕鏈所占的比例對肌纖維的生長和類型具有重要的作用[11]。雙向電泳只能分離分子質(zhì)量低于220 ku的蛋白，因此只能顯示肌球蛋白輕鏈，其類型包括快收縮型輕鏈和慢收縮型輕鏈[12-13]。肌球蛋白輕鏈對肌球蛋白酶催化超分子復(fù)合體的形成有重要作用，該復(fù)合體在肌紅蛋白(Mb)啟動(dòng)分化時(shí)開始合成，可能在胚胎發(fā)育中起重要的作用[14-15]，主要在慢收縮肌(氧化型肌肉)中表達(dá)[16]。一般快慢纖維可能決定快、慢異構(gòu)體在混合型纖維肌肉中的比例，如兔和鼠的隔膜含有的快速纖維比例較高，則快速肌球蛋白輕鏈堿性輕鏈異構(gòu)體所占比例更高些[17]，這表明快、慢型肌球蛋白輕鏈基因表達(dá)各自的纖維類型。當(dāng)氧化型(慢收縮肌)肌纖維比例高時(shí)，肌肉的品質(zhì)更優(yōu)。而當(dāng)酵解型(快收縮肌)纖維比例高時(shí)，肌肉的生長速度則更快。在本研究中，背最長肌中高表達(dá)的蛋白16為MYLPF，這與MYLPF基因在天府山羊背最長肌中高表達(dá)的研究結(jié)果[18]一致。MyLC2基因在臂三頭肌中的表達(dá)顯著高于其他2個(gè)部位，顯示臂三頭肌的酵解型肌纖維比例要高，表明該部位的生長速度可能更快，同時(shí)也說明該部位的肉質(zhì)明顯不如背最長肌和臀肌。所有這些結(jié)果顯示，MyLC家族在內(nèi)蒙古絨山羊骨骼肌中的表達(dá)具有肌纖維特異性。

本研究中，蛋白MyLC 1/3在絨山羊不同的組織中有不同的分子質(zhì)量，在背最長肌中約為16 ku，在臂三頭肌中約為21 ku。有研究發(fā)現(xiàn)，具有不同分子質(zhì)量的2種MyLC 1/3實(shí)際上由同一個(gè)基因編碼[19]。利用抗肌球蛋白堿性輕鏈抗體進(jìn)行體內(nèi)研究，發(fā)現(xiàn)早期胚胎相同的肌肉纖維中存在快、慢亞型的表達(dá)[20-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，相同的蛋白在不同種類哺乳動(dòng)物的組織中存在不同的分子質(zhì)量[22]，而本研究發(fā)現(xiàn)在同一種類動(dòng)物的不同組織也可以有不同分子質(zhì)量的同種蛋白，這說明分子結(jié)構(gòu)和氨基酸的組成決定了蛋白質(zhì)的差異，造成同種蛋白質(zhì)在不同的哺乳動(dòng)物甚至同種動(dòng)物的不同組織中具有不同的分子質(zhì)量，說明蛋白在不同組織的分化情況有差異。

目前對肉質(zhì)相關(guān)蛋白的研究主要集中在與肉質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白上，而動(dòng)物肌纖維中一半以上的蛋白都是與肌肉收縮機(jī)制相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白，若能對這些蛋白加以研究，則更有利于對肉質(zhì)形成機(jī)理的理解。本研究建立了內(nèi)蒙古絨山羊骨骼肌差異蛋白譜，找到了3種骨骼肌的差異蛋白，并挖掘到了與肉質(zhì)相關(guān)的基因，這將有助于揭示該品種不同部位肌肉肉質(zhì)差異的分子基礎(chǔ)，為內(nèi)蒙古絨山羊肉質(zhì)的開發(fā)及產(chǎn)量的提高提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為其他品種肉質(zhì)的研究提供了有價(jià)值的參考。

[1]Gibb M J.Performance of British Sannen,Boer×British Sannen and Anglo-Nubian castrated male kids from 8 weeks to slaughter at 28,33 or 38 kg live weight [J].Anim.Prod,1993,57:263-271.

[2]Owen J E，Norman G A.Studies on the meat production characteristics of Botswana goat and sheep-part 3 Carcass tissue composition and distribution [J].Meat Science,1978(2):59.

[3]羅軍.山羊肉的組織學(xué)特性及其與肉用性能關(guān)系的研究 [J].中國養(yǎng)羊，1992(2):384.

Luo J.Study on goat histological characteristics and its relation with the meat performance [J].Chinese Journal of Sheep Farming,1992(2):384.

[4]Pandey A,Mann M.Proteomics to study genes and genomes [J].Nature,2000,405(6788):837-846.

[5]Rabilloud T.Two-dimensional gel electrophoresis in proteomi-cs:old,old fashioned,but it still climbs up the mountains [J].Proteomics,2002,2(1):3-10.

[6]Kwasiborski A,Sayd T,Chambon C,et al.Pig longissimus lumborum proteome:part 1.effects of genetic background environment and gender [J].Meat Sci,2008,80:968-981.

[7]徐永杰.豬肌肉組織差異蛋白質(zhì)組學(xué) [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

Xu Y J.Differential proteome analysis of porcine skeletal muscle [D].Wuhan:Huazhong Agricultural University，2010.

[8]朱雅卿,韓劍眾,王彥波,豬骨骼肌雙向電泳樣品制備及等電聚焦方法研究 [J].中國食品學(xué)報(bào)，2009,9(3):99-104.

Zhu Y Q，Han J Z，Wang Y B．Studies on sample preparation of 2·DE and IEF method of pig skeletal muscle [J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2009,9(3):99-104.

[9]吳環(huán)成，胡燕.肌纖維類型及其轉(zhuǎn)變 [J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2005,2(3)：107-108.

Wu H C,Hu Y.Muscle fiber types and their transformation [J].Journal of Yangtze University (Nat Sci Edit),2005,2(3):107-108.

[10]葛新發(fā)，潘衛(wèi)東，董貴俊.利用堿性成纖維細(xì)胞生長因子包裹的磁性納米粒對大鼠急性骨骼肌鈍挫傷后肌肉收縮力與松弛特性恢復(fù)的影響研究 [J].中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2010,29(5):538-541.

Ge X F,Pan W D,Dong G J.Study of the contractive strength and muscle relaxation in rat skeletal muscles after acute contusion by using basic gibroblast growth factor-coated magnetic nanoparticles [J].Chinese Journal of Sports Medicine,2010,29(5):538-541.

[11]Chen J,Kubalak S W,Minamisawa S,et al.Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function [J].J Biol Chem,1998,273(2):1252-1256.

[12]Ghatpande S,Shafiq S,Siddiqui M A.Ventricular myosin light chain-2 gene expression in developing heart of chicken embryos [J].Biol Res,2001,34(1):1-6.

[13]Jiang P,Song J,Gu G,et al.Targeted deletion of the MLC1f/3f down-stream enhancer results in precocious MLC expression and mesoderm ablation [J].Dev Biol,2002,243(2):281-293.

[14]Bottinelli R.Functional heterogeneity of mammalian single muscle fibers:do myosin isoforms tell the whole story [J].Pflügers Archiv-European Journal of Physiology,2001,443(1):6-17.

[15]Gong G X.Molecular cloning,sequence identification and expression analysis of novel caprine MYLPF gene [J].Molecular Biology Reports,2013,40(3):2565-2572.

[16]Tannu N S,Rao V K,Chaudhary R M,et al.Comparative proteomes of the proliferating C(2)C(12) myoblasts and fully differentiated myo-tubes reveal the complexity of the skeletal muscle differentiation program [J].Mol Cell Proteomics,2004,3(11):1065-1082.

[17]Price K M,Little W A,Cummins P.Myosin adenosinetriphosphatase activity and light chain subunit com position of human right and left ventriele [J].Biochem J,1980,191:571-580.

[18]Coulombe P A,Omary M B.‘Hard’ and ‘soft’ principles defining the structure,function and regulation of keratin intermediate filaments [J].Curr Opin Cell Biol,2002,14:110-122.

[19]Robert B,Daubas P,Akimenko M A,et al.A single locus in the mouse encodes both myosin light chains 1 and 3,a second locus corresponds to a related pseudogene [J].Cell,1984,39:129-140．

[20]Matsuda G,Maita T,Umegane T.The primary structure of L-1 light chain of chicken fast skeletal muscle myosin and its genetic implication [J].FEBS Lett,1981,126:111-113．

[21]Obinata T,Masaki T,Takano H.Types of myosin light chains present during the development of fast skeletal muscle in chick embryo [J].J Biochem (Tokyo),1980,87:81-88．

[22]Owen J E,Norman G A.Studies on the meat production characteristics of Botswana goat and sheep-part 2 general body composition,carcass measurements and joint composition [J].Meat Science,1977(1):283-287.

Differentially expressed protein profiling of skeletal muscle of Inner Mongolia Cashmere goat

ZHAO Jun1，2,ZHANG Wenguang1,SU Rui1,LIU Zhihong1,ZHANG Yanjun1,WANG Le1,FU Shaoyin1,LI Jinquan1

(1KeyLaboratoryofAnimalBreedingandReproductioninInnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot,InnerMongolia010018,China;2InnerMongoliaVocationalCollegeofChemicalEngineering,Hohhot,InnerMongolia010010,China)

【Objective】 This study explored the differentially expressed protein profiling of longissimus muscle,triceps muscle and glutaeus in Inner Mongolia Cashmere goat.【Method】 Three skeletal muscles of three cashmere goats were obtained after being slaughtered.The protein mass spectrometry was established using 2-D difference gel electrophoresis method and 17 differential protein spots were found.【Result】 A total of 15 differential protein spots were successfully identified,among which 9 were related to the development of goat muscles.A protein in glutaeus was identified as a family member of copper zinc super oxide dismutase.A protein in longissimus muscle was annotated as locating at the antisense strand of FGF2 protein,which had the functions of controlling the expression of independent FGF2 and regulating hormone and anti-proliferation.Myosin light chains (MyLC) members were found in longissimus and triceps muscles with different types but same functions of controlling muscles contraction.MLC proteins had different molecular weights in the two muscles.【Conclusion】 The differential protein profiling of skeletal muscles of cashmere goats was established and the proteins related with meat quality were discovered,whose function was controlling muscle contraction.

Cashmere goat;skeletal muscle;two-dimensional electrophoresis;mass Spectrometry

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.001

2014-02-17

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z151)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260538)

趙珺(1980-)，女，內(nèi)蒙古赤峰人，副教授，在讀博士，主要從事食品營養(yǎng)與檢測研究。

E-mail:zhaojunivy@163.com

李金泉(1957-)，男，內(nèi)蒙古土左旗人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事絨山羊絨毛機(jī)理及育種研究。

E-mail:lijinquan_nd@126.com

S826.9

A

1671-9387(2016)08-0001-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160712.0845.002.html