陳堅(jiān)平，康凱夫，周園園，吳國標(biāo)

（順德第一人民醫(yī)院病理科，廣東　順德　528300）

雌激素對ERα-/ERβ-乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制

陳堅(jiān)平，康凱夫，周園園，吳國標(biāo)

（順德第一人民醫(yī)院病理科，廣東順德528300）

目的 研究雌激素對ERα-/ERβ-乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制。方法 選擇乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3（GPR30+，ERα-/ERβ-）進(jìn)行研究，用不同水平的雌二醇進(jìn)行處理，同時將GPR30的siRNA和陰性對照的siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。處理24h后，檢測細(xì)胞的增殖情況和侵襲情況。結(jié)果 雌二醇處理能夠以劑量依賴的方式增加細(xì)胞活力以及侵襲細(xì)胞的數(shù)目；轉(zhuǎn)染GRP30-siRNA能夠顯著降低GPR30的mRNA含量，抑制效率為75.42%；雌二醇處理組的細(xì)胞活力以及侵襲數(shù)目均高于對照組，雌二醇聯(lián)合GRP30-siRNA組的細(xì)胞活力以及侵襲數(shù)目均低于雌二醇處理組（P＜0.05）。結(jié)論 雌激素能夠促進(jìn)ERα-/ERβ-乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，受體GPR30可能是雌激素發(fā)揮作用的分子機(jī)制。

乳腺癌； 雌激素； 雌激素受體； GPR30

乳腺癌是我國女性最常見的惡性腫瘤，雌激素在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色，雌激素受體ER介導(dǎo)了雌激素的多種生物學(xué)效應(yīng)。ER受體陽性的乳腺癌患者通過內(nèi)分泌治療和Her-2靶向治療能夠取得較為理想的效果［1］。近年來，ER陰性乳腺癌患者的發(fā)生率逐年升高，該類患者缺乏內(nèi)分泌治療以及Her-2靶向治療的指征，而抗VEGFR、 EGFR治療的效果并不理想［2］。ER-乳腺癌患者多見于絕經(jīng)前女性以及年齡較小的人群，這也提示雌激素可能在病情發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用［3］。由于ER陰性，因此雌激素可能不通過ER受體途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前，關(guān)于雌激素調(diào)節(jié)ER陰性乳腺癌細(xì)胞的分子機(jī)制以及受體途徑仍未完全闡明［4］。在下列研究中，我們對雌激素對ERα-/ERβ-乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制進(jìn)行了分析。

DOI：10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.04.030

收稿日期：2015-09-30；修回日期：2015-11-14

材料和方法

1 材料

乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3（GPR30+，ERα-/ ERβ-）購買于中科院細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購買于Gibco公司，MTT試劑購買于Sigma公司，Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板購買于Corning公司，DAPI細(xì)胞核染液購買于碧云天公司。酶標(biāo)儀為Bio-tek公司生產(chǎn)，熒光顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。

2 免疫組化檢測方法

免疫組化檢測取經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋原發(fā)乳腺癌組織，作4μm厚連續(xù)切片。二甲苯浸泡（10min）-二甲苯（10min）-100%酒精（3min）-100%酒精（3min）-95%酒精（3min）-95%酒精（3min）-80%酒 精（3min）-80% 酒 精（3min）-80% 酒 精（3min）-75%酒精（3min）-75%酒精（3min）逐級浸泡切片，PBS沖洗3次，每次5min。

采用微波爐將1mmol/L枸椽酸鈉緩沖液加熱到980C，放入切片，持續(xù)10～20min，取出冷卻，PBS沖洗3次，每次5min。

滴加3%H2O2去離子水50μL，370C孵育10min，PSB沖洗3次，每次5min；滴加50μL聚合物輔助劑，370C孵育20min，PSB沖洗3次，每次5min；滴加50μL DAB溶液，控制顯色時間；復(fù)染、脫水、透明、封片。

3 細(xì)胞培養(yǎng)方法

從液氮罐中取出乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3，放置在37℃的水浴鍋中迅速震蕩使之融化，將融化后的細(xì)胞懸液離心、棄上清并得到細(xì)胞沉淀，用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基5～6 mL重懸細(xì)胞，接種在培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞生長至70%～80%左右的密度時，用胰酶消化細(xì)胞，消化得到的細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長后用于下一步處理。

4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法

取細(xì)胞板中的細(xì)胞進(jìn)行處理，對照組用不含血清的培養(yǎng)基處理；雌二醇處理組用不同水平的雌二醇處理；轉(zhuǎn)染siRNA時，用Invitrogen公司轉(zhuǎn)染試劑將GPR30的siRNA和陰性對照的siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。處理24h后，進(jìn)行細(xì)胞增殖和侵襲指標(biāo)的檢測。

5 細(xì)胞活力檢測

細(xì)胞處理24h后，棄去全部培養(yǎng)基，加入MTT溶液孵育4h，而后棄去MTT溶液，加入DMSO后迅速震蕩，最后在酶標(biāo)儀上讀取490nm處的吸光值。

6 細(xì)胞侵襲檢測

取Transwell培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞侵襲檢測，在小室中涂布基質(zhì)膠，待基質(zhì)膠交聯(lián)后接種200μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h后進(jìn)行不同條件的處理，最后觀察從小室內(nèi)側(cè)進(jìn)入小室外側(cè)的細(xì)胞數(shù)目，具體方法如下：擦去小室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，取下小室內(nèi)的微膜，用DAPI染液對小室外側(cè)的細(xì)胞進(jìn)行染色，而后在顯微鏡下觀察3個隨機(jī)視野，記錄細(xì)胞數(shù)目。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行處理，細(xì)胞活力、侵襲細(xì)胞數(shù)目等計(jì)量資料用（x±s）表示，兩組間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料的比較采用方差分析，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ERα、ERβ在乳腺癌組織中表達(dá)特點(diǎn)

ERα、ERβ在乳腺癌組織中表達(dá)特點(diǎn)ERα均表達(dá)于細(xì)胞核，而ERβ多表達(dá)于細(xì)胞核，少表達(dá)于胞漿與間質(zhì)。見圖1。

2 雌激素對癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)節(jié)作用

雌二醇處理能夠以劑量依賴的方式增加細(xì)胞活力以及侵襲細(xì)胞的數(shù)目，見表1。

表1　雌激素對癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)節(jié)作用（x±s）

3 GRP30-siRNA的轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染GRP30-siRNA組細(xì)胞中 GPR30的 mRNA含量為24.58±3.45，顯著低于轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組細(xì)胞中GPR30的mRNA含量100±14.85（t= 11.256，P＜0.05）。轉(zhuǎn)染GRP30-siRNA對GPR30 mRNA含量的抑制效率為75.42%。

4 轉(zhuǎn)染GRP30-siRNA后雌激素對癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)節(jié)作用

雌二醇處理組的細(xì)胞活力以及侵襲數(shù)目均高于對照組，雌二醇聯(lián)合GRP30-siRNA組的細(xì)胞活力以及侵襲數(shù)目均低于雌二醇處理組（P＜0.05）。見表2。

表2　轉(zhuǎn)染　GRP30-siRNA后雌激素對癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)節(jié)作用（x±s）

討 論

三陰乳腺癌是較為特殊的一類乳腺癌，由于腫瘤組織內(nèi)ER、PR均陰性，對內(nèi)分泌治療以及Her-2靶向治療的敏感性較差［5］。近年來的流行病學(xué)調(diào)查顯示，絕經(jīng)前女性和年輕人群是ER陰性乳腺癌患者的高發(fā)人群，這也提示雌激素在ER陰性乳腺癌的病情進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要作用［6］。雌激素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的經(jīng)典方式是與ER結(jié)合并啟動下游多種靶基因的表達(dá)，進(jìn)而造成癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲［7］。但是，對于ER陰性乳腺癌患者而言，雌激素并不通過ER來發(fā)揮對癌細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用［8］。目前，關(guān)于雌激素調(diào)節(jié)ER陰性乳腺癌細(xì)胞的分子機(jī)制以及受體途徑仍未完全闡明［9］。

在本研究中，我們首先分析了雌激素對ER陰性乳腺癌細(xì)胞增殖以及侵襲的調(diào)節(jié)作用。我們選擇ERα-/ERβ-乳腺癌細(xì)胞株作為研究對象，給予不同水平的雌二醇處理后檢測細(xì)胞的活力以及侵襲細(xì)胞的數(shù)目。MTT法是檢測細(xì)胞活力的常用方法，噻唑藍(lán)能夠被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原為Formazan，為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶，通過讀取特定波長的吸光值能夠反映細(xì)胞活力；Transwell是檢測細(xì)胞侵襲的常用方法，通過測定小室內(nèi)側(cè)侵襲并遷移至小室外側(cè)的細(xì)胞數(shù)目能夠反映侵襲能力［10］。本文研究中，雌二醇能夠以劑量依賴的方式促進(jìn)ERα-/ERβ-乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，與Scaling等［11］報道基本相似。

GRP30是近年來新發(fā)現(xiàn)的雌激素受體，相關(guān)研究認(rèn)為GRP30是預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，雌二醇與GPR30具有極高的親和力且能夠獨(dú)立介導(dǎo)雌激素的生物學(xué)效應(yīng)［12-13］。為了明確雌激素是否通過GRP30來發(fā)揮對ERα-/ERβ-乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)節(jié)，我們采用 siRNA轉(zhuǎn)染的方式敲低GRP30，而后通過敲低GPR30聯(lián)合雌二醇的方式來處理細(xì)胞，進(jìn)而檢測細(xì)胞的活力以及侵襲細(xì)胞的數(shù)目。由分析結(jié)果可知，雌二醇處理組的細(xì)胞活力以及侵襲數(shù)目均高于對照組，雌二醇聯(lián)合GRP30-siRNA組的細(xì)胞活力以及侵襲數(shù)目均低于雌二醇處理組。這就說明10-6mol/L的雌二醇能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲，而敲低GRP30能夠逆轉(zhuǎn)雌二醇對細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，由此證實(shí)GRP30是雌激素調(diào)節(jié)ERα-/ERβ-乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制。

綜上所述，雌激素能夠促進(jìn)ERα-/ERβ-乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，受體GPR30可能是雌激素發(fā)揮作用的分子機(jī)制。其作用機(jī)制還有待于更多的臨床研究與基礎(chǔ)研究去證實(shí)。

［1］查中青，元敏，吳巧勝，等.雌激素受體β對于乳腺癌細(xì)胞生長特性及內(nèi)分泌治療的影響.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（31）：18-22

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（潘子昂編輯）

Modulation Effect of Estrogen on Proliferation and Invasion of ERα-/ERβ-Breast Cancer Cells and Its Molecular Mechanisms

CHEN Jian-ping，KANG Kai-fu，ZHOU Yuan-yuan，WU Guo-biao
（Department of Pathology，Shunde First People Hospital，Shunde 528300，China）

Objective To study the modulation effect of estrogen on proliferation and invasion of ERα-/ERβbreast cancer cells and its molecular mechanisms.Methods Breast cancer cell line SK-BR-3（GPR30+，ERα-/ERβ-）were collected for study.The cell line were treated with different concentrations of estradiol，while GPR30 siRNA and negative control siRNA were transfected into cells.After treatment for 24h，cell proliferation and invasion were detected.Results Estradiol treatment can increase cell viability and invasive cells numbers by dose-dependent manner.Transfection of GRP30-siRNA can significantly reduce the content of GPR30 mRNA，inhibition efficiency was 75.42%.Cell viability and invasive cells numbers of estradiol-treated group were higher than that in control group；cell viability and invasive cells numbers of estradiol combined with GRP30-siRNA group were lower than estradiol treated group（P＜0.05）.Conclusion Estrogen can promote ERα-/ ERβ-breast cancer cell proliferation and invasion，estrogen receptor GPR30 may play a role in the molecular mechanism.

Breast cancer； Estrogen； Estrogen receptor； GPR30