李 慧，黃祥磊，劉 妍

（徐州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇　徐州　221009）

GP73聯(lián)合其他腫瘤標(biāo)志物檢測對AFP陰性原發(fā)性肝細(xì)胞癌臨床診斷價(jià)值

李 慧，黃祥磊，劉 妍

（徐州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇徐州221009）

目的 早期原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者中80%患者的AFP腫瘤標(biāo)志物檢測結(jié)果為陰性，本研究探討對于AFP陰性的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者采用聯(lián)合檢查血清高爾基體糖蛋白73（GP73）、扁豆凝集素結(jié)合型甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP-L3）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）、脫-γ-羧基凝血酶原（DCP）、CA19-9、鐵蛋白（FER）以及癌胚抗原（CEA）的臨床意義。方法 選取50例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者（A組）、60例消化系統(tǒng)異常的非原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者（B組）和40例健康人群（C組）納入本研究。采用酶聯(lián)免疫分析方法測定血清中GP73、GPC3和DCP含量，采用微量離心柱分離血清AFP-L3，采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測血清CA19-9、FER、CEA、AFP-L3以及總AFP，計(jì)算AFP-L3所占比例（AFP-L3/總AFP）。結(jié)果 三組中除FER以外的各項(xiàng)指標(biāo)差異均極顯著（P＜0.01），原發(fā)性肝細(xì)胞癌組患者的7種腫瘤標(biāo)志物的陽性率均顯著高于其他兩組（P＜0.01），各單項(xiàng)檢測中，GP73的靈敏度、準(zhǔn)確度以及ROC曲線面積最大，分別為72.0%、86.7%和0.826，GPC3的檢測特異性最高為98.0%。結(jié)合7種腫瘤標(biāo)志物檢測的臨床敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和ROC曲線面積分別為82.0%、95. 0%、90.1%和0.884。結(jié)論 GP73和AFP-L3是AFP陰性原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者臨床診斷的首選腫瘤標(biāo)志物，臨床上采用多種腫瘤標(biāo)志物檢測能顯著提高診斷準(zhǔn)確率。

原發(fā)性肝細(xì)胞癌； 腫瘤標(biāo)志物； 聯(lián)合檢測； 臨床診斷

DOI：10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.04.012

收稿日期：2015-10-20；修回日期：2015-11-23

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）的發(fā)病率在常見癌癥中排第五，在全球癌癥導(dǎo)致死亡的各種疾病中死亡率排第三，并且其發(fā)病率在世界不同地區(qū)都呈現(xiàn)出增加的趨勢［1-2］。早期診斷是治療的關(guān)鍵在臨床上已形成其診治的基本共識。甲胎蛋白（alpha feto protein，AFP）是肝癌診斷最實(shí)用的血清標(biāo)志物，然而，由于其檢測的靈敏性和特異性較低，導(dǎo)致臨床診斷的準(zhǔn)確率不能令人滿意，特別是對于腫瘤病灶較小的患者［3-4］。近些年來，研究表明高爾基體糖蛋白73（golgi glycoprotein 73，GP73）、扁豆凝集素結(jié)合型甲胎蛋白異質(zhì)體（AFPL3）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）、脫-γ-羧基凝血酶原（DCP）是原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者早期診斷的潛在癌癥生物標(biāo)志物［5-6］。原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清GP73顯著升高，可能超越AFP成為該疾病早期診斷的標(biāo)志物［7］。然而，有報(bào)道顯示與AFP相比，GP73作為腫瘤標(biāo)志物在原發(fā)性肝細(xì)胞癌臨床檢測的敏感性和特異性方面差異并不顯著［8］。AFP-L3僅存在于肝癌細(xì)胞中，先前的研究表明采用AFP-L3進(jìn)行原發(fā)性肝細(xì)胞癌診斷時(shí)，敏感性和特異性分別為72.3%和97.2%［9］，AFP-L3可以作為臨床疾病惡性程度、臨床治療效果以及疾病發(fā)展進(jìn)行判斷的生物標(biāo)志物，尤其是疾病早期、AFP含量低以及腫瘤病灶較小的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者［10］。DCP和GPC3在肝癌的早期診斷和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的診斷方面具有明確意義，但其效果并不優(yōu)于AFP［11］。顯然，上述各種血清標(biāo)志物在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的診斷中，都存在各種不同的局限性。本研究探討對于AFP陰性的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者采用聯(lián)合檢查血清GP73、AFP-L3、GPC3、DCP、CA19-9、FER以及CEA的臨床意義。

材料和方法

1 一般資料

本研究共采集150份樣品（來自我院消化內(nèi)科2010年03月至2015年08月就診患者或體檢人員），其中原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者50例（A組），消化系統(tǒng)異常的非原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者60例（B組）和健康人群40例（C組），A組中男性36例，女性14例，年齡在32至81歲，平均年齡為56.0±5.2歲，診斷結(jié)果均為單一病灶，且直徑≤3cm，未表現(xiàn)出血管侵入或轉(zhuǎn)移，AFP水平均低于8.98μg/L（即AFP陰性）。B組中男性40例，女性20例，年齡在36至81歲，平均年齡為57.0±5.0歲，其中肝炎患者20例，慢性間質(zhì)性肝炎患者20例，消化系統(tǒng)惡性腫瘤（非肝癌）患者20例。此外，C組中男性22例，女性18例，年齡在35至80歲，平均年齡為54.0±5.1歲，均采用通用的生物化學(xué)或免疫學(xué)方法檢測排除肝炎、肝硬化、肝或膽囊囊腫、良性和惡性腫瘤或者其他臨床疾病。三組在性別、年齡等方面差異不顯著（P＞0.05）。

2 主要儀器與試劑

本研究均采用CODA公司的全自動酶標(biāo)分析儀和羅氏公司的2010型電化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行檢測，GP73、GPC3和DCP的ELISA試劑盒購自上海瑞奇科技有限公司，CA19-9、FER、CEA和AFP檢測試劑盒購自羅氏公司，AFP-L3分離純化試劑盒購自北京熱景生物技術(shù)有限公司。

3 樣本采集及檢測

采用由血液采集管采集的3組空腹靜脈血，4000r/min離心20min，分離血清，置于-80℃?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒的操作說明采用ELISA方法檢測3組GP73、GPC3和DCP，采用微量離心柱分離AFP-L3、CA19-9、FER、CEA、AFP-L3以及總AFP，采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析進(jìn)行定量檢測，計(jì)算AFP-L3所占比例（AFP-L3/總 AFP）。通過 ROC曲線，分析各種標(biāo)志物的95%置信區(qū)間的曲線下面積（AUC）和臨界值，通過單一和聯(lián)合檢測進(jìn)行原發(fā)性肝細(xì)胞癌的診斷。根據(jù)最大敏感性值加特異性值計(jì)算臨界值。

4 診斷結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)以下方法對診斷結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證：根據(jù)各種腫瘤標(biāo)志物的檢測水平對各組檢測者進(jìn)行排序，10例患者為1組。每次每種腫瘤標(biāo)志物隨機(jī)抽取3例作為樣本，即抽去30%的樣本進(jìn)行驗(yàn)證，其余70%樣本進(jìn)行ROC曲線分析。對每一個(gè)生物標(biāo)志物或組合的樣本隨機(jī)重復(fù)抽取5次；所有數(shù)據(jù)采用x±s進(jìn)行敏感性、特異性分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，采集的數(shù)據(jù)符合偏態(tài)分布，故采用四分位數(shù)表示，組間數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis檢測，兩組間比較采用Nemenyi檢測，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，采用Logistic回歸分析，聯(lián)合檢測的模型根據(jù)樣本的ROC分析和線下面積（AUC）建立，用于評估診斷的敏感性和特異性，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 單一血清腫瘤標(biāo)志物比較

除FER以外，各組間血清GP73、AFP-L3（%）、GPC3、DCP、CA19-9和CEA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中A組的水平明顯高于其他兩組（P＜0.01），且B組的各種腫瘤標(biāo)志物水平顯著高于C組（P＜0.05）（見表1）。

表1　三組GP73、AFP-L3（%）、GPC3、DCP、CA19-9、FER和CEA血清水平

2 單一或聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物診斷結(jié)果

采用ROC曲線分析單一或聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物的診斷價(jià)值（圖1、表2）。腫瘤標(biāo)志物GP73、AFP-L3 （%）、GPC3、DCP、CA19-9、FER和CEA的臨界值分別設(shè)定為75.2μg/L、15.1%、30.1μg/L、40.0μg/L、67.7 U/mL、277.3μg/L和2.8μg/L。

A組的GP73、AFP-L3（%）、GPC3、DCP、CA19-9、FER和CEA的陽性率高于B組和C組（P＜0.01）（見表3），各單項(xiàng)檢測中，GP73的靈敏度、準(zhǔn)確度以及ROC曲線面積最大，分別為72.0%、86.7%和0.826，GPC3的檢測特異性最高為98.0%。結(jié)合7種腫瘤標(biāo)志物檢測的臨床敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和ROC曲線面積分別為82.0%、95.0%、90.1%和0.884（見表2和4）。

表2　單一或聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者　ROC分析

表3　各組間GP73、AFP-L3（%）、GPC3、DCP、CA19-9、FER和CEA陽性率比較

表4　單一或聯(lián)合GP73、AFP-L3（%）、GPC3、DCP、CA19-9、FER和CEA作為原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者臨床檢查價(jià)值比較

3 原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者單一和聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物診斷驗(yàn)證結(jié)果

結(jié)果表明單一和聯(lián)合檢測各腫瘤標(biāo)志物的樣本值與驗(yàn)證值一致（見表5）。

表5　原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者單一和聯(lián)合GP73、AFP-L3（%）、GPC3、DCP、CA19-9、FER和CEA診斷驗(yàn)證結(jié)果

討 論

臨床上早期診斷對于原發(fā)性肝細(xì)胞癌的治療十分重要。AFP作為該疾病的常用血清腫瘤標(biāo)志物在靈敏性和特異性方面不盡人意。特別是對于腫瘤病灶較小的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者，其血清AFP的增加不明顯，對于腫瘤直徑大于3cm和小于3cm的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的臨床敏感性分別為52%和25%［3-4］?？傊?lián)合采用多種腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行臨床檢測，其診斷結(jié)果更為準(zhǔn)確。因此，本研究采用新的腫瘤標(biāo)志物并將其聯(lián)合，評價(jià)其對于原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者臨床診斷價(jià)值。

最近幾年，研究發(fā)現(xiàn)GP73、AFP-L3、GPC3和DCP具備作為原發(fā)性肝細(xì)胞癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物潛力［10］。GP73是一種具有400個(gè)氨基酸殘基的穿膜高爾基體糖蛋白［12］。盡管文獻(xiàn)報(bào)道肝炎和脂肪肝患者體內(nèi)GP73的水平遠(yuǎn)低于原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者，多個(gè)學(xué)者文獻(xiàn)指出GP73是原發(fā)性肝細(xì)胞癌最具潛力的幾個(gè)腫瘤標(biāo)志物之一［13-15］。然而，與AFP相比，在原發(fā)性肝細(xì)胞癌診斷方面GP73并未表現(xiàn)出更多的優(yōu)勢［16］。本研究結(jié)果表明，原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的GP73水平和陽性率顯著高于其他疾病患者和健康人群。此外，單獨(dú)采用GP73進(jìn)行疾病診斷的AUC值為0.826，其敏感性和特異性高于其他幾種單一腫瘤標(biāo)志物檢測結(jié)果。這些結(jié)果表明，血清GP73在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者診斷中具有十分重要的意義，且在作為AFP低水平原發(fā)性肝細(xì)胞癌和/或病灶較小的肝癌患者輔助診斷方面具有潛在價(jià)值。

AFP-L3是AFP的一種亞型，并且其所占總AFP的比例已經(jīng)被用于原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的診斷，一些研究表明，原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清AFP-L3含量遠(yuǎn)高于其他慢性肝臟疾病患者，其用于診斷原發(fā)性肝細(xì)胞癌的敏感性和特異性分別為 72.3%和97.2%［9］。另一些研究表明，AFP-L3與肝臟疾病的進(jìn)展、腫瘤的分化程度以及腫瘤的惡性測定密切相關(guān)［7，17］。本研究表明，原發(fā)性肝細(xì)胞癌組患者AFPL3（%）水平和陽性率明顯高于其他兩組，具有較高的敏感性和特異性，其AUC值為0.816。因此，對于原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的診斷，AFP-L3是一種比 AFP更具有潛力的腫瘤標(biāo)志物，特別是對于AFP含量較低或腫瘤病灶較小的原發(fā)性肝細(xì)胞癌。

此外，我們研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝細(xì)胞癌組患者的DCP和GPC3的含量和陽性率顯著高于其他兩組，表明這兩個(gè)指標(biāo)在該疾病的臨床診斷方面有重要的指示作用。但是，這兩種腫瘤標(biāo)志物檢測的敏感性僅分別為56%和52%，低于AFP。目前，對于采用DCP和GPC3作為原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的診斷指標(biāo)仍具有爭議。有報(bào)道稱DCP作為原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的腫瘤標(biāo)志物檢測的敏感性高達(dá)87%［18］，特別適用于患者疾病肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及預(yù)后評價(jià)。GPC3在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)具有較高的特異性和高表達(dá)率（80%）［19］，然而在良性肝臟疾病患者體內(nèi)則相反。CA19-9是消化道系統(tǒng)惡性腫瘤診斷的常用血清腫瘤標(biāo)志物，然而其在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者疾病診斷中的特異性較差［20］。單一檢測CEA或FER對于原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者疾病的診斷都具有十分重要的臨床意義，但是這兩種標(biāo)志物的特異性均較低。

由于上述腫瘤標(biāo)志物在單獨(dú)進(jìn)行原發(fā)性肝細(xì)胞癌疾病診斷過程中存在靈敏性或者特異性的限制，因此需要開展多種腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測。正如本研究所設(shè)想的，通過聯(lián)合檢測7種腫瘤標(biāo)志物，其靈敏性、特異性、準(zhǔn)確率以及AUC高達(dá)82.0%、95.0%、90.1%和0.884。雖然7種標(biāo)志物聯(lián)合檢測的特異性并不是最高，但是已經(jīng)滿足臨床檢查需要，并且診斷結(jié)果也通過交叉驗(yàn)證。本研究采用的臨床樣本容量有限，想要得出更多更加確切的結(jié)論還需要更多的臨床數(shù)據(jù)，對敏感性和特異性進(jìn)行校正。

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（潘子昂編輯）

Significance of Combined Tests of Serum Golgi Glycoprotein 73 and Other Biomarkers in Diagnosis of Small Primary Hepatocellular Carcinoma

LI Hui，HUANG Xiang-lei，LIU Yan
（Clinical Lab Xuzhou Central Hospital，Xuzhou 221009，China）

Objective The most commonly used biomarker AFP is negative in 80%patients with small tumor in the early stage of primary hepatocellular carcinoma（PHC）.To investigate the significance of combined tests of serum golgi glycoprotein 73（GP73），lens culinarisagglutininreactive alpha-fetoprotein（AFP-L3），glypican 3 （GPC3），des-gamma-carboxyprothrombin（DCP），CA19-9，ferritin（FER）and carcinoembryonic antigen（CEA）in diagnosis of small PHC with negative AFP.Methods A total of 50 cases of small PHC，60 cases of non-PHC digestive system disorders and 40 cases of healthy controls were collected.Serum GP73，GPC3 and DCP were analyzed by enzyme-1inked immunosorbent assay（ELISA）.AFP-L3 was separated by microspincolumn；the levels of CA19-9，F(xiàn)ER，CEA，AFP-L3andtotalAFPwerequantifiedbyelectrochemiluminescence immunoassays；percentage of AFP-L3 to total AFP was calculated.Results Levels of all of these biomarkers except FER were significantly different among three groups（P＜0.01）.Positive detection rates of seven biomarkers in PHC were higher than other groups（P＜0.01）.In individual detection，the highest sensitivity，accuracy rate and area under ROC curve were 72.0%，86.7%and 0.826 by GP73.The biomarker with the highest specificity was GPC3，98.0%.In combined detection with these seven biomarkers，the sensitivity，specificity，accuracy rate and area under ROC curve were 82.0%，95.0%，90.1%and 0.884.Conclusion GP73 and AFP-L3 are the better biomarkers to aid the diagnosis of small PHC with negative AFP.The combined detection of biomarkers might improvethe accuracy in diagnosis of small primary hepatocellular carcinoma.

Primary hepatocellular carcinoma； Biomarkers； Combined detection； Diagnosis