周 潔， 楊燕飛，2， 胡建華， 陶凌云， 高 誠（2.上海實驗動物研究中心， 上海20203； 2.揚州大學獸醫(yī)學院， 揚州225009）

猴D型逆轉錄病毒p27基因的克隆表達及診斷價值評價

周 潔1， 楊燕飛1，2， 胡建華1， 陶凌云1， 高 誠1
（2.上海實驗動物研究中心， 上海201203； 2.揚州大學獸醫(yī)學院， 揚州225009）

目的 克隆表達猴D型逆轉錄病毒（SRV） p27基因，評價其診斷價值。方法 PCR擴增p27基因片段，定向克隆至原核表達載體pET-28b（+），重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta （DE3）中誘導表達，利用SDS-PAGE和Western blot對表達產物進行鑒定，目的蛋白經鎳柱親和層析純化后用ELISA方法評價其診斷價值。結果 重組質粒轉化宿主菌后在37 ℃，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）濃度為0.5 mmol/L的條件下誘導4 h，可溶性p27蛋白表達量最大，且具有免疫學活性。純化后測定融合蛋白濃度為2.043 g/L，純度93.3%，以融合蛋白為診斷抗原包被ELISA板檢測3份標準陽性血清和22份陰性血清，檢出率為100% 。結論 p27 基因成功表達并具有良好的反應原性，可作為猴D型逆轉錄病毒血清學檢測的候選抗原。

猴D型逆轉錄病毒； p27基因； 原核表達； 血清學檢測

猴D型逆轉錄病毒（simian type-D retrovirus，SRV）， 屬逆轉錄病毒科腫瘤病毒亞科的D型病毒， 是猴獲得性免疫缺陷綜合征（simian acquired immunodeficiency syndrome， SAIDS）即猴艾滋病的主要病原體之一［1］。SRV的自然宿主是獼猴， 主要通過猴間互相撕咬使唾液中的病毒進入血液而傳播， 也可通過性傳播和胎盤傳播。感染后的臨床表現和病理特征與人艾滋病類似， 如頑固性腹瀉、貧血、體質量減輕、脾腫大、淋巴結病、慢性感染并對治療不產生療效反應、壞死性口炎、表皮和腹膜后纖維瘤等。SRV在其天然宿主亞洲猴群中流行率較高， 有的猴群可達100%，1970年代末和1980年代初， 美國幾個靈長類研究中心爆發(fā)SRV導致了大批實驗用猴死亡， 近年來還有SRV感染人的報道［2-6］。

由于猴在形態(tài)學、生殖生理特性和生化代謝等方面與人類非常類似，其遺傳物質和人類有很高的同源性，因此猴被作為人類最理想的替身和重要的研究、實驗對象，廣泛應用于醫(yī)學、藥學、毒理學等領域的科學研究，特別是在新藥臨床前安全性評價中猴是不可替代的實驗動物。其質量不僅直接影響科學研究的進程和結果，而且也直接影響從事實驗動物科研、生產等相關人員的生命健康和安全以及社會公共衛(wèi)生體系的安全［7］。因此需要定期對猴群進行SRV感染的監(jiān)測以剔除傳染源，必要時使用疫苗。我國國標GB/T 14926.61-2001［8］規(guī)定SRV是SPF級猴的必檢項目，推薦方法為酶聯免疫吸附試驗（ELISA）或免疫熒光試驗（IFA）。目前除了美國BioReliance和VRL等少數幾個實驗室擁有實驗猴SRV的ELlSA試劑盒之外，市場上還沒有同類產品出售。國外試劑盒價格昂貴且貨期不穩(wěn)定，因此建立一種快速、準確的SRV檢測方法有助于國內開展實驗猴SRV的檢測工作。本研究對SRV的高度保守序列p27基因進行了克隆表達，并對其診斷價值進行了評價，為進一步開展SRV的快讀診斷方法奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌株及載體 SRV-2株細胞培養(yǎng)物、pET-28b（+）載體質粒均由本實驗室保存； pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司生物公司； 感受肽細胞E.coli Rosetta （DE3）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 主要試劑 QIAamp Viral RNA Mini Kit購自Qiagen公司（德國）； PrimeSTAR Max DNA Polymerase聚合酶、AMV逆轉錄酶、dNTPS、T4連接酶、限制性核酸內切酶均購自寶生物工程（大連）有限公司生物公司； 辣根過氧化物酶（HRP）酶標山羊抗猴IgG購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司； 瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司； Ni-IDA-SefinoseTMResin試劑盒購自生工生物工程上海（股份）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據GenBank發(fā)表的SRV-2株基因序列（16605.1）， 針對p27基因（nt1385～nt2062）設計一對特異性引物， 用于擴增p27基因。

上游引物： 5'-AGCCATATGATTTTCCCAGTAACG-3'，引入NdeⅠ酶切位點；

下游引物：5'-TGATCTCGAGGTCTGTCCACTAAAG-3'， 引入XhoⅠ酶切位點；

SRV細胞培養(yǎng)物病毒總RNA的提取按照QIAamp Viral RNA Mini 試劑盒說明書操作； 反轉錄過程參照AMV逆轉錄酶操作說明書； 取上述3 μL cDNA產物作為PCR模板，PCR反應條件為： 通過RT-PCR方法擴增p27 基因， 擴增條件為： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 22 s，58 ℃ 20 s， 72 ℃ 45 s， 30個循環(huán)； 72 ℃5 min?；厥誔CR產物與pMD18-T 載體連接，轉化感受態(tài)E.coli DH5α細胞，提取質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將鑒定為陽性的重組質粒命名為pMD-P27。

1.2.2 重組質粒的構建 pMD-P27經Xho I/ Nde I雙酶切后與進行同樣處理的pET-28b（+）載體相連，接連接產物轉化感受態(tài)E.coli Rosetta（DE3）細胞，鑒定后獲得的陽性質粒命名為pET-P27。

1.2.3 重組蛋白的誘導表達 pET- P27轉化感受態(tài)E.coli Rosetta （DE3），挑取單菌落于含30 mg/L卡那霉素和34 mg/L氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min搖床培養(yǎng)至A600值0.6左右時添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG， 220 r/min，37 ℃誘導4 h，未加IPTG誘導劑的陽性菌液作為陰性對照。離心收集菌體細胞， 用緩沖液（20 mmol/L PB， 300 mmol/L NaCl，質量分數0.1%TritonX-100，pH8.0）重懸，冰浴中超聲破碎菌體，分別離心收集上清和沉淀，沉淀用500 μL包涵體溶解液（8 m/L 尿素， 50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）溶解，分別用于SDS-PAGE分析表達產物。

1.2.4 重組蛋白的純化 大量誘導表達后離心收集菌體超聲處理后，上清用Ni-IDA-SefinoseTMResin試劑盒純化， 具體步驟如下： 取5 mLNi-IDA， 用10倍柱床體積的結合緩沖液（binding buffer）清洗平衡柱子，流速5 mL/min； 上柱，流速為2 mL/min，收集穿透液； 10倍柱床體積的結合緩沖液清洗柱子，流速5 mL/min； 漂洗緩沖液（wash buffer）洗去雜質，流速2 mL/min，收集洗脫液； 洗脫緩沖液（elution buffer）洗脫，流速2 mL/min，收集洗脫液。將收集到的各組分進行SDS-PAGE檢測后，將純度最好的組分透析至1×PBS，pH8.0中，0.45 μm濾膜過濾濃縮分裝，測定蛋白的濃度（具體操作按照生工的SK3071非干擾型蛋白質濃度測定試劑盒進行）及純度，-80℃分裝保存。

1.2.5 重組蛋白的Western blot鑒定 純化后的蛋白經SDS-PAGE電泳轉移至PVDF膜上， 加封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST）溫室搖床封閉1 h； 先后以50倍稀釋的SRV標準陽性血清4 ℃孵育過夜，2 000倍稀釋的羊抗猴IgG-HRP溫室搖床孵育1 h，TMB顯色。

1.2.6 重組蛋白的診斷價值評價 以純化的重組蛋白作為診斷抗原包被ELISA板（濃度為3.063 mg/孔）4℃包被過夜； 封閉緩沖液（blocking buffer）于37 ℃封閉2.5 h； 標準陰、陽性血清1∶100稀釋， 作用60 min； 酶標二抗1：10 000稀釋，底物顯色15 min，2 mol/L H2SO4終止反應； 酶標儀測量A630值， 以陰性血清的平均A630值乘以2.1作為陽性判定標準。

2 結果

2.1 目的基因克隆及表達載體的構建

經RT-PCR擴增獲得大小約為750 bp 的特異性片斷（圖1），與預期大小相符，連接pMD18-T 載體測序，結果證實擴增片斷723 bp， 包含有SRV-2 p27完整ORF共678 bp，編碼226 aa。將pMD-P27雙酶切后與同樣處理的pET-28b（+）載體連接，獲得陽性質粒pET- P27。設計一對特異性引物，用于擴增p27基因。

上游引物： 5'-AGCCATATGATTTTCCCAGTAACG-3'，引入NdeⅠ酶切位點；

下游引物： 5'-TGATCTCGAGGTCTGTCCACTAAAG-3'， 引入XhoⅠ酶切位點；

SRV細胞培養(yǎng)物病毒總RNA的提取按照QIAamp Viral RNA Mini 試劑盒說明書操作； 反轉錄過程參照AMV逆轉錄酶操作說明書； 取上述3 μL cDNA產物作為PCR模板，PCR反應條件為： 通過RT-PCR方法擴增p27 基因， 擴增條件為： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 22 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min?；厥誔CR產物與pMD18-T 載體連接，轉化感受態(tài)E.coli DH5α細胞，提取質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將鑒定為陽性的重組質粒命名為pMD-P27。

1.2.2 重組質粒的構建 pMD-P27經Xho I/ Nde I雙酶切后與進行同樣處理的pET-28b（+）載體相連，接連接產物轉化感受態(tài)E.coli Rosetta （DE3）細胞，鑒定后獲得的陽性質粒命名為pET-P27。

1.2.3 重組蛋白的誘導表達 pET- P27轉化感受態(tài)E.coli Rosetta （DE3），挑取單菌落于含30 mg/L卡那霉素和34 mg/L氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min搖床培養(yǎng)至A600值0.6左右時添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min， 37 ℃誘導4 h，未加IPTG誘導劑的陽性菌液作為陰性對照。離心收集菌體細胞， 用緩沖液（20 mmol/L PB， 300 mmol/L NaCl，質量分數0.1%TritonX-100，pH8.0）重懸，冰浴中超聲破碎菌體， 分別離心收集上清和沉淀， 沉淀用500 μL包涵體溶解液（8 m/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）溶解，分別用于SDS-PAGE分析表達產物。

1.2.4 重組蛋白的純化 大量誘導表達后離心收集菌體超聲處理后， 上清用Ni-IDA-SefinoseTMResin 試劑盒純化， 具體步驟如下： 取5 mL Ni-IDA， 用10倍柱床體積的結合緩沖液清洗平衡柱子， 流速5 mL/min；上柱，流速為2 mL/min，收集穿透液； 10倍柱床體積的結合緩沖液清洗柱子，流速5 mL/min； 漂洗緩沖液洗去雜質，流速2 mL/min， 收集洗脫液； 洗脫緩沖液洗脫，流速2 mL/min，收集洗脫液。將收集到的各組分進行SDS-PAGE檢測后，將純度最好的組分透析至1×PBS，pH8.0中，0.45 μm濾膜過濾濃縮分裝，測定蛋白的濃度（具體操作按照生工的SK3071非干擾型蛋白質濃度測定試劑盒進行）及純度，-80℃分裝保存。

1.2.5 重組蛋白的Western blot鑒定 純化后的蛋白經SDS-PAGE電泳轉移至PVDF膜上，加封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST）溫室搖床封閉1 h； 先后以50倍稀釋的SRV標準陽性血清4 ℃孵育過夜， 2 000倍稀釋的羊抗猴IgG-HRP溫室搖床孵育1 h， TMB顯色。

1.2.6 重組蛋白的診斷價值評價 以純化的重組蛋白作為診斷抗原包被ELISA板（濃度為3.063 mg/孔）4℃包被過夜； 封閉緩沖液（blocking buffer）于37 ℃封閉2.5 h； 標準陰、陽性血清1∶100稀釋， 作用60 min； 酶標二抗1∶10 000稀釋，底物顯色15 min，2 mol/L H2SO4終止反應； 酶標儀測量A630值，以陰性血清的平均A630值乘以2.1作為陽性判定標準。

2 結果

2.1 目的基因克隆及表達載體的構建

經RT-PCR擴增獲得大小約為750 bp 的特異性片斷（圖1），與預期大小相符，連接pMD18-T載體測序， 結果證實擴增片斷723 bp， 包含有SRV-2 p27完整ORF共678 bp，編碼226 aa。將pMD-P27雙酶切后與同樣處理的pET-28b（+）載體連接，獲得陽性質粒pET- P27。

2.2 重組蛋白的表達及活性鑒定

圖1 RT-PCR擴增p27基因產物M： DNA molecular weight standards； 1： Water control；2： RT-PCR products Figure 1 RT-PCR products of p27 gene

重組質粒轉化E.coli Rosetta （DE3）， 37℃， IPTG濃度0.5 mmol/L誘導4 h表達量最大， 表達產物的SDS-PAGE分析結果表明，重組蛋白以上清形式表達，蛋白分子量約29000， 與預期相符（圖2）， Western blot 結果表明重組蛋白具有良好的特異性和反應原性（圖3）。

2.3 重組蛋白純化

表達菌大量誘導表達后收集裂解上清， 經Ni-IDA過柱純化后蛋白大小與純化前一致（圖4），按照SK3071 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒說明書，以不同體積蛋白的480 nm吸收值的平均值作為縱坐標，對應的BSA蛋白質濃度為橫坐標，繪制BSA標準曲線圖，按照480 nm吸光度與蛋白質量的線性關系為y=-0.0043x+1.1157，求得目的蛋白濃度為2.043 mg/mL，薄層掃描確定其純度為93.3%。蛋白測定結果見表1，圖5。

圖2 SDS-PAGE檢測重組p27蛋白在Rosetta中的表達Figure 2 Expression of recombinant p27 protein in E.coli Rosetta analyzed by SDS-PAGE

圖3 重組p27蛋白Western-blot 分析結果Figure 3 Western blot analysis of recombinant p27 protein

表1 各體積蛋白的480 nm吸收值及對應BSA蛋白濃度測定Table1 480nm absorption value of each volume protein and its corresponding BSA protein concentration

2.4 重組p27蛋白的診斷價值評價

以純化的重組蛋白作為診斷抗原包被ELISA板，對3份標準陽性血清和22份陰性血清進行檢測，3份陽性血清的A630值在0.355～1.210，22份陰性血清A630值在0.072～0.228，平均值為0.133，按照陰性平均A值的2.1 倍計算，陽性判定閾值為0.278。3份陽性血清檢出率及22份陰性血清檢出率為100%。

圖5 BSA標準曲線圖Figure 5 BSA standard curve

D型逆轉錄病毒分為內源性病毒（SERV）和外源性病毒（SRV）。SRV是引起SAIDS的主要病原。目前發(fā)現的SRV有7個血清型，其中，SRV-1～3已測序完成［9］。SRV的基因組結構與其他逆轉錄病毒相似， 兩端為長末端重復序列（LTR）， 其在病毒DNA的合成、整合和病毒基因的表達等方面起調節(jié)作用。中間包含4個開放閱讀框架（ORF）， 從5'端至3'端依次為： （1）編碼核心蛋白的gag基因， 它編碼一個大的前體核心蛋白，在病毒成熟過程中， 被蛋白酶水解成6個核心蛋白： p10、pp24、pp18、p12、p27、p14、p4； （2）編碼蛋白酶（Protease）的prt基因；（3）編碼逆轉錄酶（RT）和整合酶（核酸內切酶）的pol基因； （4）編碼囊膜蛋白（包括外膜蛋白gp70、跨膜蛋白gp20）的env基因。在env基因之后還有一個意義不明的延伸到右側LTR的短ORF［10，11］。

表2 重組蛋白對標準血清的ELISA檢測結果Table2 Result of ELISA with recombinant protein to test standard sera

SRV不同血清型之間有交叉反應， 主要發(fā)生在衣殼蛋白p27和跨膜蛋白gp20～gp22區(qū)域， 在D型逆轉錄病毒基因組中它們是高度保守的一段序列［12］。本研究選取編碼p27蛋白的基因作為研究對象，將其完整ORF插入原核表達載體pET-28b（+）的多克隆位點區(qū)，在37 ℃，IPTG濃度0.5 mmol/L 的條件下誘導4 h， 蛋白獲得較高水平的表達， 且以上清形式存在。目的蛋白大小約29 000 （含His標簽），與預期大小一致，Western blot 證實重組蛋白與猴SRV標準陽性血清發(fā)生特異性反應，具有良好的反應原性。基于融合蛋白所帶的6個組氨酸標簽，利用Ni-IDA柱對重組蛋白進行了純化， 并獲得了較高純度的蛋白。將純化的重組蛋白作為包被抗原， 通過間接ELISA方法嚴證重組蛋白的診斷價值。結果顯示，3份陽性血清的A630值在0.355～1.210， 22份陰性血清A630值在0.072～0.228， 平均值為0.133， 按照陰性平均A值的2.1 倍計算，陽性判定閾值為0.278。3份陽性血清檢出率及22份陰性血清檢出率為與VRL的SRV試劑盒完全相符。本結果顯示，重組蛋白具有血清學診斷價值，為下一步建立診斷方法奠定了基礎。

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Production of Recombinant Simian Type-D Retrovirus p27 Gene and Evaluation of its Diagnostic Potential

ZHOU Jie1， YANG Yan-fei1，2， HU Jian-hua1， TAO Ling-yun1， GAO Cheng1
（1.Shanghai Research Center of Laboratory Animal， Shanghai 201203；
2.Yangzhou University College of Veterinary， Yangzhou 225009）

Objective To Clone and express p27 gene of simian type-D retrovirus and evaluate its diagnostic potential.Method The p27 gene was amplified by RT-PCR and cloned into the prokaryotic expressive vector pET-28b（+） after sequencing.Recombinant plasmid was transformed into E.coli Rosetta DE3） and recombinant protein was analysed by SDS-PAGE and Western blot.The protein was purified affinity chromatography with Ni-NTA， and its diagnostic value was evaluated by ELISA.Results The highest soluble expression level of recombinant protein was obtained after being induced at 37℃ for 4 h，with the concentration of Isopropyl-β-D-thiogalactoside （IPTG） was 0.5 mmol/L， and the recombinant protein had immunological activity.After purified， the concentration of protein was 2.043 g/L， and the purity was 93.3%.The indirect ELISA was developed using the purified recombinant protein，detection of 3 standard positive sera and 22 negative sera showed the detection rate were 100%.Conclusion Recombinant p27 protein from prokaryotic expression system had perfect antigenicity，which would can be used as the candidate antigen of simian type-D retrovirus.

Simian type-D retrovirus； p27 gene； Prokaryotic expression； Serological detection

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0270-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.005

上海市科委科技創(chuàng)新行動計劃（13140900600）， 上海市科委研發(fā)平臺專項（15DZ2292400）

周 潔（1978-）， 女， 博士， 副研究員， 主要從事動物病毒分子生物學及免疫學方面的研究。E-mail： zhoujie0526@163.com

高 誠（1961-）， 男， 研究員。E-mail： gaochengdgb@126.com