黃述婧，婁金麗

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，北京　10009）

·綜 述·

肝癌診斷技術(shù)方法應(yīng)用進(jìn)展

黃述婧，婁金麗

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，北京10009）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種嚴(yán)重威脅著人們健康的肝臟腫瘤，死亡率高居世界前五位，預(yù)后較差，而且有很高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。肝癌的早期診斷有助于病人得到及時(shí)有效的治療，利于后期康復(fù)，所以發(fā)現(xiàn)有效的診斷方法對(duì)于提高病人的生存率十分必要。本文旨在探討目前主要運(yùn)用的肝癌診斷方法，分析各種診斷方法的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì)，為診斷方法的改進(jìn)提供一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為臨床檢驗(yàn)工作人員提供方法學(xué)參考，對(duì)于提高肝癌的檢出率有一定的臨床意義。

肝細(xì)胞癌； 診斷； 方法

肝癌作為威脅人們健康的惡性腫瘤，近幾年一直呈高發(fā)趨勢(shì)，國(guó)際癌癥研究中心（IARC）報(bào)道每年全球肝癌死亡人數(shù)男性約50萬(wàn)、女性約20萬(wàn)［1］，我國(guó)是肝癌的高發(fā)國(guó)家，肝癌病死率高居我國(guó)惡性腫瘤病死率第二位［2］。早期肝癌不易診斷，導(dǎo)致很多患者錯(cuò)過(guò)最佳的治療時(shí)期，故很多患者預(yù)后較差，且伴隨著較高的復(fù)發(fā)率，5年復(fù)發(fā)率高達(dá)61.5%［3］，提高早期肝癌檢出率能夠爭(zhēng)取更多的臨床治療時(shí)間，增加病人的治愈率，提高生存率。目前關(guān)于肝癌診斷的方法有很多，除了熟悉的病理學(xué)、影像學(xué)和臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)（如甲胎蛋白AFP檢測(cè)）等方法外，近幾年研發(fā)了很多新的技術(shù)方法，比如基因芯片［4］、蛋白質(zhì)芯片［5］、CD133腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)［6］、微小RNA［7］等技術(shù)手段。本文將對(duì)傳統(tǒng)的和新發(fā)現(xiàn)的肝癌診斷方法做一系統(tǒng)的介紹。

1 病理學(xué)方法

肝組織穿刺活檢肝組織穿刺活檢（肝穿），是目前診斷肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)。肝穿一般需要在影像學(xué)方法的輔助下進(jìn)行，先確定最佳穿刺位置，再通過(guò)穿刺針快速吸取非常少量的肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，從而確定肝癌細(xì)胞的存在及其分化程度。肝穿病理診斷有較高的準(zhǔn)確率，能夠鑒別肝臟細(xì)胞是否癌變、肝癌的活動(dòng)性、是原發(fā)性的還是繼發(fā)性的，肝穿結(jié)果是肝癌病變分期的重要依據(jù)，同時(shí)肝穿還可以用于肝癌手術(shù)恢復(fù)期效果的評(píng)價(jià)［8］。但肝穿的缺點(diǎn)也十分明顯，是一種有創(chuàng)性的檢查手段，病人不容易接受，同時(shí)凝血紊亂和高血壓的病人不適用。對(duì)于早期肝癌的診斷靈敏度不夠高，如果肝癌范圍較小，可能穿刺不到，導(dǎo)致漏診，但與影像學(xué)結(jié)合檢測(cè)會(huì)大大提高診斷率［9］。

DOI：10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.04.032

收稿日期：2015-11-16；修回日期：2016-03-03

基金項(xiàng)目：中美英聯(lián)合乙肝相關(guān)肝癌早期診斷分子標(biāo)志物篩查及免疫機(jī)制研究（國(guó)家國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目）2012DFA30850

作者簡(jiǎn)介：黃述婧，女，在讀碩士研究生

通訊作者：婁金麗

2 細(xì)胞學(xué)方法

2.1腹水肝癌細(xì)胞檢測(cè) 肝腹水中存在一定數(shù)量的脫落肝癌細(xì)胞，抽取肝癌患者腹水進(jìn)行Giemsa、HE等細(xì)胞化學(xué)染色，可以有效地鑒別肝癌細(xì)胞，從而診斷肝癌。在早期腫瘤階段，影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)不了典型的臨床病變，但是腫瘤細(xì)胞由于其細(xì)胞間粘附力低，容易脫落，所以細(xì)胞學(xué)檢查可以做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷，由于方法簡(jiǎn)便、價(jià)格經(jīng)濟(jì)，可以作為腫瘤篩查的手段。但某些良性細(xì)胞發(fā)生異型性改變時(shí)使用此方法易誤診為癌細(xì)胞，另外還有取樣不當(dāng)、檢查費(fèi)時(shí)、容易漏診、難以對(duì)腫瘤進(jìn)行定位、抽腹水過(guò)程痛苦等缺點(diǎn)，所以此方法較少使用［10］。

2.2循環(huán)肝癌細(xì)胞檢測(cè) 循環(huán)肝癌細(xì)胞指從原發(fā)性肝癌病灶脫落，進(jìn)入外周血循環(huán)系統(tǒng)，定植到新的組織器官形成轉(zhuǎn)移灶。用于循環(huán)肝癌細(xì)胞檢測(cè)的系統(tǒng)目前只有Veridex公司推出的Cell Search系統(tǒng)，這是唯一一家被FDA批準(zhǔn)上市的可做該系統(tǒng)的公司。其原理為使用一個(gè)錨定單抗的磁珠來(lái)吸附循環(huán)肝癌細(xì)胞，然后對(duì)其進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞化學(xué)染色分析并進(jìn)行診斷［11］。Cell Search系統(tǒng)有較好的特異性，能夠從上億的細(xì)胞中吸附單一的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，精準(zhǔn)度很高，每個(gè)標(biāo)本約耗時(shí)10min，適用于檢驗(yàn)科快速診斷。有文獻(xiàn)報(bào)道一些循環(huán)腫瘤細(xì)胞不表達(dá)相應(yīng)的配體（EpCAM），所以吸附率較低，易出現(xiàn)漏診［12］。這個(gè)系統(tǒng)在2009年發(fā)明，目前其實(shí)際效果還有待于臨床檢驗(yàn)，但值得我們期待。

3 血清生化檢測(cè)方法

3.1甲胎蛋白法 甲胎蛋白（AFP）是目前臨床應(yīng)用最廣的肝癌血清學(xué)標(biāo)志物。AFP在正常肝臟中的表達(dá)量極低，小于20ng/mL，肝細(xì)胞癌變之后AFP表達(dá)量會(huì)顯著增加。由于AFP的表達(dá)也會(huì)受到肝炎、腹膜炎等疾病的影響，而且有10%肝癌患者AFP表達(dá)量也不升高，所以單獨(dú)的AFP檢測(cè)確診肝癌的特異度都不高，約70%，AFP一般聯(lián)合其他的方法檢測(cè)早期肝癌［13］。目前對(duì)于AFP檢測(cè)常用的方法為放射性免疫法（RIA）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、膠體金免疫層析法（CIA）。RIA具有放射性，但是精確度高；ELISA耗時(shí)長(zhǎng)，精確度不高；CIA試劑盒擁有快速、簡(jiǎn)便和較高的特異性，可以用于人群篩查。巖藻糖基化甲胎蛋白（AFP-L3）在2005年成為了FDA批準(zhǔn)的唯一肝癌診斷標(biāo)志物［14］，更適合肝癌的診斷，但是檢測(cè)方法還需改進(jìn)與發(fā)展。

3.2高爾基體蛋白73 高爾基體蛋白73 （GP73）是高爾基體膜上的整合蛋白，在病理狀況下其脫落進(jìn)入血清，Marrero［15］研究發(fā)現(xiàn)在肝癌患者血清中，GP73表達(dá)量明顯高于肝硬化患者和正常人群，其檢測(cè)肝癌的特異度為69%，靈敏度為75%，這已經(jīng)和AFP相當(dāng)，是一個(gè)非常重要而且敏感的肝癌血清學(xué)標(biāo)志物。目前已經(jīng)研發(fā)出用于GP73快速診斷的酶聯(lián)免疫試劑盒，具有經(jīng)濟(jì)、方便、利于大規(guī)模篩查的優(yōu)點(diǎn)，使得GP73的實(shí)驗(yàn)室快速診斷成為現(xiàn)實(shí)［16］。但是GP73屬于新發(fā)現(xiàn)的血清標(biāo)志物，其臨床診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)還有待于后續(xù)的研究來(lái)驗(yàn)證。

3.3α-L-巖藻糖苷酶 α-L-巖藻糖苷酶（AFU）自上世紀(jì)80年代就被發(fā)現(xiàn)并廣泛的運(yùn)用于臨床檢驗(yàn)中，是診斷肝癌的敏感血清學(xué)指標(biāo)之一，其常與AFP聯(lián)合診斷［17］。AFU的活性容易受到標(biāo)本存放時(shí)間的影響，非肝癌的肝損傷也會(huì)造成血清中AFU的升高，所以特異性會(huì)降低。但是其可以作為早期篩查的一個(gè)指標(biāo)，作為其他標(biāo)志物的一個(gè)有效補(bǔ)充。

3.4γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-GT）是肝損傷較為靈敏的指標(biāo)，γ-GT主要分布在肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞內(nèi)，正常人體內(nèi)水平很低。肝細(xì)胞癌變時(shí)，癌細(xì)胞會(huì)逆向分化，具有胚胎期的特征，所以導(dǎo)致γ-GT合成增加，分泌到血清中，故血清γ-GT也明顯升高，臨床上常把γ-GT作為慢性肝炎伴肝硬化轉(zhuǎn)為肝癌和肝癌復(fù)發(fā)的參考指標(biāo)［18］。γ-GT在檢測(cè)肝損傷方面靈敏度不及ALT，但是可以鑒別膽管是否癌變。γ-GT檢測(cè)容易受到酒精、慢性肝炎的影響，所以其特異性有待于提高，目前作為肝癌診斷的主要輔助指標(biāo)。

3.5血清異常凝血酶原 血清異常凝血酶原又稱(chēng)維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)（protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ），也被稱(chēng)為脫-γ-羧基凝血酶原（Desγ-carboxy-prothrombin，DCP）PIVKA-II在肝細(xì)胞癌患者中可出現(xiàn)特異性上升，且血清中PIVKA-II水平與AFP水平無(wú)相關(guān)性，對(duì)AFP假陰性肝癌的診斷有一定的價(jià)值，可與AFP進(jìn)行互補(bǔ)，聯(lián)合使用PIVKA-Ⅱ和AFP檢測(cè)可增加肝癌診斷的靈敏度［19］。同時(shí)，PIVKA-II還可作為監(jiān)測(cè)肝癌預(yù)后的標(biāo)記物［20］，幫助辨別具有高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)或生存期短的肝癌患者，以便及時(shí)采取積極的治療手段達(dá)到延長(zhǎng)患者生存期的目的。但值得注意的是PIVKA-II有假陽(yáng)性反應(yīng)，患者維生素K缺乏或者應(yīng)用維生素K抑制劑，由抗生素引起的腸道正常菌群的抑制，均可導(dǎo)致PIVKA-II值升高，此外也有HCC以外的腫瘤（如胃癌等消化系統(tǒng)腫瘤）引起PIVKA-II值增高的報(bào)道［21］。

4 新技術(shù)與新指標(biāo)

4.1基因芯片 基因芯片是人類(lèi)基因組計(jì)劃的產(chǎn)物，是先進(jìn)技術(shù)的代表。將大量的基因探針固定在硅片等支持物上，然后與樣品中待檢基因進(jìn)行雜交，從而檢測(cè)樣品中是否含有待檢目的基因。作為基因分析工具，具有高通量、低樣本、高效率等特點(diǎn)［22］，適用于早期肝癌相關(guān)基因的大范圍篩查，突破了單個(gè)基因不敏感的局限，具有廣闊的應(yīng)用前景。但是目前發(fā)現(xiàn)的肝癌相關(guān)基因還太少，隨著更多肝癌相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，基因芯片對(duì)于肝癌的早期診斷率會(huì)有所提高。

4.2蛋白質(zhì)芯片 目前最主要的蛋白質(zhì)芯片為表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（SELDI-TOF-MS），此技術(shù)在2002獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。SELDI-TOF-MS能夠發(fā)現(xiàn)與肝癌細(xì)胞相關(guān)的重要蛋白，可以用于肝癌的診斷和療效監(jiān)測(cè)。該方法具有樣本需求量低、檢測(cè)速度快、檢測(cè)蛋白分子量廣、高通量等優(yōu)點(diǎn)，目前有條件的醫(yī)院已經(jīng)把此方法應(yīng)用于乳腺癌、前列腺癌的檢測(cè)，并且擁有80%～90%的檢出率［23］。Petricoin［24］使用SELDI技術(shù)在血清中篩選出了卵巢癌特異性指標(biāo)，已經(jīng)獲FDA批準(zhǔn)用于臨床，這一技術(shù)在肝癌相關(guān)蛋白的篩查中也已經(jīng)有所運(yùn)用［25］。但是這一技術(shù)目前價(jià)格昂貴，臨床檢查效果也有待于驗(yàn)證，尚不適用于臨床推廣。

4.3肝癌相關(guān)基因檢測(cè) 目前發(fā)現(xiàn)的肝癌相關(guān)基因有米托蒽醌抗性基因（MXR7）、人類(lèi)印跡基因（DLKl）、高爾基體蛋白73基因（GP73）、肝癌相關(guān)基因（HTA）等，這些基因都能夠在一定程度上提示肝癌的發(fā)生，GP73研究較多，已經(jīng)有了一定的應(yīng)用?；驒z測(cè)方法有RT-PCR、二代測(cè)序、基因芯片、基因表達(dá)分析、比較基因組雜交等，隨著這些高新技術(shù)的發(fā)展，不久的將來(lái)就會(huì)推向臨床應(yīng)用，同時(shí)隨著更多的與肝癌相關(guān)基因被深入研究、分析鑒定，肝癌的早期診斷就會(huì)變得更加容易。

4.4分子標(biāo)志物檢測(cè) CD133是新發(fā)現(xiàn)的一種肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物，在肝癌干細(xì)胞表面高表達(dá)，可以對(duì)肝癌進(jìn)行檢測(cè)，肝癌細(xì)胞主要是從CD133+的肝癌干細(xì)胞分化而來(lái)，所以CD133對(duì)于早期肝癌的診斷具有很大的優(yōu)勢(shì)，但是肝癌干細(xì)胞數(shù)量較少，不易檢測(cè)，所以提高CD133最低檢測(cè)限是此指標(biāo)推廣使用的關(guān)鍵［26］，其他的相關(guān)標(biāo)志物還有CD90、CD44等。同時(shí)microRNA在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)譜具有一定的特征［27］，利用表達(dá)譜的不同對(duì)肝癌進(jìn)行早期診斷也有了一定進(jìn)展，主要方法為qRTPCR，由于microRNA在肝癌表面標(biāo)志物和血清標(biāo)志物出現(xiàn)之前就發(fā)生了變化，所以能夠?qū)υ缙诟伟┰\斷提供幫助。

5 結(jié)語(yǔ)及展望

肝癌的診斷對(duì)于其治療與預(yù)后都起著重要作用，目前對(duì)于肝癌的早期檢測(cè)方法有很多，但是都存在著不足，多種方法的聯(lián)合診斷有利于提高早期肝癌的檢出率。本文對(duì)肝癌診斷傳統(tǒng)方法（病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、影像學(xué)、血清學(xué)）和新技術(shù)（基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、新標(biāo)志物檢測(cè)）的應(yīng)用進(jìn)行了分析，以期能夠?qū)εR床醫(yī)生選擇檢測(cè)方法提供一定的幫助。

［1］Su C H，Lin Y，Cai L.Genetic factors，viral infection，other factors and liver cancer：an update on current progress.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（9）：4953-4960.

［2］龔新雷，秦叔逵.系統(tǒng)化療治療晚期肝細(xì)胞癌的現(xiàn)狀和研究進(jìn)展.中國(guó)新藥雜志，2014，23（17）：2008-2017.

［3］Xu Y，Sun H C，Tian B，et al.Establishment of green fluorescent protein-expressing hepatocellular carcinoma cell lines with different metastatic potential：relevant models for in vivo monitoring of metastasis and angiogenesis.J Cancer Res Clin Oncol，2004，130 （7）：375-382.

［4］Liu J，Zhang Q，Li Z，et al.［Predication analysis of microarray data to determine altered gene profiles in liver carcinoma related to HBV-related cirrhosis］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2014，22（8）：625-630.

［5］Paradis V，Degos F，Dargere D，et al.Identification of a new marker of hepatocellular carcinoma by serum protein profiling of patients with chronic liver diseases.Hepatology，2005，41（1）：40-47.

［6］Chan A W，Tong J H，Chan S L，et al.Expression of stemness markers（CD133 and EpCAM）in prognostication of hepatocellular carcinoma.Histopathology，2014，64（7）：935-950.

［7］Wang D，Tan J，Xu Y，et al.Identification of MicroRNAs and target genes involvement in hepatocellular carcinoma with microarray data. Hepatogastroenterology，2015，62（138）：378-382.

［8］Rochey D C，Caldwell S H，Goodman Z D，et al.Liver biopsy. Hepatology，2009，49（3）：1017-1044.

［9］叢文銘.肝臟穿刺活檢診斷臨床病理學(xué)要?jiǎng)t.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，28（4）：359-361.

［10］王桂榮.實(shí)驗(yàn)室診斷原發(fā)性肝癌幾種方法的比較與評(píng)價(jià).中國(guó)民康醫(yī)學(xué)，2008，20（8）：724.

［11］Hu B，Yang X R，Xu Y，et al.Systemic immune-inflammation index predictsprognosisofpatientsaftercurativeresectionfor hepatocellular carcinoma.ClinCancerRes，2014，20（23）：6212-6222.

［12］Kaifi J T，Kunkel M，Dicher D T，et al.Circulating tumor cell levels are elevated in colorectal cancer patients with high tumor burden in the liver.Cancer Biol Ther，2015，16（5）：690-698.

［13］徐海峰，楊華瑜，張宏冰，等.改變肝癌早期診斷和治療現(xiàn)狀的新肝癌血清標(biāo)志物.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，28（01）：104-108.

［14］Wong R J，Ahmed A，Gish R G.Elevated alpha-fetoprotein：differential diagnosis-hepatocellular carcinoma and other disorders. Clin Liver Dis，2015，19（2）：309-323.

［15］Marrero J A，Romano P R，Nikolaeva O，et al.GP73，a resident Golgi glycoprotein，is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma.J Hepatol，2005，43（6）：1007-1012.

［16］Li Q W，Chen H B，Li Z Y，et al.Preparation and characterization of anti-GP73 monoclonal antibodies anddevelopment of doubleantibody sandwich ELISA.Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（5）：2043-2039.

［17］Bertino G，Ardiri A，Malaguarnera M，et al.Hepatocellualar carcinoma serum markers.Semin Oncol，2012，39（4）：410-433.

［18］Song P，Inagaki Y，Wang Z，et al.High Levels of Gamma-Glutamyl Transferase and Indocyanine Green Retention Rate at 15 min as Preoperative Predictors of Tumor Recurrence in Patients With HepatocellularCarcinoma.Medicine（Baltimore），2015，94 （21）：e810.

［19］Ertle J M，Heider D，Wichert M，et al.A combination of alphafetoprotein and des-gamma-carboxy prothrombin is superior in detection of hepatocellular carcinoma.Digestion，2013，87（2）：121-131.

［20］Wang B L，Tan Q W，Gao X H，et al.Elevated PIVKA-II is associated with early recurrence and poor prognosis in BCLC 0-A hepatocellular carcinomas.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（16）：6673-6678.

［21］Takano S，HondaI，WatanabeS，etal.PIVKA-II-producing advanced gastric cancer.Int J Clin Oncol，2004，9（4）：330-333.

［22］Miura N，Maeda Y，Kabe T，et al.Serum human telomerase reverse transcriptase messengerRNAasanoveltumormarkerfor hepatocellular carcinoma.ClinCancerRes，2005，11（9）：3205-3209.

［23］張輝，孔北華，曲迅.表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在卵巢癌中的應(yīng)用.國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2006，33（3）：225-228.

［24］Petricoin E F，Ardekani A M，Hitt B A，et al.Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer.Lancet，2002，359 （9306）：572-577.

［25］Liu Y，Sogawa K，Sunaga M，et al.Increased concentrations of apo A-I and apo A-II fragments in the serum of patients with hepatocellular carcinoma by magnetic beads-assisted MALDI-TOF mass spectrometry.Am J Clin Pathol，2014，141（1）：52-61.

［26］Feng D，Wang N，Hu J，et al.Surface markers of hepatocellular cancer stem cells and their clinical potential.Neoplasma，2014，61 （5）：505-513.

［27］Boye A，Yang Y.Hepatic microRNA orchestra：a new diagnostic，prognostic and theranostic tool for hepatocarcinogenesis.Mini Rev Med Chem，2014，14（10）：837-852.

（檀葉青編輯）

Progress of the Diagnosis Methods for Hepatocellular Carcinoma

HUANG Shu-jing，LOU Jin-li
（Department of Clinical Laboratory，Beijing You’an Hospital of Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Hepatocellular carcinoma（HCC）is one type of liver tumor with mortality at top 5 in the world，poor prognosis and high risk of relapse，which threatens people’s health seriously.The early diagnosis of HCC contributes to effective treatment and recovery of patients.It is necessary to develop effective diagnosis methods to enhance the patient’s survival.Here we summarized the primary diagnosis methods of HCC at present and analyzed the advantages or disadvantages of these methods in order to provide theoretical basis for the improvement of diagnosis methods and methodology reference for clinical laboratories.We hope the study provides insightinto the better methods of increasing the detection rates of HCC.

Hepatocellular carcinoma； Diagnosis； Methods