萬春和，陳翠騰，傅秋玲，程龍飛，傅光華，陳紅梅，施少華，黃　瑜

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

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禽坦布蘇病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立

萬春和，陳翠騰，傅秋玲，程龍飛，傅光華，陳紅梅，施少華，黃瑜

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

【目的】 建立禽坦布蘇病毒(Avian Tembusu virus，ATmV)TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。【方法】 根據(jù)ATmV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的基因特征，設(shè)計特異性的引物和探針，建立基于TaqMan探針檢測ATmV的實時熒光定量PCR檢測方法，對其特異性、重復(fù)性進行檢測。用建立的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法和之前建立的RT-PCR方法同時對臨床15份疑似ATmV感染的病料進行檢測，計算其符合率?！窘Y(jié)果】 成功建立了檢測ATmV的實時熒光定量PCR檢測方法，當NS1基因含量為(2.67×102)～(2.67×107) 拷貝/μL時有良好的線性擴增，其擴增相關(guān)系數(shù)為0.998，擴增效率為99.9%。建立的ATmV實時熒光定量PCR檢測方法敏感度高，最低檢測限為2.67×102拷貝/μL；特異性強，對水禽常見病毒(如Ⅰ型鴨肝炎病毒、新型鴨呼腸孤病毒、禽流感病毒、禽Ⅰ型副粘病毒與番鴨細小病毒等)檢測均為陰性；重復(fù)性好，組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)分別為0.39%～1.17%和 0.51%～1.82%。對臨床送檢的15份病料，TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的陽性率為73.33%(11/15)，RT-PCR方法的陽性率為60.0%(9/15)，2種方法的符合率為100.0%?！窘Y(jié)論】 建立了基于TaqMan探針的ATmV實時熒光定量PCR檢測方法，該方法可應(yīng)用于ATmV感染的早期檢測。

禽坦布蘇病毒；NS1基因；TaqMan；實時熒光定量PCR方法

自2010年春季以來，我國南方種(蛋)鴨養(yǎng)殖廠發(fā)生一種以產(chǎn)蛋率急劇下降甚至停產(chǎn)為典型特征的鴨新發(fā)傳染病，臨床剖檢病變主要為卵巢發(fā)育不良，卵泡變性、出血或破裂。該病在不同地區(qū)、不同品種鴨群發(fā)病率高低不一，群內(nèi)發(fā)病率幾乎為100%，病死率為0～12%。國內(nèi)多家科研單位開展聯(lián)合攻關(guān)，鑒定該病為坦布蘇病毒(Tembusu virus)感染所致[1-4],隨后對坦布蘇病毒開展了大量的流行病學(xué)調(diào)查，先后從鵝、蛋雞、麻雀、鴿子和蚊子體內(nèi)分離到該病原[5]。本研究團隊結(jié)合坦布蘇病毒病感染的宿主分子流行病學(xué)特點，建議將該病病原命名為禽坦布蘇病毒(Avian Tembus virus，ATmV)[6]。

ATmV屬于黃病毒科黃病毒屬，其基因組長度為10 990 bp，含有一個長度為10 278 bp的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼含3 425個氨基酸的多聚蛋白(Polyprotein)，其各組成蛋白依次為5′-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS- 4B-NS5-3′[7]。目前，在ATmV快速檢測方面，已見有RT-PCR[8]、實時熒光定量PCR[9-10]、LAMP[10]、乳膠凝集[11]、免疫層析[12]和ELISA[13]等方法報道，其中的實時熒光定量PCR方法針對ATmV的囊膜蛋白E[9]和非結(jié)構(gòu)蛋白NS5[10]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，黃病毒科黃病毒屬非結(jié)構(gòu)蛋白NS1與病毒毒力密切相關(guān)，是一個較為保守的糖蛋白，被廣泛用于該屬病毒的快速診斷研究[14]。本研究根據(jù)ATmV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的基因特征，建立了操作簡便、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好、可實時定量分析ATmV感染程度的TaqMan實時熒光定量PCR方法，以期為ATmV的分子流行病學(xué)調(diào)查和早期感染研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗毒株和鴨胚Ⅰ型鴨肝炎病毒(DHV-Ⅰ)、新型鴨呼腸孤病毒(N-DRV)、禽流感病毒(AIV)、禽Ⅰ型副粘病毒(AMPV-Ⅰ)、番鴨細小病毒(MDPV)及ATmV雞源FQ-C1株、鴨源WR株和鵝源GD06株，均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離鑒定并保存。

9～11日齡健康麻鴨胚購自福建莆田某麻鴨養(yǎng)殖場，該麻鴨養(yǎng)殖場未免疫接種過ATmV相關(guān)疫苗，且未感染ATmV。對該麻鴨養(yǎng)殖場種鴨血清用本研究團隊前期建立的ATmV血清學(xué)方法[15]進行監(jiān)測，結(jié)果為陰性。

1.1.2試劑Premix ExTaqTM(Probe qPCR)(Code No. RR390Q)、One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)(Code No.RR064A)、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)(Code No.RR057A)、EASY Dilution(Code No.9160Q)，均購自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP209)、快速質(zhì)粒小提試劑盒(DP105)、病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(DP315)、pGM-T Fast連接試劑盒(VT207)，均購自天根生化科技(北京)有限公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑和耗材，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2ATmV TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立

1.2.1引物的設(shè)計與合成參考美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)公布的ATmV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的編碼基因特征，利用引物設(shè)計軟件Oligo(版本v 7.37)設(shè)計引物，引物序列為：NS1-TaqManF:5′-GGAGAGTGAACTCATCATA-3′，NS1-TaqManR:5′-GTCGAAGTCTATTACAATCTC-3′；并設(shè)計5′端標記FAM、3′端標記Eclipse的探針引物NS1-probe：5′-(FAM) ACCGAAGAGTCATCACAACACGA (Eclipse)-3′。將設(shè)計好的引物和探針在NCBI上進行BLAST，分析其特異性。引物和探針均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2陽性標準品的構(gòu)建根據(jù)ATmVNS1全長基因特征，利用引物設(shè)計軟件Oligo(版本v 7.37)設(shè)計特異性引物，引物序列為：NSF：5′-CCGGAATTCGAGGCTTGGA-3′和NSR：5′-CCGCTCGAGGACCTTTGATTTGAT-3′，用于擴增約1 000 bp的NS1全長基因片段，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(DP315)提取ATmV核酸RNA，按照PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)(Code No. RR057A)說明書進行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參考試劑盒說明書配制，反應(yīng)條件為：50 ℃ 反轉(zhuǎn)錄30 min后進行PCR反應(yīng)，PCR程序為：94 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP209)對特異性目的片段進行切膠回收。按照pGM-T Fast連接試劑盒(VT207)說明書將NS1基因片段克隆到pGM-T載體上，隨機挑取8個單菌落于含氨芐青霉素(含量為100 μg/mL)抗性的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)14 h后，利用快速質(zhì)粒小提試劑盒(DP105)提取相應(yīng)的質(zhì)粒。采用PCR擴增時的引物(NSF/NSR)和條件對提取的質(zhì)粒進行PCR鑒定，將篩選出的陽性重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST分析驗證，符合試驗預(yù)期的陽性重組質(zhì)粒作為實時熒光定量PCR的陽性標準品。利用微量核酸測定儀測定陽性重組質(zhì)粒的濃度，計算其拷貝數(shù)為2.67×107拷貝/μL，用EASY Dilution對其進行10倍連續(xù)稀釋，共稀釋5次(質(zhì)粒含量分別為2.67×106，2.67×105，2.67×104，2.67×103和2.67×102拷貝/μL)，分裝后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3反應(yīng)條件的優(yōu)化及標準曲線的建立按照Premix ExTaqTM(Probe qPCR)試劑盒說明書配制25 μL的實時熒光定量PCR反應(yīng)體系，在不同退火溫度(52，54，56，58，60，62和64 ℃)、引物濃度(2.5，5.0，10和20 μmol/L)及探針濃度(2.5，5.0，10和20 μmol/L)下進行實時熒光定量PCR，對反應(yīng)條件進行優(yōu)化。分別以質(zhì)粒含量為2.67×107，2.67×106，2.67×105，2.67×104，2.67×103和 2.67×102拷貝/μL的標準品作為模板，用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進行擴增，獲得擴增動力學(xué)曲線。以標準品起始拷貝數(shù)的常用對數(shù)(lgC)為橫坐標，以循環(huán)數(shù)閾值(Cycle threshold，Ct值)為縱坐標，推導(dǎo)出標準線性回歸方程(標準曲線)。

1.2.4特異性檢測用優(yōu)化后的實時熒光定量PCR條件分別對水禽其他常見病原DHV-Ⅰ、N-DRV、AIV、AMPV-Ⅰ、MDPV及雞源、鴨源和鵝源ATmV進行實時熒光定量PCR檢測。用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取相應(yīng)病毒的核酸RNA，按照One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)試劑盒說明書用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進行檢測，評價建立的實時熒光定量PCR方法的特異性。

1.2.5重復(fù)性試驗用建立的實時熒光定量PCR方法分別對質(zhì)粒含量為2.67×107，2.67×106，2.67×105，2.67×104，2.67×103和2.67×102拷貝/μL的標準品進行檢測，每種質(zhì)粒含量重復(fù)4次，計算組內(nèi)(Intra-group)變異系數(shù)。分別將上述不同質(zhì)粒含量的標準品分裝后置于-20 ℃保存，每隔7 d，用建立的實時熒光定量PCR方法進行檢測，共檢測4次，計算組間(Inter-group)變異系數(shù)。

1.3臨床樣品的檢測

對15份臨床送檢疑似ATmV感染的病料，用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取相應(yīng)的核酸RNA，按照One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)試劑盒說明書用優(yōu)化后的反應(yīng)條件，進行實時熒光定量PCR檢測。對實時熒光定量PCR方法檢測為ATmV陽性的病料，利用9～11日齡健康麻鴨胚進行病毒分離鑒定。同時，對15份臨床送檢疑似ATmV感染的病料用本研究團隊前期建立的常規(guī)RT-PCR方法[8]進行檢測，計算兩種檢測方法之間的符合率。

2　結(jié)果與分析

2.1ATmV實時熒光定量PCR檢測條件的優(yōu)化

優(yōu)化出的實時熒光定量PCR方法最佳反應(yīng)體系(25 μL)如下：Premix ExTaq(Probe qPCR) 12.5 μL、NS1-TaqManF 和NS1-TaqManR 引物(均為10 μmol/L)各0.6 μL、探針NS1-probe(10 μmol/L)0.4 μL、模板2 μL，補充滅菌去離子水至終體積25 μL。優(yōu)化出的實時熒光定量PCR方法最佳反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。

2.2ATmV實時熒光定量PCR的標準曲線

質(zhì)粒含量為(2.67×107)～(2.67×102) 拷貝/μL的標準品按優(yōu)化后的條件進行擴增，獲得擴增動力學(xué)曲線(圖1)。從圖1可以看出，本研究建立的實時熒光定量PCR方法最低檢測限為2.67×102拷貝/μL。以各標準品中質(zhì)粒含量(C)的常用對數(shù)(lgC)為橫坐標(x)，以循環(huán)數(shù)閾值(Cycle threshold，Ct值)為縱坐標(y)，獲得ATmV實時熒光定量PCR標準曲線(圖2)，其線性方程為y=-3.167x+38.93，方程斜率為-3.167，相關(guān)系數(shù)為0.998，擴增效率為99.9%，表明建立的實時熒光定量PCR方法的標準曲線具有良好的線性關(guān)系。

圖 1　ATmV實時熒光定量PCR擴增動力曲線 1～6分別代表質(zhì)粒含量為2.67×107、2.67×106、2.67×105、2.67×104、2.67×103和2.67×102 拷貝/μL標準品的擴增動力學(xué)曲線Fig.1　Dynamic curve for the real time PCR of avian Tembusu virus The plasmid concentrations of dynamic curves 1 to 6 were 2.67×107,2.67×106,2.67×105, 2.67×104,2.67×103 and 2.67×102 copies/μL,respectively

圖 2　ATmV實時熒光定量PCR標準曲線Fig.2　Standard curve for the real time PCR of avian Tembusu virus

2.3ATmV實時熒光定量PCR的特異性分析

從圖3可以看出，建立的實時熒光定量PCR方法僅對ATmV雞源FQ-C1株、鴨源WR株和鵝源GD06株有陽性擴增信號，對其他水禽常見病原DHV-Ⅰ、N-DRV、AIV、AMPV-Ⅰ和MDPV等均未檢測到熒光信號，表明建立的實時熒光定量PCR方法具有極強的特異性。

2.4ATmV實時熒光定量PCR的重復(fù)性

建立的實時熒光定量PCR檢測質(zhì)粒含量為(2.67×107)～(2.67×102) 拷貝/μL的標準品的組內(nèi)變異系數(shù)為0.39%～1.17%，組間變異系數(shù) 0.51%～1.82%(表1)。

2.5ATmV實時熒光定量PCR方法對臨床樣品的檢測

對15份臨床送檢疑似ATmV感染的病料分別進行實時熒光定量PCR和RT-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實時熒光定量PCR方法檢測有11份陽性樣品，陽性率為73.33%(11/15)；常規(guī)RT-PCR方法檢測有9份陽性樣品，陽性率為60.00%(9/15)；且RT-PCR檢測為陽性的9份樣品經(jīng)實時熒光定量PCR檢測均為陽性，符合率為100%?？梢姡瑢崟r熒光定量PCR方法較常規(guī)RT-PCR敏感性更高。利用麻鴨胚對實時熒光定量PCR檢測為陽性的11份樣品進行病毒分離，共分離到5株ATmV，對其進行實時熒光定量PCR和RT-PCR檢測，結(jié)果均為陽性。

3　討　論

黃病毒科黃病毒屬成員有53個代表種，其中27種可經(jīng)蚊蟲傳播，12種可經(jīng)蜱傳播。對ATmV基因組分析發(fā)現(xiàn)，其和經(jīng)蚊蟲傳播的Sitiawan病毒親緣關(guān)系較近[16]。當前，登革熱病毒(Dengue virus，DENV)被作為可經(jīng)蚊蟲傳播的黃病毒科黃病毒屬代表被廣泛研究。對DENV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白由3個結(jié)構(gòu)域組成，含有多種重要的B淋巴細胞和T淋巴細胞表位，可誘導(dǎo)機體自身保護性免疫，在病毒的致病機制和保護性免疫中具有重要作用，被廣泛應(yīng)用于DENV的早期快速鑒別診斷和亞單位疫苗靶標研究[17-18]。但研究發(fā)現(xiàn)，ATmV和DENV的流行病學(xué)方面存在較大差異，ATmV在冬天蚊蟲較少時仍傳播迅速，可通過直接接觸和氣溶膠傳播[19]。研究還發(fā)現(xiàn)，基于ATmV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1建立的NS1-ELISA不能對ATmV滅活疫苗免疫血清和自然感染血清進行鑒別診斷[20]，這和DENV的NS1蛋白可有效用于其鑒別診斷也不一致[21]。

圖 3　ATmV實時熒光定量PCR的特異性檢測 1.ATmV鴨源WR株；2.ATmV雞源FQ-C1株；3.ATmV鵝源GD06株； 4.其他水禽常見病原DHV-Ⅰ、N-DRV、AIV、AMPV-Ⅰ和MDPVFig.3　Specificity test for the real time PCR of avian Tembusu virus 1.Duck-origin ATmV strain WR;2.Chicken-origin ATmV strain FQ-C1;3.Goose-origin ATmV strain GD06;4.Common waterfowl viruses, such as duck hepatitis virus type 1,novel duck reovirus,avian influenza virus,avian paramyxovirus-Ⅰand Muscovy duck parvovirus表 1　ATmV實時熒光定量PCR的組內(nèi)和組間變異系數(shù)Table 1　Reproducibility test of intra-and inter-assay for the real-time PCR

質(zhì)粒含量/(拷貝·μL-1)Plasmidsconcentration組內(nèi)變異系數(shù)/%CVofintra-group組間變異系數(shù)/%CVofinter-group2.67×1070.530.652.67×1060.680.892.67×1050.390.512.67×1040.470.712.67×1030.720.972.67×1021.171.82

實時熒光定量PCR技術(shù)標準品的選擇對試驗結(jié)果至關(guān)重要，標準品需要與待檢測的樣本類型相同(或相似)[22-23]。在標準品的選擇上，有選用連續(xù)稀釋的病毒核酸RNA作標準品，用其建立實時熒光定量PCR的標準曲線，但提取的核酸RNA極易被RNase降解，易導(dǎo)致試驗結(jié)果的誤讀誤判，對試驗條件要求較高。還有研究發(fā)現(xiàn)，ATmV暴發(fā)的養(yǎng)鴨場工人可檢測到ATmV感染[24]，可見ATmV完整的病毒顆粒(或其基因組mRNA)具有感染性，因此不宜作為標準品[25]。另外，見有將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為標準品，該方法對RNA的提取質(zhì)量要求較高，不易大量制備，并在后續(xù)開發(fā)實時熒光定量PCR試劑盒時需多次反轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致試驗步驟復(fù)雜，且試驗過程中需多次開蓋，RNA污染和降解的幾率增大，無法滿足后續(xù)開發(fā)診斷試劑盒對標準品的一致性要求。本研究選用包含ATmVNS1基因擴增片段的質(zhì)粒作為標準品，該標準品純度高，質(zhì)量好，構(gòu)建好的質(zhì)?？砷L期保存，滿足了后續(xù)試驗的連續(xù)性和開發(fā)診斷試劑盒標準品的一致性要求。

本研究針對ATmV的NS1基因設(shè)計特異性的引物和探針，建立檢測ATmV的TaqMan實時熒光定量PCR方法，該方法對ATmV雞源FQ-C1株、鴨源WR株和鵝源GD06株檢測結(jié)果為陽性，對其他常見水禽病原檢測結(jié)果均為陰性，組內(nèi)試驗和組間試驗的變異系數(shù)低(最高僅為1.82%)，表明建立的實時熒光定量PCR方法特異性強、重復(fù)性好。用本研究建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法對臨床疑似ATmV感染的病料進行檢測，發(fā)現(xiàn)其檢測結(jié)果和常規(guī)RT-PCR符合率為100%，表明針對NS1基因建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法可有效用于開發(fā)ATmV的快速診斷試劑盒研究。

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Development of a TaqMan-based real-time PCR method for avian Tembusu virus

WAN Chunhe,CHEN Cuiteng,FU Qiuling,CHENG Longfei,FU Guanghua,CHEN Hongmei,SHI Shaohua,HUANG Yu

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicineofFujianAcademyofAgriculturalScience,FujianAnimalDiseaseControlTechnologyDevelopmentCenter,Fuzhou,Fujian350013,China)

【Objective】 This study developed a TaqMan-based real-time PCR method for avian Tembusu virus (ATmV).【Method】 A TaqMan-based real-time PCR method was developed for detection of ATmV with specific primers and probe targeting to the nonstructural 1(NS1) gene.The specificity and repeatability of the method were also detected.Fifteen suspected ATmV infection samples were tested by the established method and the coincidence rate was calculated by comparing with conventional RT-PCR method.【Result】 The successfully established real-time PCR method had good linear correlation whenNS1 gene content was (2.67×102)-(2.67×107) DNA copies/μL with correlation coefficient (R2) of 0.998 and efficiency of 99.9%.The lower detection limit was 2.67×102copies/μL.No amplification was detected from common waterfowl origin viruses,such as duck hepatitis virus type 1,novel duck reovirus,avian influenza virus,and avian paramyxovirus-Ⅰand Muscovy duck parvovirus.Reproducibility test showed that the intra- and inter-assay were 0.39%-1.17% and 0.51%-1.82%,respectively.Fifteen clinical samples were tested by the established TaqMan-based real-time PCR method and the RT-PCR method and their positive rates were 73.33% (11/15) and 60.0% (9/15),respectively.RT-PCR positive samples were tested positive by the real time PCR method,with the coincidence rate was 100.0%.【Conclusion】 The established TaqMan-based real-time PCR method provided a useful method for early diagnosis of avian tembusu virus.

avian Tembusu virus;NS1 gene;TaqMan;real time PCR method

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.008

2014-12-16

國家現(xiàn)代水禽產(chǎn)業(yè)體系項目(CARS-43)；福建省屬公益類項目(2015R1023-7)；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院“青年科技英才百人計劃”項目(YC2015-12)；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才創(chuàng)新基金項目(2014QA-7)

萬春和(1982-)，男，湖北鄂州人，助理研究員，在讀博士，主要從事水禽病原分子生物學(xué)研究。

E-mail:chunhewan@126.com

黃瑜(1965-)，男，江西寧都人，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事畜禽傳染病研究。E-mail:huangyu_815@163.com

S858.32

A

1671-9387(2016)08-0049-06

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