羅苑苑

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東　510405）

實(shí)驗(yàn)研究

白藜蘆醇對膿毒癥高遷移率族蛋白B-1的影響※

羅苑苑

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東510405）

目的 研究白藜蘆醇對膿毒癥大鼠高遷移率族蛋白B-1的影響。方法 CLP術(shù)制作膿毒癥大鼠模型，制備膿毒癥大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，分為對照組和白藜蘆醇組，在不同時間點(diǎn)采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）方法測定HMGB1濃度和實(shí)時熒光定量PCR測定HMGB1mRNA表達(dá)。結(jié)果 對照組的細(xì)胞培養(yǎng)上清中在術(shù)后12 h、18 h、24 h及48 h時HMGB1水平均較同時相實(shí)驗(yàn)組顯著升高（P均＜0.05），且實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果提示，對照組6 h的HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄水平開始增加，24 h達(dá)最高，并持續(xù)至48 h，顯著高于0 h水平（P＜0.01）；而實(shí)驗(yàn)組HMGB1mRNA在前24 h轉(zhuǎn)錄開始增加，顯著高于0 h水平（P＜0.01），但是24～48 h逐漸下降至0 h水平（P＞0.05）。結(jié)論 白藜蘆醇可抑制膿毒癥HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄水平，從而減少HMGB1水平，提示白藜蘆醇可能對CLP誘導(dǎo)的膿毒癥有一定保護(hù)效應(yīng)。

白藜蘆醇；膿毒癥；高遷移率族蛋白B-1；動物實(shí)驗(yàn)

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對膿毒癥的治療尚未取得突破性進(jìn)展，如何尋找出新的更有效且副作用小的藥物是醫(yī)學(xué)界所面對的一個重要研究課題。因此從天然藥物中尋找高效、低毒的抗膿毒癥制劑是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。白藜蘆醇（Resveratro1，Res）是從多年生草本植物蓼科蓼屬虎杖的根莖中提取的單體，對LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的COX-2和NO等炎癥因子有抑制效應(yīng)［1］。本研究首次以膿毒癥的一種重要的晚期炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白B-1 （High mobility group box-1 protein，HMGB1）為切入點(diǎn)，探索具有“天然植物抗毒素”之稱的白藜蘆醇對膿毒癥大鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的HMGB1胞外釋放是否具有明顯抑制作用，為白藜蘆醇治療膿毒癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 8周雄性野生型 （wide type，WT）大鼠，每組30只，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，并統(tǒng)一飲食喂養(yǎng)，平均體重 （22.3±2.5）g。

2　方法

2.1CLP術(shù)制作膿毒癥模型 用5.0%異氟烷麻醉大鼠后，將大鼠平臥位固定于動物手術(shù)臺上，剔去腹部毛發(fā)，常規(guī)消毒鋪巾。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立大鼠膿毒癥模型，即沿腹正中線做一小切口，結(jié)扎盲腸根部 （避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管），用18號針穿刺盲腸4次，之后將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。然后將膿毒癥大鼠分為對照組和白藜蘆醇組（即實(shí)驗(yàn)組）。術(shù)后，單劑量的復(fù)蘇液（乳酸林格氏溶液，50毫升/公斤體重）通過皮下注射給藥。

2.2大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備 大鼠腹腔內(nèi)注入無菌巰基乙醇酸鈉肉湯1 mL，造模成功后引頸處死，浸入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇中3至5 s，收集腹腔內(nèi)液，1000 r/min離心5 min，去上清，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)，以每平方厘米含3×105個細(xì)胞接種。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前2 h用無血清OPTI-MEMI培養(yǎng)液置換。

2.3培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將密度為3×105/m1的細(xì)胞100 μL接種于96孔板，在37℃，含有5%二氧化碳增濕的培養(yǎng)箱中使細(xì)胞良好貼壁，分為終濃度 1 μg/ml LPS處理組（對照組）和10 μg/ml白藜蘆醇預(yù)處理30 min+終濃度1 μg/ml LPS處理組（實(shí)驗(yàn)組），細(xì)胞培養(yǎng)48 h，觀察兩組不同時間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，并收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測細(xì)胞中HMGB1mRNA表達(dá)的表達(dá)變化，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1濃度的表達(dá)變化。

2.4HMGB1濃度測定 采用酶聯(lián)免疫分析 （ELISA）方法。大鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的HMGB1測定。ELISA檢測按產(chǎn)品使用說明書操作。試劑盒微量滴定板事先已經(jīng)用純化的HMGBI特異抗體包被，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入HMGBI抗原、生物素化的抗大鼠HMGBI多克隆抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的HMGBI呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度 （0D值），計(jì)算樣品濃度。

2.5HMGB1mRNA表達(dá)檢測 應(yīng)用mRNA提取試劑盒，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中直接裂解細(xì)胞mRNA。HMGB1引物（擴(kuò)增片段為680bp）：5c-ATGGGCAAAGGAGATCCTA-3c（上游），5c-ATTCATCATCATCATCTTCT-3c（下游）。以三磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）作為內(nèi)參對照，引物（擴(kuò)增片段為309 bp）5c-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3c（上游），5c-AGATCCACAACGGATACATT-3c（下游）。HMGB1mRNA表達(dá)水平以HMGB1與GADPH基因擴(kuò)增條帶吸光度 （A）比值表示。

2.6統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01有顯著性差異。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果

2.1HMGB1在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的含量 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對照組于術(shù)后6 h細(xì)胞培養(yǎng)上清液內(nèi)HMGB1水平較低，與0h相比無顯著性差異，12～24 h上清液中HMGB1逐漸上升，24～48 h繼續(xù)升高并維持在更高的水平，與0 h相比有顯著性差異 （P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后 6 h上清中HMGB1與0 h相比無顯著性差異，24～48 h內(nèi)上清中HMGB1逐漸上升，與0 h相比有顯著性差異 （P＜0.01）；而在相同時間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組上清中HMGB1含量顯著低于對照組 （P＜0.01）（詳見表1）。

表1　2組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的HMGB1測定

表1　2組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的HMGB1測定

注:*同組與0 h相比P＜0.01，#對照組與實(shí)驗(yàn)組相同時間點(diǎn)對比P＜0.01

組別　0 h　6 h　12 h對照組　4.41±0.81　18.41±0.80#　28.55±1.11*#實(shí)驗(yàn)組　4.72±0.73　7.12±0.83　9.54±1.25*18 h 44.17±4.12*#17.15±2.11*24 h　48 h 68.87±4.85*#85.56±5.52*#22.21±1.19*　31.15±2.35*

2.2HMGB1mRNA表達(dá)檢測 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果提示，對照組6 h的HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄水平開始增加，24 h達(dá)最高，并持續(xù)至48 h，顯著高于0 h水平 （P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組6 h HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄開始增加，12～18 h繼續(xù)上升，顯著高于0 h水平 （P＜0.01），24～48 h逐漸下降至0 h水平 （P＞0.05）；在相同的時間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組8～48 h后HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于對照組 （P＜0.01）（詳見表2）。

表2　2組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞HMGB1mRNA表達(dá)

表2　2組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞HMGB1mRNA表達(dá)

注:*同組與0 h相比P＜0.01，#對照組與實(shí)驗(yàn)組相同時間點(diǎn)對比P＜0.01

組別　0 h　6 h　12 h對照組　1　5.11±0.72#　7.15±0.84*#實(shí)驗(yàn)組　1　2.51±0.55　4.14±0.56*18 h 12.51±1.25*#3.31±0.31*24 h　48 h 18.51±2.55*#10.85±1.22*#3.55±0.41*　1.15±0.25*

3　討論

膿毒癥發(fā)生發(fā)展的根本原因在于機(jī)體過度釋放TNF-α、IL-6、HMGB1等炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控和免疫功能失調(diào)。早期炎癥因子 TNF-α、IL-6和晚期釋放的HMGB1相互促進(jìn)，形成炎癥細(xì)胞因子風(fēng)暴，最終引發(fā)致死性的膿毒性休克和MODS發(fā)生［2］。因此，治療膿毒癥的關(guān)鍵是能否有效抑制炎癥細(xì)胞因子釋放、相互促進(jìn)的網(wǎng)絡(luò)，阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng)擴(kuò)大。LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)其釋放TNF-α、IL-6等早期炎癥因子和 HMGB1，釋放到胞外的HMGBl，引起 TNF-α、IL-6等多種炎性細(xì)胞因子的再次釋放以擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。HMGBl一旦進(jìn)入組織間隙，即可表現(xiàn)出其炎癥因子的作用:通過自身毒性作用、刺激其他促炎因子釋放、導(dǎo)致凝血、纖溶系統(tǒng)功能紊亂、破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性、擾亂免疫系統(tǒng)功能、破壞腸黏膜屏障的完整性等多種途徑參與或加重膿毒癥的致病過程［3-4］。故高遷移率族蛋白在膿毒癥的致死過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性炎性因子作用。研究表明，即使在致病因素作用后24 h使用抗HMGBl抗體、HMGBl的A盒或丙酮酸等針對HMGBl進(jìn)行處理，均可顯著提高膿毒癥動物的生存率［5］。正是由于HMGBl延遲合成與分泌的特點(diǎn)及其廣泛的致病作用，HMGBl相較于早期炎癥因子，HMGB1出現(xiàn)晚、持續(xù)時間更長，能給膿毒癥的治療提供更廣的時間窗，被認(rèn)為是膿毒癥致病的關(guān)鍵性因子，并可能為膿毒癥的治療帶來新的突破［7］。

白藜蘆醇 （Resveratrol，Res）屬于一種酚類植物抗毒素，是天然的抗氧化物和自由基清除劑，主要存在于各種紅葡萄果實(shí)和紅葡萄酒中。自然界中的葡萄皮、花生及中藥虎杖等72種植物均含有不同量的天然白藜蘆醇，在惡劣環(huán)境或是在這些植物受到霉菌感染時會產(chǎn)生白藜蘆醇，因而它亦是一種植物抗毒素。白藜蘆醇最初作為一種葡萄屬植物抗毒素被發(fā)現(xiàn)，目前因具有可靠而廣泛的抗炎作用而日益受到人們的重視［8］。雖然大量細(xì)胞和動物研究報(bào)道白藜蘆醇的抗炎作用，但是還未見白藜蘆醇針對膿毒癥治療方面的報(bào)道。本研究旨在探討白藜蘆醇干預(yù)對CLP誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠高遷移率族蛋白B1表達(dá)的影響，以期為中藥防治膿毒癥提供依據(jù)。本研究顯示，對照組的細(xì)胞培養(yǎng)上清中在術(shù)后12 h、18 h、24 h及48 h時HMGB1水平均較同時相實(shí)驗(yàn)組顯著升高（P均＜0.05），且實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果提示，對照組6 h的HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄水平開始增加，24 h達(dá)最高，并持續(xù)至48 h，顯著高于0 h水平 （P＜0.01）；而實(shí)驗(yàn)組HMGB1mRNA在前24 h轉(zhuǎn)錄開始增加，顯著高于0 h水平 （P＜0.01），但是24～48 h逐漸下降至0 h水平 （P＞0.05），說明白藜蘆醇可抑制膿毒癥HMGB1mRNA轉(zhuǎn)錄水平，從而減少HMGB1水平，表明白藜蘆醇可能對CLP誘導(dǎo)的膿毒癥有一定保護(hù)效應(yīng)，但白藜蘆醇對HMGB1下游炎癥因子釋放有無抑制作用尚有待進(jìn)一步研究。

［1］Kim YA，Kim GY，Park KYJ.Resveratrol inhibits nitric oxide and prostaglandin E2 production by lipopolysaccharide-activated C6microglia［J］. Med Food，2007，10（2）:218-224.

［2］Sun R，ZhangY，LvQ，et al:Toll-like receptor 3（TLR3）induces apoptosis via death receptors and mitochondria by up-regulating the transactivating p63 isoformalpha（tap63alpha）.J Biol Chem2011；286:15918-15928

［3］Coulthard LR，White DE，Jones DL，et al.p38（MAPK）:stress responses from molecular mechanisms to therapeutics［J］.Trends Mol Med，2009，15（8）:369-379.

［4］Baker RG，Hayden MS，Ghosh S.NF-κB，inflammation，and metabolic disease［J］.Cell Metab，2011，13（1）:11-22.

［5］Kim ID，Lim CM，Kim JB，et al.Neuroprotection by biodegradable PAMAM ester（e-PAM-R）-mediated HMGB1 siRNA deliveryin primarycortical cultures and in the postischemic brain［J］.J Control Release.2010，142（3）:422-430.

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［7］李金，白楊，張亞歷.白藜蘆醇對脂多糖激活RAW264.7細(xì)胞MAPK炎癥通路的影［J］.山東醫(yī)藥，2010，50（23）:49-50.

Effect of Resveratrol on Septic of High Mobility Group Protein B-1

LUO Yuanyuan
（ICU of the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

Objective To study the effect of resveratrol on septic of high mobility group protein B-1.Methods Sepsis rat models were made by CLP.Macrophages，which were prepared from rat peritoneal，were divided into control group and resveratrol group.At different time points，the concentration of HMGB1 was determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and HMGB1mRNA expression was determined by real-time fluorescence quantitative PCR.Results At 12 h，18 h，24h and 48h after surgery，the levels of HMGB1 in the control group were significantly higher than those in the experimental group（P＜0.05），and real-time PCR results suggested that the HMGB1mRNA transcription level of the control group increased at 6h，reached the highest at 24h，and lasted to 48h，which was significantly higher than that at 0h（P＜0.01）.In the experimental group，HMGB1mRNA transcription increased at the first 24 hours，which was significantly higher than the level as 0 hours（P＜0.01），but gradually decreased to the level of 0h in 24-48h（P＞0.05）.Conclusion Resveratrol can inhibit septic HMGB1mRNA transcriptional level，and reduce the level of HMGB1，which suggested that resveratrol may have some protective effect on CLP induced sepsis.

resveratrol；sepsis；high mobility group protein B-1；animal experiment

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.13.059

1672-2779（2016）-13-0128-03

廣東省中醫(yī)藥局科研課題（No:20141118）

（本文編輯:李海燕 本文校對:溫敏勇2015-12-15）