李曉雯，李艷麗，陳思思，廖勇敢

（湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北　十堰　442000）

阿魏酸鈉與彌可保治療糖尿病周圍神經病變模型大鼠心肌TGF和CTGF表達的研究

李曉雯，李艷麗，陳思思，廖勇敢

（湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000）

目的 探討應用阿魏酸鈉與彌可保對糖尿病周圍神經病變模型大鼠心肌的TGF和CTGF表達的效果。方法 選取90只4個月齡的SD雄性大鼠，隨機均分為對照組、糖尿病周圍神經病變組、阿魏酸鈉干預組、彌可保干預組、阿魏酸鈉與彌可保干預組，每組15只，分別觀察測定實驗后大鼠的體重、血糖、胰島素及心肌CTGF和TGF的變化。結果 與對照組比較，其余各組體重均下降，血糖、胰島素、心肌CTGF與TGF均有所升高，但是其余各干預組體重、血糖、胰島素、心肌CTGF與TGF指標均比糖尿病周圍神經病變組有所改善，其中阿魏酸鈉與彌可保組效果更明顯（P＜0.05）。結論 阿魏酸鈉和彌可保均能抑制糖尿病大鼠心肌CTGF及TGF-β1的表達，起到心臟保護作用，兩藥聯用具有協同作用，為臨床治療提供了借鑒。

阿魏酸鈉； 彌可保； 糖尿病周圍神經病變； TGF； CTGF

DOI：10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.04.029

收稿日期：2015-08-26；修回日期：2015-10-08

通訊作者：廖勇敢

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）屬于糖尿病的并發(fā)癥，在糖尿病的并發(fā)癥中較為常見［1］。目前對糖尿病周圍神經病變的發(fā)病機制尚不清楚，但是有發(fā)現表明促進心肌纖維化的炎性、細胞因子-結締組織生長因子（CTGF）和轉化生長因子（TGF）參與其發(fā)病過程［3］。本研究就通過建立糖尿病大鼠模型，對阿魏酸鈉與彌可保治療糖尿病周圍神經病變模型大鼠心肌TGF和CTGF的表達作用進行初步探討。

資料與方法

1 一般資料及造模

本研究選取90只4個月齡的SD雄性大鼠，質量為84～98g，均購自湖南省實驗動物研究中心。購來后用鼠籠喂養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1周，讓其自由攝食與飲水。隨機均分為對照組、糖尿病周圍神經病變組、阿魏酸鈉干預組、彌可保干預組、阿魏酸鈉與彌可保干預組，每組15只。本研究使用的阿魏酸鈉，均購自廣東眾生公司，批號為140109；彌可保，均購自諾華制藥公司，批號為131109。

大鼠糖尿病周圍神經病變模型的建立：對所有大鼠均禁食12小時后，①正常組（NC）15只，飼喂普通飼料，一個月后以30mg/kg劑量腹腔注射0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液（pH 4.2，4℃）），3天后測定非同日的血糖變化，連續(xù)3次測定大鼠的空腹血糖均小于11.1mmol/L且非空腹血糖均小于16.7mmol/L，觀察一周其血糖較穩(wěn)定，為對照組鼠；②對糖尿病周圍神經病變組、阿魏酸鈉干預組、彌可保干預組、阿魏酸鈉與彌可保干預組的75只大鼠均進行高脂高糖飲食（普通飼料+10%蔗糖+20%豬油），一個月后，以30mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液 （用0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液（pH4.2，4℃）配成2%濃度），3天后測定非同日的血糖變化，連續(xù)3次測定大鼠的空腹血糖均大于11.1mmol/L且非空腹血糖均大于16.7mmol/L，觀察一周其血糖較穩(wěn)定，本次造模成功［4］。

2 實驗方法

用蒸餾水制備阿魏酸鈉溶液（15mg/mL）與彌可保溶液（15mg/mL），配制后儲存于4℃冰箱中。除對照組、糖尿病周圍神經病變組灌服等容量的蒸餾水、阿魏酸鈉與彌可保干預組按照每天各2.5mL/kg體積給藥外，其它各組均按照每天5mL/kg體積給藥，每天1次，連續(xù)2個月，實驗過程中，飼養(yǎng)大鼠的其它條件不變，均飼喂普通飼料、正常飲水等［5］。在灌胃給藥過程中，有大鼠死亡，最終進行實驗的大鼠數量如下：對照組15只、糖尿病周圍神經病變組14只、阿魏酸鈉干預組14只、彌可保干預組15只、阿魏酸鈉與彌可保干預組14只。

3 觀察指標及標本的采集

觀察指標包括大鼠的一般狀態(tài)、體重、血糖以及心肌組織的TGF-β1和CTGF的測定，分別觀察各組大鼠的情況［6］。

其中一般狀態(tài)包括大鼠的精神、形體的狀態(tài)，觀察大鼠皮毛的色澤，運動情況等；

體重測定：實驗開始時、實驗結束1個月后、2個月后各記錄一次大鼠的體重，用電子稱稱重；

實驗后2個月，大鼠腹腔中注射20%的烏拉坦（5mL/kg）進行麻醉，在固定架上固定，測定迅速取出心臟，在預冷的鹽水中沖洗后進行重量的測定。部分心肌組織置于液氮中保存，用于TGF-β1和CTGF的測定。抽取主靜脈血液進行血糖和胰島素的測定。

血糖和胰島素的測定［7］：大鼠的血糖采用Surestep血糖儀測定，胰島素采用放免法測定，試劑盒均購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，嚴格按照上述試劑盒說明書操作。

TGF-β1和CTGF的測定［8］：采用western blot的方法測定TGF-β1和CTGF的表達量。一抗采用Sigma的兔抗鼠TGF-β1和CTGF多克隆抗體，1∶200稀釋使用。采用辣根過氧化物酶標記的二抗，1∶2000稀釋。以光密度表示TGF-β1和CTGF的表達量。

4 統(tǒng)計學方法

對文中所得數據采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理并作比較分析，數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 一般狀態(tài)

除對照組外，各組大鼠均出現明顯多飲、多尿、多食、體重下降、皮毛污穢無光澤、精神萎靡、動作遲緩等現象，各治療組大鼠情況均好于糖尿病周圍神經病變組，其中，阿魏酸鈉與彌可保干預組大鼠變化改變情況最少。

2 大鼠體重變化情況

實驗開始時各組動物的體重比較無顯著性變化，實驗的第1個月與第2個月，與對照組比較各組大鼠體重均有不同程度的下降，糖尿病周圍神經病變組的體重下降的更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第1個月與第2個月的結果顯示，阿魏酸鈉與彌可保干預組、阿魏酸鈉干預組、彌可保干預組與糖尿病周圍神經病變組比較體重均上升，且阿魏酸鈉與彌可保干預組比阿魏酸鈉干預組、彌可保干預組體重明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1　各組大鼠體重比較（x±s，g）

3 實驗后2個月大鼠血糖與胰島素的變化情況

實驗結束后2個月對大鼠血糖與胰島素進行分析，與正常對照組相比，各組大鼠血糖均顯著升高，但是除對照組以外，與糖尿病周圍神經病變組比較，阿魏酸鈉與彌可保干預組、阿魏酸鈉干預組、彌可保干預組血糖均降低，阿魏酸鈉與彌可保干預組降低較為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2　各組大鼠血糖與胰島素的比較（x±s）

4 實驗后2個月大鼠TGF-β1和CTGF表達的變化情況

實驗結束后2個月對大鼠對大鼠TGF-β1和CTGF進行分析，與對照組比較，阿魏酸鈉與彌可保干預組、阿魏酸鈉干預組、彌可保干預組、糖尿病周圍神經病變組的TGF-β1和CTGF均有所升高；除對照組以外，阿魏酸鈉與彌可保干預組、阿魏酸鈉干預組、彌可保干預組與糖尿病周圍神經病變組比較，TGF-β1和CTGF均有所降低，且阿魏酸鈉與彌可保干預組降低的更多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果表明，阿魏酸鈉與彌可保均可以改善大鼠心肌細胞的TGF-β1和CTGF的表達，且同時使用具有協同作用，效果更佳。見表3。

表3　各組大鼠TGF-β1和　CTGF表達比較（x±s，pg/mL）

討 論

近年來糖尿病的發(fā)病率逐漸升高，伴隨的并發(fā)癥也不斷出現，醫(yī)學工作者已經開始對糖尿病周圍神經病變逐步重視，是研究的重點［9］。人們建立了多種用于其病理機制研究和治療藥物研究的動物模型，有STZ誘發(fā)的大鼠、小鼠、狗、轉基因大鼠和小鼠自發(fā)性糖尿病模型等糖尿病動物模型［10］。有研究發(fā)現，STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠模型是最為常用的糖尿病模型，因為這種模型在早期的功能、生化、病理等的異常變化與人類的相似，結構改變在I型、II型糖尿病模型中，因此，本研究選擇了注射STZ誘發(fā)大鼠糖尿病動物模型，也是目前應用最多的一種模型，且此模型制備方法便于操作，大鼠死亡率低。

糖尿病周圍神經病變中存在著心肌結構紊亂，即心肌纖維化，其中，與糖尿病的心肌纖維化關系最密切的是血纖維蛋白溶酶原生長因子，包括TGF和CTGF。TGF-β是可以使心臟纖維變性和心肌細胞肥大的生長因子，它有促進纖維細胞生長、調節(jié)細胞周期、細胞分化、免疫調節(jié)等功能［11］。已發(fā)現TGF-β有5種異構體（TGF-β1～TGF-β5），其中TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3主要見于哺乳動物，TGF-β1過度表達與心肌細胞肥大和心肌纖維化密切相關，TGF-β1可以抑制基質金屬蛋白酶、增強膠原酶抑制劑的表達、增加TIMP-1基因的表達。高糖環(huán)境可以上調TGF-β1和CTGF表達、活性，使左心室基質沉積，而在糖尿病心肌纖維化中TGF-β1活化，同時伴隨著半乳糖凝集素的激活，被認為在誘導組織纖維化過程中是關鍵步驟，所以本研究著重測定TGF-β1的變化情況［12］。CTGF為半胱氨酸的分泌肽，有研究發(fā)現CTGF對成纖維細胞具有趨化、促細胞增殖、促進有絲分裂等的作用，CTGF與血管、心臟、胰腺、肝臟等在內的許多組織器官纖維化相關。CTGF是與糖尿病周圍神經病變心肌纖維化相關的重要細胞生長因子。

本研究發(fā)現，各干預組的體重、血糖、胰島素、心肌TGF-β1和CTGF的表達水平均較糖尿病周圍神經病變組具有較好的恢復，且阿魏酸鈉與彌可保干預組效果更好，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。綜述所述，阿魏酸鈉與彌可保不僅能夠降脂降糖，在心血管方面的治療中也有一定的保護作用，能夠降低TGF-β1和CTGF的表達，對糖尿病的研究提供了一定的借鑒。

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（李 凌編輯）

Expression of Myocardial TGF and CTGF in Diabetic Peripheral Neuropathy Model Rat After Treatment with Sodium Ferulate and Mecobalamin

LI Xiao-wen，LI Yan-li，CHEN Si-si，LIAO Yong-gan
（Endocrine DepartmentPeople's Hospital Affiliated to Hubei Medical College，Shiyan 442000，China）

Objective To investigate the effect of sodium ferulate and Mecobalamin on myocardial TGF and CTGF expression in diabetic peripheral neuropathy model rat.Methods Ninety of four month old male SD rats were randomly divided into normal control group，diabetes peripheral neuropathy group，sodium ferulate intervention group，Methycobal intervention group，ferulic acid sodium and mecobalamin intervention group，with 15 rats in each group.The changes of rat body weight，blood glucose，insulin and myocardial CTGF and TGF were measured after the experiment.Results Compared with normal control，the body weight in other groups were decreased，but the blood glucose，insulin，myocardial CTGF and TGF levels were increased.The above indexes in intervention group were improved compared with the diabetic peripheral neuropathy group，and sodium ferulate combined with methylcobalamin intervention group showed Bulgaria effect more obviously（P＜0.05）. Conclusion Sodium ferulate and Methycobal can inhibit expression of myocardial CTGF and TGF beta 1 in diabetic rats.The combination of two drugs has a synergistic effect and provides the reference for the clinical treatment.

Ferulic acid sodium； Methylcobalamin； Diabetic peripheral neuropathy； TGF； CTGF