馬梅蘭　曾家豫　馬瑾　袁紅霞　牛童　廖世奇

兩種方法去除肺癌患者血清高豐度蛋白的研究

馬梅蘭曾家豫馬瑾袁紅霞牛童廖世奇

目的：去除肺癌血清中的高豐度蛋白，為尋找肺癌早期腫瘤標志物奠定基礎(chǔ)。方法：血清經(jīng)除脂后按血清：水：乙腈= 1:2:4.5（v/v/v）沉淀分離高豐度蛋白，用SDS-PAGE驗證去除效果。試劑盒去除血清高豐度蛋白，對體檢健康者和非小細胞肺癌患者去除高豐度蛋白前后的血清凝膠電泳圖像進行分析。結(jié)果：經(jīng)本法去除后血清蛋白含量呈顯著降低。與等量上樣原血清電泳結(jié)果相比，相對分子量在50-80kD間的蛋白質(zhì)被明顯去除，而被其掩蓋的相對分子質(zhì)量在10kD以下的低豐度蛋白質(zhì)得以顯現(xiàn)。結(jié)論：乙腈沉淀法提供了一種經(jīng)濟、簡便、重復(fù)性較好的人血清高豐度蛋白去除方法，為進一步尋找肺癌早期腫瘤標志物奠定了基礎(chǔ)并提供了技術(shù)支持。

肺癌；高豐度蛋白；低豐度蛋白

近年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率位于癌癥之首［1］。用于肺癌早期診斷的腫瘤標志物其特異性和敏感性較低。目前，臨床上常采用電化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合檢測多項肺癌血清腫瘤標志物，操作復(fù)雜、成本昂貴。因此，探索未知的腫瘤特異性標志物成為研究的熱點問題之一。血清蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)研究的一個重要分支［2］，因此，血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究在探索未知的腫瘤特異性標志物方面發(fā)揮了重要作用。

血清蛋白質(zhì)組成復(fù)雜，其之間濃度最大能相差十個數(shù)量級，潛在的與疾病相關(guān)的重要標志物在血漿和血清中的含量大多都相當?shù)停瑵舛缺群孔罡叩那宓鞍诐舛鹊?-10個數(shù)量級，其信息幾乎完全被更高含量的高豐度蛋白和中等豐度蛋白信息所掩蓋，利用現(xiàn)有的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測血清中蛋白質(zhì)的濃度變化會因為血清蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜性受到限制。因此，在對這些低豐度標記蛋白質(zhì)進行研究之前必須盡可能地去除血清中高豐度蛋白的干擾。血清中含有大量的高豐度蛋白質(zhì)（high-abundant proteins，HAP），包括白蛋白、免疫球蛋白等，而能夠反映疾病病理、生理等相關(guān)信息的低豐度蛋白（low-aboundant proteins，LAP，分子量＜10kD的蛋白）被HAP所掩蓋，因此去除血清中的HAP是血清蛋白質(zhì)組學(xué)的首要任務(wù)。

本文采用依據(jù)親和層析法原理制備的柱式白蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒，并聯(lián)合超濾離心法去除HAP和有機溶劑乙腈沉淀法去除高豐度蛋白，為后期肺癌血清腫瘤標志物的篩選奠定基礎(chǔ)。

1　實驗材料和方法

1.1實驗材料 血清：2014年于甘肅省腫瘤醫(yī)院采集的經(jīng)病理組織學(xué)確診為肺癌的患者血清。6名患者；男性3名，女性3名；平均年齡（51.7±2.1）歲；入院之前未經(jīng)任何治療，不伴隨其他疾病，本實驗所用血是經(jīng)過倫理委員會批準的，患者知情同意，醫(yī)院職工組織體檢的正常血清為對照，年齡（48.3±3.2）歲，男3名，女3名。

1.2主要試劑乙腈（Acetonitrile，ACN）（Sigma）；丙烯酰胺（Acrylamide）（Solarbio）；N，N-甲叉雙丙烯酰胺（Solarbio）；過硫酸銨（APS）（西安化學(xué)試劑廠）；無水乙醇（AR）（煙臺市雙雙化工有限公司）；甘油（glycerol）（Sigma）；考馬斯亮藍R250（上海生工生物工程有限責任公司）；溴酚藍（Bromophenol Blue）；TEMED （BBI）。

1.3使用儀器TGL-16高速臺式冷凍離心機（長沙平凡儀器有限公司）；BCD-196TX低溫冰箱（海爾集團）；MDF-390 AT超低溫冰箱（日本三洋公司）；移液器（Eppendorf公司）；快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；小型垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；電熱恒溫水溫箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

1.4血清預(yù)處理采用無抗凝劑采血管，對選定好的肺癌患者及健康者進行清晨空腹采血，每人抽取5ml。室溫靜置5min，然后置于低速自動平衡離心機離心（3500r/min，15min），去除血細胞并分離上層血清，然后將分離出來的血清再次置于高速冷凍離心機離心（4℃，12 000×g，15min），進一步去除血細胞，并在冰浴條件下分裝血清，1.5mlEP管，每管1ml，并置于-80℃凍存。

1.5柱式白蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒去除血清

HAP取出保存在-80℃冰箱的血清，置于4℃環(huán)境凍融，然后置于高速冷凍離心機離心（20℃，15 000×g，15min），去除上層脂層，收集血清，后續(xù)實驗備用。

本文采取柱式白蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒去除血清中的HAP。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。每次處理10μl血清，每批實驗重復(fù)5次，處理量為肺癌患者血清50μl，正常血清50μl。然后，將去除HAP的血清收集起來，再一次通過Amicon Ultra-0.53kD的超濾離心管，進行二次大蛋白的截留。吸取下層液體并置于真空干燥儀，濃縮干燥。處理完畢的樣品密封保存于4℃。

1.6乙腈沉淀法去除HAP參照朱慧等［3］去除HAP的實驗，利用乙腈沉淀法去除血清中的HAP。

取出保存在-80℃冰箱的血清，置于4℃環(huán)境凍融，然后置于高速冷凍離心機離心（20℃，15 000×g，15min），去除上層脂層，收集血清，后續(xù)實驗備用。

吸取100μl處理好的血清，置于1.5ml的EP管中，按照1∶2的比例，加入200μl超純水，快速混勻30s，然后按照血清樣品∶超純水∶乙腈=1∶2∶4.5的比例，加入450μl乙腈，置于超聲清洗器，水浴超聲20min，然后置于高速冷凍離心機離心（20℃，12 000×g，10min），吸取上清液，置于真空干燥儀，濃縮干燥。處理完畢的樣品密封保存于4℃。

1.7SDS-PAGE電泳分析血清去除HAP效果取經(jīng)兩種方法處理過的血清樣品，加入適量超純水復(fù)溶，然后進行SDS-PAGE電泳。

（1）組裝電泳裝置，并檢查是否漏液。

（2）配制15%的分離膠（15ml）：蒸餾水3.4ml、30%丙烯酰胺溶液7.5ml、1.5mol/LpH為8.8的Tris溶液3.8ml、10%SDS0.15ml、0.006mlTEMED、10%過硫酸銨0.15ml，按照此順序配膠，充分混勻即可。

（3）灌膠、液封：將配置好的分離膠沿長短板縫隙迅速灌入，灌膠高度約短板2/3處，不能產(chǎn)生氣泡，然后加水液封，室溫放置，待膠凝固后，棄去液封的蒸餾水，并用濾紙吸干殘留液體［4］。

（4）配制5%濃縮膠（5ml）：蒸餾水3.4ml、30%丙烯酰胺溶液7.5ml、1.0mol/LpH為6.8的Tris溶液0.63ml、10%SDS0.05ml、0.005mlTEMED、10%過 硫 酸 銨0.05ml，按照此順序配膠，充分混勻即可。

（5）灌膠并插入樣品梳：將配置好的濃縮膠溶液迅速灌注在已凝固的分離膠上，并插入樣品梳，不能產(chǎn)生氣泡，室溫放置，待濃縮膠凝固后，拔掉樣品梳，安裝電泳儀。

（6）加樣、電泳：將處理好的樣品與loading buffer按照4:1的比例，混合并置于95℃沸水浴5min后上樣，每個加樣孔加樣10μl，未經(jīng)處理的血清樣品為對照組；然后電泳，電泳時，未進入分離膠時，電壓為8V/ cm，進入分離膠后，電壓調(diào)至15V/cm，直至指示劑到達分離膠底部，停止電泳。

（7）考馬斯亮藍染色：剝離凝膠，且標注第一個點樣孔的位置，然后將其置于考馬斯亮藍染液染色，置于37℃恒溫搖床，4h。

（8）脫色：棄去染色液，將凝膠置于脫色液脫色，每隔1h換一次脫色液，直至凝膠背景干凈，條帶清晰。

2　結(jié)果與分析

第1泳道為采用試劑盒去除肺癌患者血清HAP 的SDS-PAGE結(jié)果分析，第2泳道為采用試劑盒去除正常血清HAP的SDS-PAGE結(jié)果分析，第3泳道為采用乙腈沉淀法去除肺癌患者血清HAP的SDS-PAGE結(jié)果分析，第4-5泳道為采用乙腈沉淀法去除正常血清HAP的SDS-PAGE結(jié)果分析。M為蛋白Marker，第6-7泳道為未去除HAP的肺癌患者血清的SDS-PAGE結(jié)果分析，第8-9泳道為未去除HAP正常血清的SDSPAGE結(jié)果分析。從圖示可以看出，采用試劑盒去除血清中的HAP和乙腈沉淀法去除效果幾乎一樣，且HAP去除后，原先被掩蓋的LAP被顯現(xiàn)，我們可以看到6.5kD以下LAP的條帶。相比于原血清，80kD以上的HAP被明顯去除，條帶變窄。見圖1。

圖1　SDS-PAGE分析HAP去除效率

3　討論

理想的蛋白質(zhì)去除技術(shù)應(yīng)該是具有選擇性的，即能100%地去除會對低豐度蛋白質(zhì)檢測造成干擾的高豐度和中等豐度蛋白，同時對所需要研究的低豐度蛋白的含量及組成不產(chǎn)生影響或者能將影響降到最低；其次，這些技術(shù)每一次使用的投入，即所需要花費的成本（資金和時間）也是需要考慮的一個實際因素；另外，還需要考慮這些技術(shù)一次能夠處理的樣品量，多批樣品處理時結(jié)果的重現(xiàn)性，以及與下游的蛋白質(zhì)分析技術(shù)的兼容性等。

目前，常用于去除HAP的方法有有機溶劑沉淀法、親和層析法、等電聚焦、超濾離心法等。本文采用依據(jù)親和層析法原理制備的去除HAP的試劑盒，并聯(lián)合超濾離心法去除HAP與有機溶劑乙腈沉淀法比較，發(fā)現(xiàn)：兩種方法去除高豐度后與未去除高豐度蛋白的比較原先被掩蓋的LAP被顯現(xiàn)，我們可以看到6.5kD以下LAP的條帶，兩種方法去除HAP的效果幾乎是一樣的，但是對于試劑盒法，成本較高、樣品處理量低、操作過程繁瑣、耗時較長，但是乙腈沉淀法操作簡便、成本低廉、穩(wěn)定性強、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣，避免了物種和免疫原性的限制［5］。因此，乙腈沉淀法可作為去除HAP的首選方法。

近年來，腫瘤血清蛋白質(zhì)組學(xué)是生命科學(xué)研究的熱點領(lǐng)域，研究人員致力于從復(fù)雜的血清中發(fā)現(xiàn)并建立特異的疾病診斷模型。通過對腫瘤組與正常組間的血清蛋白質(zhì)比較分析，找到腫瘤標志物，使它們有可能成為疾病的診斷，乃至早期診斷的分子標志物，以及新藥物設(shè)計的分子靶點［6］。

機體內(nèi)腫瘤細胞分泌的一些蛋白會進入血液，血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是蛋白質(zhì)研究的一個重要分支。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的HAP，清蛋白、免疫球蛋白、纖維蛋白原、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白和脂蛋白等［7］，其總含量達血漿總蛋白質(zhì)含量的97%-99%［8］。低豐度蛋白是指分子量＜10kD的蛋白質(zhì)［9］，是能夠反映疾病病理、生理等信息的重要蛋白質(zhì)，常常會被高豐度蛋白所掩蓋，因此，去除血清中的高豐度蛋白是血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究的首要任務(wù)。有效去除血清中的高豐度蛋白更為關(guān)鍵，有報道［10］乙腈法去除高豐度蛋白后經(jīng)雙向電泳有部分蛋白消失。這是本研究的一個不足，提示血清蛋白組學(xué)研究策略中，去除高豐度蛋白的同時，要注意考查可能損失的許多有價值的生物標志物信息。肺癌血清去除高豐度蛋白后顯現(xiàn)的這些低豐度蛋白可以作為靶標進行肺癌血清未知腫瘤標志物的篩選，有望找到新的肺癌腫瘤標志物，篩選出其適配體，這是本課題今后努力的方向。

［1］孫立慧.肺癌血清腫瘤標志物的研究［J］.黑龍江醫(yī)學(xué)，2012，36（5）: 352-355.

［2］李克，朱慧.離心超濾法去除血清大相對分子質(zhì)量高豐度蛋白質(zhì)的實驗研究［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（20）:2359-2361.

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［4］朱慧.肺癌血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究中高豐度蛋白質(zhì)的去除及經(jīng)HPLC分離后的圖譜分析［D］.南京:南京師范大學(xué)，2011.

［5］曹璐穎，李克，鄭文杰.甲醇沉淀法去除人血清高豐度蛋白質(zhì)的實驗研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2012，25（11）:1151-1154.

［6］鄧開鳳.利用乙腈與質(zhì)譜技術(shù)篩選鼻咽癌相關(guān)血清標志蛋白質(zhì)的研究［D］.南寧：廣西醫(yī)科大學(xué)，2011.

［7］Thadikkaran L，Siegenthaler MA，Crettaz D，et al Recent advances in blood-related proteomics［J］.Proteomics 2005，5（12）:3019-3034.

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Research on using two methods to remove the high-abundant proteins in serum of lung cancer

Ma Meilan1，Zeng Jiayu1，MaJin2，Yuan Hongxia2，Niu Tong1，Liao Shiqi2.

1.College of Life Science and Engineering，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China；2. Institute of Gansu Medical Science Research，Lanzhou 730050，China Corresponding author：Liao Shiqi，E-mail：Ishiqi5188@qq.com

Objective：We removed the high-abundant proteins in serum of lung cancer to lay the foundation for finding early markers of lung cancer.Methods：The albumin was precipitated by mixing delipidated serum，water，acetonitrile at ratio of 1:2:4.5（v/v/v）.The removal effects were analyzed by one-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacryl amide gel electrophoresis（SDS-PAGE）.Results：The results showed that the average concentration of albumin in the serum was decreased.Compared with the gel images of the original serum with same volume，the band of protein with molecular weight between 50-80kD was removed.The band narrowed significantly and low-abundant proteins could be seen.Conclusion：The acetonitrile-depletion strategy may offer an economical，simple and reproducible method to remove album from human serum，which provided a technical support for further study of serum proteomics.

lung cancer；high-abundant proteins；low-abundant proteins

A

1004-2725（2016）01-0004-03

730070甘肅 蘭州，西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（馬梅蘭、曾家豫、牛童）；730050甘肅 蘭州，甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究中心（馬瑾、袁紅霞、廖世奇）

廖世奇，E-mail：lshiqi5188@qq.com