齊海亮，齊科雷，宋鑫亮，蘇宏偉，杜秀然，王 鵬，李明珠

（河北省胸科醫(yī)院胸二科，河北石家莊　050041）

·方法研究·

血漿miR-193b和miR-199a在食管癌診治中的臨床價值

齊海亮，齊科雷，宋鑫亮，蘇宏偉，杜秀然，王 鵬，李明珠

（河北省胸科醫(yī)院胸二科，河北石家莊050041）

目的 探討miRNA-193b和miRNA-199a在血漿中的表達對食管鱗癌的診治價值。方法 選取2014年9月至2015年6月之間食管鱗癌患者56例，同期健康體檢者30例。采用qRT-PCR技術(shù)（TaqMan探針法）檢測食管鱗癌患者和健康者血漿中miRNA-193b、miRNA-199a的表達水平，以及檢測食管鱗癌患者術(shù)前、術(shù)后1w血漿中miRNA-193b、miRNA-199a的表達水平，并結(jié)合臨床病理資料，探討它們與食管鱗癌的關(guān)系。結(jié)果 食管鱗癌患者血漿中miR-193b和miR-199a的表達量均明顯低于健康體檢者（P＜0.05）；食管癌患者術(shù)后血漿中miR-193b和miR-199a的表達量均明顯高于術(shù)前（P＜0.05）；血漿中miR-193b的表達與腫瘤TNM分期有關(guān)（t=-5.332，P=0.000），表現(xiàn)為隨著TNM分期越晚，表達逐漸下調(diào)的趨勢，與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。miR-199a的表達與腫瘤分化程度、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），表現(xiàn)為隨著分化程度越低、TNM分期越晚和出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，表達逐漸下調(diào)的趨勢，而與患者年齡、性別無明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。結(jié)論 miRNA-193b、miRNA-199a在食管鱗癌患者血漿中表達下調(diào)，可能作為抑癌基因參與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展。

食管鱗癌； 血漿； miRNA-193b； miRNA-199a

DOI：10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.04.023

收稿日期：2015-10-07；修回日期：2015-12-25

基金項目：河北省科技支撐計劃項目（132777221）

作者簡介：齊海亮（1982—），男，主治醫(yī)師。E-mail：10761119@qq.com

近年來研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）是一類真核細胞中長度為19～25個核苷酸內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，它可以識別靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR），并且能通過抑制翻譯及影響mRNA的穩(wěn)定性而抑制靶基因表達［1］，參與細胞的分化、增殖、凋亡等［2-3］。目前研究已經(jīng)證實，miRNAs可作為癌基因或抑癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移［4］。研究發(fā)現(xiàn)，諸多miRNAs與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系；然而，miRNA-193b和miRNA-199a在食管鱗癌中是否具有一定的生物學功能，國內(nèi)外鮮有報道。本研究采用qRT-PCR技術(shù)（TaqMan探針法）檢測食管鱗癌患者和健康者的血漿中miRNA-193b、miRNA-199a的表達水平，及食管鱗癌患者術(shù)前、術(shù)后1w血漿中miRNA-193b、miRNA-199a的表達水平，并結(jié)合臨床病理資料，探討它們與食管鱗癌的關(guān)系。

材料和方法

1 研究對象

1.1食管癌患者 選取2014年9月至2015年6月河北省胸科醫(yī)院胸外科確診并行手術(shù)治療的食管鱗狀細胞癌患者的外周血，共56例。其中男性36例，女性20例，年齡39～77歲，平均年齡60.2± 11.6歲。每位患者均無其他腫瘤病史，采取外周血標本前及手術(shù)前均未行放療、化療、生物治療等任何治療，所有患者均行手術(shù)治療，術(shù)后病理結(jié)果均為：食管鱗狀細胞癌。依據(jù)患者年齡：＜60歲25例，≥60歲31例；依據(jù)WHO腫瘤病理學分級：高中分化23例，低分化33例；依據(jù)淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移分：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（NO）32例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（N+）24例；并依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）第7版食管癌TNM判定標準進行分期：I+II期40例，III+IV期16例。

1.2健康體檢者 收集30例同期健康體檢志愿者的外周血，均無腫瘤病史，無高血壓、糖尿病、心臟病等慢性病史。男性18例，女性12例，年齡37～ 75歲，平均年齡58.8±10.7歲。與食管癌患者在性別、年齡等一般情況的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

本研究經(jīng)過河北省胸科醫(yī)院倫理委員會審查和批準，全部患者知情并同意。

2 主要試劑

Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司，實時熒光定量PCR檢測試劑盒購于美國Promega公司，所有引物均由中國北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

3 方法

3.1標本采集與處理 分別采集食管癌患者術(shù)前、術(shù)后1w和健康體檢者空腹靜脈血2mL，迅速注入EDTA采血管中，于4℃3500×g離心10min，吸取上清懸浮液置入新的EP管中，至于-80℃冰箱中保存待用。

3.2血漿中總的RNA的提取 分別吸取以上血漿樣本250μL，加入750μL Trizol試劑，混勻，按照說明書操作，分別加入氯仿、異丙醇等試劑，最終提取總RNA。將1μL RNA液加入DEPC水內(nèi)，用分光光度儀測定OD260/280吸光值，衡量總RNA純度，比值在1.8～2.0之間提示提取的總RNA樣品純度較高，用于后續(xù)實驗。

3.3逆轉(zhuǎn)錄反應 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應體系20μL：1.5μL總RNA，特異性莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物2μL，Rnase inhibitor（RNA酶抑制劑）1μL，Reaction Buffe（緩沖液）4μL，Reverse Transcriptase（逆轉(zhuǎn)錄酶）1μL，10mmol/L dNTP Mix 2μL，DECP Water（DECP水）8.5μL。反應條件：42℃ 60min，25℃ 5min，70℃ 5min，將逆轉(zhuǎn)錄反應后產(chǎn)物cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4實時熒光定量PCR 由于血漿miRNA表達量較低，所以先將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行預擴增。按照TaqMan PreAmp Master Mix試劑盒說明書進行預擴增。反應條件：95℃ 10min；55℃2min；72℃2min；95℃ 15s、60℃4min，共12個循環(huán)；最后99℃10min。取預擴增產(chǎn)物4μL，按照TaqMan PCR試劑盒說明進行PCR反應?？偡磻w系20μL。反應條件：95℃預變性10min；95℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)；72℃延伸7min。每個樣本做3個復孔。記錄每個熒光反應管中的熒光信號達到所設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，將原始數(shù)據(jù)取3次重復的平均值，以U6為內(nèi)參，進行歸一化，使用定量PCR中的相對定量法，得出ΔCt，ΔCt= CtmiR-193b或miR-199a-CtU6，以2-ΔCt分別計算食管癌組織和癌旁組織中的miR-193b/miR-199a的相對表達量。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用配對t檢驗，成組設計的計量資料采用獨立樣本t檢驗的方法。采用雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 食管癌患者和健康體檢者的血漿miR-193b、miR-199a表達情況

在食管鱗癌患者術(shù)前的血漿中miR-193b表達量為0.022±0.003，而在健康體檢者的血漿中表達量為0.039±0.006，食管鱗癌患者血漿中miR-193b表達明顯降低，兩者存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（t=-25.343，P＜0.001）；而在食管鱗癌患者術(shù)前的血漿中miR-199a表達量為0.019±0.002，而在健康體檢者的血漿中表達量為0.036±0.004，食管鱗癌患者血漿中miR-199a表達明顯降低，兩者存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（t=-27.546，P＜0.001）。見表1。經(jīng)過計算我們發(fā)現(xiàn)miR-193b的Cut Off值為0.0305時，其診斷食管鱗癌的敏感度為0.853，特異度為0.763；miR-199a的Cut Off值為0.0265時，其診斷食管鱗癌的敏感度為0.918，特異度為0.835；兩者聯(lián)合檢測的敏感度為0.882，特異度為0.894。

表　1 miR-193b和　miR-199a在健康人群和食管鱗癌患者血漿中的表達情況（x±s）

2 食管癌患者血漿miR-193b、miR-199a術(shù)前和術(shù)后的表達情況

在食管鱗癌患者術(shù)后1w的血漿中miR-193b表達量為0.037±0.004，較術(shù)前的0.022±0.003，明顯升高，兩者存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（t= 25.168，P＜0.001）；而在食管鱗癌患者術(shù)后1w的血漿中miR-199a表達量為0.035±0.003，較術(shù)前的0.019±0.002，明顯升高，兩者存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（t=45.728，P＜0.001）。見表2。

表　2 在食管鱗癌患者血漿中　miR-193b和　miR-199a術(shù)前和術(shù)后的表達差異（x±s）

3 miR-193b、miR-199a的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系

3.1miR-193b表達與臨床病理特征的關(guān)系

通過整理食管癌患者的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)血漿中miR-193b的表達與腫瘤TNM分期有關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。其中III+IV患者的表達量為0.019±0.007，明顯低于I+II患者的0.024± 0.004，具有統(tǒng)計學差異（t=5.332，P＜0.001）。見表3。

表3　miR-193b的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系（x±s）

3.2miR-199a表達與臨床病理特征的關(guān)系通過整理食管癌患者的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)miR-199a的表達與腫瘤分化程度、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、性別無明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。其中低分化患者的表達量為0.017 ±0.005，明顯低于高中分化患者的0.019±0.004，具有統(tǒng)計學差異（t=4.434，P=0.003）；III+IV患者的表達量為0.018±0.006，明顯低于I+II患者的0.020±0.004，具有統(tǒng)計學差異（t=5.129，P＜0.001）；具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者表達量為0.018± 0.008，明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的0.019± 0.005，具有統(tǒng)計學差異（t=4.294，P=0.002）。詳見表4。

表4　miR-199a的表達與臨床病理特征的關(guān)系（x±s）

討 論

自從首個miRNA功能被確認以來，miRNA已經(jīng)成為生命科學研究領(lǐng)域的熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)很多miRNA通過調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化、遷移、死亡、蛋白分解、血管形成等生物程序而參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程［5］。miRNAs家族數(shù)量巨大，其中許多miRNAs與食管癌有著密切關(guān)系。

miR-193b的編碼基因在人16號染色體上，它是非編碼的小分子RNA，作為一種重要的調(diào)節(jié)因子，它參與了機體諸多生理病理過程。自200年被首次發(fā)現(xiàn)以來，關(guān)于它的報道越來越多。有報道［6］指出，在急性髓系白血病細胞中，miR-193b表達明顯下降，c-Kit表達升高，兩者呈負相關(guān)，同時指出調(diào)控miR-193b表達，對c-Kit陽性的AML的治療具有意義。還有研究報道［7］miR-193b在非小細胞肺癌組織中表達下調(diào)，當其過表達時可以顯著降低A549細胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移能力。Li等［8］報道在乳腺癌細胞內(nèi)下調(diào) miR-193b的表達，可明顯增加uPA，進而刺激瘤細胞的惡性表型發(fā)生。Lenarduzzi等［9］研究發(fā)現(xiàn)在敲除頭頸部鱗狀細胞癌FaDu細胞系的miR-193b基因，可使癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力提高，并且在體內(nèi)可以抑制瘤細胞的形成。同樣還有其他研究證明，在前列腺癌、胃癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌等細胞、組織、血漿中表達均下調(diào)，通過調(diào)節(jié)靶基因，最終導致腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的主要分子。以上提示miR-193b在多種惡性腫瘤中起到負調(diào)控作用，為一種腫瘤抑制因子。在本研究中，我們采用qRT-PCR技術(shù)（TaqMan探針法）檢測食管鱗癌患者和健康者，及食管鱗癌患者術(shù)前、術(shù)后1w血漿中miRNA-193b的表達水平，發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者血漿中miR-193b的表達量明顯低于健康體檢者，兩者存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（t=-25.343，P ＜0.001）；同時發(fā)現(xiàn)食管癌患者術(shù)后血漿中miR-193b的表達量明顯高于術(shù)前，兩者存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（t=-26.454，P＜0.001）；而且通過結(jié)合患者的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)miR-193b的表達與腫瘤TNM分期有關(guān)（t=-5.332，P＜0.001），表現(xiàn)為隨著TNM分期越晚，表達逐漸下調(diào)的趨勢，而與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。本研究提示，miR-193b在食管鱗癌中表現(xiàn)為抑癌基因的作用，當它表達下調(diào)時，可能引起某種促癌機制活化，導致食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，但是其發(fā)生機制尚不清楚，有待進一步研究。

miR-199a在許多疾病的病理生理過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。在腫瘤方面，miR-199a發(fā)揮著雙向調(diào)控作用。其中，在結(jié)直腸癌中miR-199a表達下調(diào)可引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲，并可激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）［10］。Cao等［11］報道m(xù)iR-199a能通過抑制腫瘤促進因子PAK4的表達，從而阻斷PAK4/ Raf/MEK/ERK信號通路，進而抑制肝癌細胞的增殖。Kim等研究發(fā)現(xiàn)在肺癌中miR-199a負性調(diào)控原癌基因Met，隨后證實在前列腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、膀胱癌中同樣存在這種負性調(diào)控。然而，Song等［12］報道在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-199a表達明顯上調(diào)。Lee等［13］在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-199a表達顯著上調(diào)，并把反義miR-199a寡核苷酸轉(zhuǎn)染入宮頸癌細胞后，阻斷miR-199a的表達，則明顯抑制癌細胞的生長。然而Pereira等［14］研究中選擇U6作為內(nèi)參，結(jié)果提示miR-199a在宮頸癌組織中表達顯著下調(diào)。因而我們分析，miR-199a在腫瘤組織或細胞的表達與調(diào)控作用或許受多種因素影響。在本研究中，我們采用qRT-PCR技術(shù)（TaqMan探針法）檢測食管鱗癌患者和健康者，及食管鱗癌患者術(shù)前、術(shù)后1w血漿中miR-199a的表達水平，發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者血漿中miR-199a的表達量明顯低于健康體檢者，兩者存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（t=-27.546，P＜0.001）；同時發(fā)現(xiàn)食管癌患者術(shù)后血漿中miR-199a的表達量明顯高于術(shù)前，兩者存在顯著差異，具有統(tǒng)計學意義（t=-24.887，P＜0.001）；而且通過結(jié)合患者的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)miR-199a的表達與腫瘤分化程度、腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），呈現(xiàn)為與隨著分化程度越低、TNM分期越晚，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，表達逐漸下調(diào)的趨勢，而與患者年齡、性別無明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。本研究提示我們，miR-199a在食管鱗癌血漿中可能為一種抑癌基因，當其表達下調(diào)時，可引起某種促癌機制活化，導致食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，但是其發(fā)生機制尚不清楚，有待進一步研究。

綜上所述，miR-193b、miR-199a在食管鱗癌的血漿中表達下調(diào)，且隨著腫瘤的侵及、轉(zhuǎn)移，表達進一步下調(diào)，表現(xiàn)為抑癌基因作用，它們或許可作為食管鱗癌診斷中新的標志物，和治療的全新靶點。本研究中不足之處在于，由于樣本量較小，數(shù)據(jù)存在偏移，而且沒有加入返流性食管炎、食管良性腫瘤等相關(guān)疾病作為對照，其真正用于臨床有待進行進一步研究印證，此外，未明確它們的靶基因和調(diào)控機制，有待進一步研究。

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（潘子昂編輯）

Clinical Value of Plasma miR-193b and miR-199a in the Diagnosis and Treatment of Esophageal Squamous Cell Carcinoma

QI Hai-liang，QI Ke-lei，SONG Xin-liang，SU Hong-wei，DU Xiu-ran，WANG Peng，LI Ming-zhu
（Department of Thoracic Surgery，Hebei Chest Hospital，Shijiazhuang 050041，China）

Objective To investigate the value of miRNA-193b and miRNA-199a in the diagnosis and treatment of esophageal squamous cell carcinoma.Methods 56 cases of esophageal squamous cell carcinoma and 30 cases of healthy physical examination were selected.MiRNA-193b and miRNA-199a expression levels in esophageal squamous cell carcinoma patients and healthy persons were detected by qRT-PCR technique，and the expression levels of miRNA-199a and miRNA-193b in plasma of patients with esophageal squamous cell carcinoma before and after operation were detected.Results The expression of plasma miR-199a and miR-193b in patients with esophageal squamous cell carcinoma was significantly lower than that of healthy controls（P＜0.05）.The expression of plasma miR-199a and miR-193b in patients with esophageal carcinoma after operation was significantly higher than that of the preoperative expression（P＜0.05）.The expression of miR-193b in plasma was related to TNM staging（P=0.000，t=-5.332），and gradually decreased with the TNM staging.It had no significant association with age，gender，tumor differentiation and lymph node metastasis（P＞0.05）.The expression of miR-199a was related to the tumor differentiation，TNM stage and lymph node metastasis（P＜0.05），and gradually decreased with the lower differentiation degree，TNM staging，lymph node metastasis.Ithad no significant association with age and gender of patients（P＞0.05）.Conclusion The expression levels of miRNA-193b and miRNA-199a in the plasma of patients with esophageal squamous cell carcinoma is downregulated.It may act as a tumor suppressor gene involved in the development of esophageal squamous cell carcinoma.

Esophageal squamous cell carcinoma； Plasma； miRNA-193b； miRNA-199a