楊婧娟，李　娜，趙聲蘭（云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

一種酵素的配方優(yōu)化研究

楊婧娟，李娜，趙聲蘭*
（云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

以蘆薈、山楂、山藥、薏苡仁和枸杞為主要原料研制一種酵素食品。應(yīng)用最優(yōu)混料設(shè)計法研究各主要原料的不同組合對產(chǎn)品主要品質(zhì)指標(biāo)的影響，建立各原料配比與目標(biāo)值的回歸模型，最終獲得酵素最優(yōu)原料配方為：蘆薈10.00%、枸杞45.29%、山楂24.71%、山藥10.00%、薏苡仁10.00%。以該原料配方進行發(fā)酵，得到的產(chǎn)品蛋白酶活力293.04U/g，超氧物歧化酶（SOD）酶活力57.00U/g，多糖含量11.42mg/g，綜合評分為0.905 9。每克酵素樣對超氧陰離子的清除能力相當(dāng)于1mg抗壞血酸；每克酵素樣對Fe3+的還原能力相當(dāng)于129.25mg抗壞血酸；對大腸桿菌和金黃色葡萄球抑菌圈直徑分別為12mm、10mm，抑菌能力與陽性對照苯甲酸鈉相當(dāng)。說明酵素產(chǎn)品具有一定的抗氧化作用及抑菌活性。

酵素；混料設(shè)計；酶活；抗氧化作用；抑菌活性

酵素食品是含有豐富酶類、維生素、礦物質(zhì)及多種生物活性成分的功能性發(fā)酵食品，不僅可以促進正常新陳代謝，增強機體免疫，還具有消炎、抗菌、抗衰老、解毒、抗癌等功效［1］。由于生活壓力增大、環(huán)境污染等因素造成人體內(nèi)源性酶減少，食品精加工又使外源性酶受到破壞，不合理的飲食結(jié)構(gòu)引起營養(yǎng)素缺乏，機體易出現(xiàn)酶失衡或作用減弱，營養(yǎng)不均衡而呈現(xiàn)亞健康狀態(tài)。酵素食品可以有效調(diào)整機體酶系和營養(yǎng)平衡，使人體保持健康狀態(tài)，因此，酵素作為一種養(yǎng)生食品越來越受到認可和推崇。目前已在日本、美國、臺灣等地盛行，而在中國大陸發(fā)展相對緩慢，絕大多數(shù)酵素食品都源自進口，市場價格昂貴，對其制備方法進行科學(xué)研究具有巨大的價值。

混料設(shè)計法是研究產(chǎn)品中各種成分比例與指標(biāo)關(guān)系，進行配方優(yōu)化的有效方法，已在生產(chǎn)實踐中廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域［2-4］，但對酵素配方的優(yōu)化研究目前少見報道。本研究主要應(yīng)用D-最優(yōu)混料設(shè)計試驗法研究配方中各原料不同組合對酵素酶活及活性成分含量等主要品質(zhì)指標(biāo)的影響，在酵素制備過程中加入明確發(fā)酵菌種，在發(fā)酵條件可控的條件下擬得到綜合酵素的最優(yōu)配方，為酵素食品的制備提供科學(xué)有效的參考方法。

1　材料與方法

1.1料與試劑

新鮮山藥、新鮮山楂、新鮮蘆薈：購自昆明菜市；枸杞、薏苡仁：購自昆明一心堂藥房；葡萄酒酵母、啤酒酵母（按1∶1比例混合使用）：云南中醫(yī)學(xué)院微生物實驗室菌種；L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2器與設(shè)備

DK-98ⅡA型水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；SC-3614型離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SWCJ-2D型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-40BI型滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；UV-1800PC型紫外-可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；GPZ14型分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海醫(yī)療器械五廠。

1.3驗方法

1.3.1素制備工藝流程［5-6］

蘆薈、山楂、山藥、枸杞、薏苡仁→無菌水清洗→瀝干、切丁→按設(shè)計的比例混勻→調(diào)節(jié)糖度（10%）及料水比（5∶1）→按3%比例接種酵母菌種→攪拌均勻→30℃固態(tài)發(fā)酵7 d→發(fā)酵產(chǎn)物按一定比例稀釋打漿→離心取上清為酵素液。

1.3.2素指標(biāo)檢測

蛋白酶活力測定：按國標(biāo)GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中福林法。蛋白酶活力定義：1m L液體酶（或1 g固體酶粉），在40℃條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸為一個酶活力單位（U）。以L-酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，在波長680nm處測定吸光度值，繪制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.009 3x+ 0.011 0，R2=0.999 0）。取稀釋至一定倍數(shù)的供試樣與酪蛋白反應(yīng)，反應(yīng)濾液按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法操作。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力測定：采用鄰苯三酚自氧化法［7-8］。超氧化物歧化酶活定義：在1m L反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定為一個活力單位（U）。

多糖含量測定：采用苯酚-硫酸法［9］。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長490 nm處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y= 20.214 0x-0.011 3，R2=0.998 0）。取一定量酵素液，加入無水乙醇使含醇量達80%，靜置過夜，抽濾后棄上清液，殘渣用體積分數(shù)為80%乙醇洗滌3次，低溫烘干，殘渣用蒸餾水溶解并定容至250m L，得樣品供試液備用。按照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定方法操作并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算酵素樣中的多糖含量。

1.3.3驗設(shè)計

采用試驗設(shè)計軟件DesignExpert中混料設(shè)計D-Optional方法對酵素制備的配方進行優(yōu)化，確定出各原料的最佳比例。試驗選用蘆薈、枸杞、薏苡仁、山楂、山藥為配方原料成分，并設(shè)定各成分在配方中所占百分比（10%～50%）進行試驗。

1.3.4素產(chǎn)品的抗氧化及抑菌活性評價

超氧陰離子自由基清除能力的測定［9］：利用鄰苯三酚自氧化法測定酵素對超氧陰離子自由基清除能力，以不同質(zhì)量濃度的抗壞血酸（ascorbic acid）同法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算酵素樣的抗壞血酸當(dāng)量抗氧化能力（ascorbicacidequivalentantioxidantcapacity，AEAC）。

鐵離子還原能力的測定［10］：酵素還原力的評價參照文獻［10］中鐵離子還原能力測定方法進行，以不同質(zhì)量濃度的抗壞血酸（ascorbic acid）同法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算酵素樣的還原能力。

抑菌活性測定［11］：以大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）為指示菌，采樣打孔法測定酵素樣的抑菌活性，同時設(shè)置試劑空白（無菌水）及陽性對照（苯甲酸鈉），培養(yǎng)結(jié)束后測定培養(yǎng)基中抑菌圈直徑。

2　結(jié)果與分析

2.1型建立與分析

酵素配方設(shè)計及試驗結(jié)果見表1。

表1　酵素的配方設(shè)計及試驗結(jié)果Table1 Design and results of ferment formulation

續(xù)表

利用Design Expert軟件對表1中3個響應(yīng)值的結(jié)果進行二次多項回歸擬合，得到Y(jié)蛋白酶活性、YSOD酶活性、Y多糖含量的回歸模型，各回歸模型方程如下：

對模型方程進行方差分析，得到蛋白酶活力的二次模型極顯著（P＜0.01），SOD酶活力和多糖含量二次模型顯著（P＜0.05）。蛋白酶活性、SOD酶活力和多糖含量3項指標(biāo)的判斷系數(shù)（R2）分別為0.982 6、0.961 5、0.968 3，表明試驗結(jié)果與模型擬合程度良好。

2.2方中各原料變化對酵素蛋白酶、SOD酶活力及多糖含量的影響

本研究的配方中共有5種成分，固定其中兩種組分，可以比較其他3種成分交互作用對指標(biāo)的影響，結(jié)果見圖1～圖3所示。

圖1表示山楂和薏苡仁在固定水平時，蘆薈、枸杞和山藥的交互作用對蛋白酶活性的影響。結(jié)果顯示，響應(yīng)曲面隨著枸杞添加量增加的方向顯著往上傾斜，說明枸杞添加量對蛋白酶活性影響較強，在三者中占主導(dǎo)地位。枸杞中含糖量高，尤其可供酵母直接利用的小分子糖含量高，為酵母快速生長代謝產(chǎn)酶提供了豐富碳源［12］。另外，枸杞中含豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸，粗蛋白含量4.49 g/100 g，氨基酸種類達18種，游離氨基酸占氨基酸總量的一半以上，對誘導(dǎo)蛋白酶產(chǎn)生具有關(guān)鍵作用［13］。

圖1　蘆薈、枸杞、山藥的交互作用對蛋白酶活力影響的響應(yīng)面和等高線Fig．1 Response surface plots and counter line of effectof interaction between aloe，m ed lar and yam on protease ac tivity

圖2　山楂、山藥、薏苡仁的交互作用對SOD酶活力影響的響應(yīng)面和等高線Fig．2 Response surface p lots and counter line of effect of interaction between hawthorn，yam and coix seed on activity of SOD enzyme

圖2表示蘆薈和枸杞在固定水平時，山楂、山藥和薏苡仁交互作用對SOD酶活力的影響。隨著C（山楂）在配方中含量增加，SOD酶活力不斷增強，而D（山藥）、E（薏苡仁）含量增加，SOD酶活力呈下降趨勢。山楂本身含有豐富的SOD酶［14］，增加其在配方中的比例可能會使酵素液中酶活相應(yīng)增高；另外，山楂中豐富的維生素及鈣、鐵、磷等礦物元素為菌體生長提供了良好營養(yǎng)，利于其代謝產(chǎn)酶［15］。山藥和薏苡仁在配方中含量增加對酶活力出現(xiàn)負影響，可能是由于這兩種物質(zhì)淀粉含量高，其需進一步被分解為小分子糖才可被利用，降低了菌體生長代謝速率；此外，薏苡仁和山藥添加量高（淀粉量高），易造成培養(yǎng)基質(zhì)黏粘，在發(fā)酵溫度影響下，被薏苡仁粉包裹住的基質(zhì)表面不斷干化結(jié)塊，影響菌體生長代謝活動，導(dǎo)致酶活降低。因此，配方中應(yīng)適當(dāng)控制山藥和薏苡仁的添加量。

圖3　蘆薈、山楂、山藥的交互作用對多糖含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig．3 Response surface p lots and counter line of effect of interaction between aloe，haw thorn，yam on po lysaccharide content

圖3表示枸杞和薏苡仁在固定水平時，蘆薈、山楂、山藥交互作用對多糖含量的影響。隨著C（山楂）和D（山藥）在配方中添加量的增加，多糖含量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢。由于山楂、山藥中含有菌體生長所需的碳、氮源及各種礦物元素等，在營養(yǎng)豐富的情況下，微生物生長加快，大量繁殖的菌體為滿足自身營養(yǎng)需求會將多糖分解利用，造成基質(zhì)中多糖含量降低。而當(dāng)添加量繼續(xù)增大，基質(zhì)中營養(yǎng)成分的量足以供菌體利用，微生物代謝活動增強，在此過程中可能產(chǎn)生酵母多糖等代謝產(chǎn)物［16］，致使含量上升。但是，由于山藥添加過多易造成基質(zhì)黏粘影響發(fā)酵，因此應(yīng)結(jié)合酶活指標(biāo)適當(dāng)控制山藥用量。

2.3合酵素制備最優(yōu)配方的確定

配方的確定應(yīng)優(yōu)先考慮酶活，使酶活達到最佳水平基礎(chǔ)上，盡可能在發(fā)酵過程中保留或獲得活性物質(zhì)，故本研究對指標(biāo)確定的權(quán)重系數(shù)分別為：蛋白酶活力、SOD酶活力權(quán)重系數(shù)均為0.4，多糖含量權(quán)重系數(shù)為0.2。運用隸屬度綜合評分法［17］和賦予的權(quán)重進行加權(quán)求和得到各指標(biāo)的綜合評分（滿分為1.0分），結(jié)果見表2。

其中隸屬度按下式計算：

式中：L為隸屬度；Ci為指標(biāo)值；Cmin為指標(biāo)最小值；Cmax為指標(biāo)最大值。

以綜合評分作為目標(biāo)參數(shù)，利用Design Expert軟件對綜合評分結(jié)果進行二次多項回歸擬合，建立Y綜合評分的回歸模型，回歸模型方程如下：

表2　各指標(biāo)綜合評分Table 2 Com prehensive score value of each index

通過對模型方程的方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，酵素的綜合評分線性混合模型和二次模型都達到極顯著水平（P＜0.01），得到酵素綜合評分的判斷系數(shù)R2=0.9214，說明Y綜合評分的變異中有92.14%是由變量（A、B、C、D、E）引起的，只有7.86%不能用該模型解釋，模型擬合程度較好，因此可以用此模型對酵素的最優(yōu)配方進行分析和預(yù)測。

表3　綜合評分的二次多項回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic polynom ialmodel for com prehensive score

應(yīng)用軟件的最優(yōu)化功能得到酵素配方的最優(yōu)組合為蘆薈10.00%、枸杞45.29%、山楂24.71%，山藥10.00%、薏苡仁10.00%，在此點預(yù)測所得酵素的綜合評分為0.928 5，按照優(yōu)化后的配方制備酵素，得到的酵素各項指標(biāo)值為蛋白酶293.04U/g，SOD酶57.00U/g，多糖含量11.42mg/g，綜合評分0.905 9，與預(yù)測值基本接近，說明混料設(shè)計法在酵素配方設(shè)計和優(yōu)化中的應(yīng)用有效。

2.4素產(chǎn)品的抗氧化及抑菌活性特性

1.3.4法中所得酵素樣清除超氧陰離子的AEAC值為1mg/g，即該酵素清除超氧陰離子能力，每克酵素樣相當(dāng)于1mg抗壞血酸；對Fe3+還原能力的AEAC值為129.25mg/g，即每克酵素樣相當(dāng)于129.25mg抗壞血酸，說明酵素產(chǎn)品具有一定的抗氧化活性。抑菌活性測定結(jié)果顯示，酵素對大腸桿菌和金黃色葡萄球抑菌圈直徑分別為12.00mm、10.00mm，苯甲酸鈉對兩種指示菌的抑菌圈直徑均為12.00mm，說明酵素產(chǎn)品具有一定的抑菌活性，能力與陽性對照苯甲酸鈉相當(dāng)。

3　結(jié)論

本試驗應(yīng)用混料設(shè)計法研究了酵素制備各成分比例與指標(biāo)的關(guān)系并得到了最優(yōu)配方組合：蘆薈10.00%、枸杞45.29%、山楂24.71%，山藥10.00%、薏苡仁10.00%，以此為基礎(chǔ)得到酵素產(chǎn)品各項指標(biāo)值為蛋白酶活力293.04U/g，SOD酶活力57.00 U/g，多糖含量11.42 mg/g，其綜合評分0.905 9，與預(yù)測值基本接近。將混料設(shè)計法應(yīng)用于酵素食品的配方設(shè)計及優(yōu)化，不僅快速有效，縮短了產(chǎn)品的開發(fā)周期，而且可在最大程度滿足目標(biāo)的條件下得到產(chǎn)品的最優(yōu)配方組合，提高產(chǎn)品品質(zhì)，方法科學(xué)合理，具有重要的應(yīng)用價值。活性試驗結(jié)果表明，酵素具有一定的抗氧化及抑菌活性，同時還含有豐富的蛋白酶、SOD酶及多糖等活性物質(zhì)，因此，酵素是一種具有開發(fā)潛力的健康食品。

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Research on the formulaoptimization ofa ferment

YANG Jingjuan，LINa，ZHAO Shenglan*
（College ofTraditional Chinese Medicine，Yunnan University of TraditionalChinese Medicine，Kunm ing 650500，China）

A kind of ferment food，wasdeveloped w ith aloe，haw thorn，yam，coix seed andmedlar as raw material.Theeffectof themainmaterialson themain quality indicatorsof productwas researched by the optimum m ixture designmethod.The regressionmodel of the raw materials ratio and targetvaluewasestablished.Finally，the optimum formula of fermentwasobtained as follows:aloe 10.00%，medlar45.29%，hawthorn 24.71%，yam 10.00%，and coix seed 10.00%.Under theoptimum formula，thequality parametersof productobtainedwereproteaseactivity 293.04 U/g，superoxide dismutase（SOD）activity 57.00U/g，polysaccharide content11.42mg/g，comprehensive score 0.905 9.The ultra oxygen anion scavenging capacity wasexpressed as1mg ascorbic acid equivalents per gram ferment.The Fe3+reducing antioxidant powerwas expressed as129.25mg ascorbic acid equivalents per gram ferment.The antibacterial circle diameter of ferment on Escherichia coli and Staphylococcusball was12mm and 10mm，respectively.The antim icrobialactivity of fermentwasequivalent to sodium benzoate（positive control）.Thestudy indicated that the fermenthad a certain antioxygenation and bacteriostatic activity.

ferment；m ixturedesign；enzymeactivity；antioxygenation；bacteriostatic activity

TS205．5

0254-5071（2016）01-0095-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．021

2015-10-10

楊婧娟（1986-），女，助教，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。

趙聲蘭（1962-），女，教授，碩士，研究方向為功能食品，藥食資源開發(fā)與利用。