苗　麗，張秀平，陳　靜，李　軻，王永杰，白　杰（.河南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，河南鄭州450003；.河南檢驗檢疫鑒定咨詢中心，河南鄭州450003）

肉制品中羊源性成分微滴數(shù)字PCR法定量檢測方法的研究

苗麗1，張秀平2，陳靜2，李軻2，王永杰2，白杰2
（1.河南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，河南鄭州450003；2.河南檢驗檢疫鑒定咨詢中心，河南鄭州450003）

為準(zhǔn)確定量肉及肉制品中羊源性成分的含量，建立了微滴數(shù)字PCR定量檢測系統(tǒng)。結(jié)果顯示在一定范圍內(nèi)羊肉質(zhì)量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數(shù)之間均呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系，選擇DNA含量作為中間換算值，計算出羊肉的質(zhì)量與拷貝數(shù)之間的關(guān)系為M羊=0.03C+0.69。應(yīng)用建立的微滴數(shù)字PCR定量檢測方法對已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的羊肉模擬混合樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)無論在兩兩混合還是多肉樣混合的情況下，其含量偏差最大為1.52%，具有較強(qiáng)的抗干擾能力。通過對市售樣品的檢測，顯示該方法能夠準(zhǔn)確檢測出不同樣品中羊肉的含量，并發(fā)現(xiàn)可能存在摻假現(xiàn)象，說明該檢測方法具有良好的市場應(yīng)用前景。本實驗建立的微滴數(shù)字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分檢測方面具有較大的應(yīng)用潛力，為肉制品日常檢測及是否摻假提供有力的科學(xué)依據(jù)。

微滴數(shù)字PCR，定量，羊源成分，摻雜

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，消費者對食品質(zhì)量與安全的要求也越來越高。瘋牛病、馬肉風(fēng)波等食品安全事件的出現(xiàn)以及宗教、健康和市場監(jiān)管等方面的原因，都急需一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法對肉制品中所含肉源的成分及含量進(jìn)行分析［1］。

近幾年，我國的食品衛(wèi)生面貌雖有了很大改觀，但也有一些不法商販不執(zhí)行食品衛(wèi)生法，在食品中摻假摻雜，用廉價肉代替價格較高的羊肉、牛肉等進(jìn)行銷售，嚴(yán)重?fù)p害了消費者的利益［2］。因此，當(dāng)務(wù)之急是建立有效、快速、定量檢測食品中肉源成分的檢測方法，為質(zhì)檢部門提供可靠的檢驗依據(jù)。

在所有檢測動物源性成分的技術(shù)中，發(fā)展較為完善、靈敏度及準(zhǔn)確度都相對較好的技術(shù)手段是PCR技術(shù)［2-3］。研究者根據(jù)不同物種基因序列的差異，設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而對物種進(jìn)行鑒定或定量分析［4］。但在目前的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或是文獻(xiàn)報道中，使用的檢測方法多是定性檢測肉或肉制品中某種動物源性成分，不能定量的檢測樣品中所含有的肉源成分的含量［5-6］，特別是在一些摻雜使假案件的處理中，如何判定是故意摻假還是生產(chǎn)、取樣過程中污染所致都需要有可靠的定量技術(shù)作為依托。

微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，是將樣本通過微滴發(fā)生器進(jìn)行微滴化處理，生成約20000個微滴后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，使用微滴檢測器對每個微滴逐個檢測，最終經(jīng)分析軟件計算出DNA分子的濃度（copies/μL）。本方法無需依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因，可直接得出DNA拷貝數(shù)，是對起始樣品的絕對定量［7］。因此該技術(shù)廣泛應(yīng)用于物種鑒定［8］、病原檢測［9］、轉(zhuǎn)基因［10-11］及肉源成分檢測［12-13］及基因表達(dá)分析［14］等，具有廣闊的應(yīng)用前景。

Morisset等［10］運用數(shù)字PCR技術(shù)準(zhǔn)確定量轉(zhuǎn)基因中靶基因的拷貝數(shù)，并在低濃度時較qPCR具有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。朱鵬宇等［13］利用微滴數(shù)字PCR檢測食品或飼料樣品，但是沒有建立具體的定量檢測方法。本研究運用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，以DNA含量為中間換算單位，摸索羊肉的質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系，以及DNA含量與拷貝數(shù)之間的關(guān)系，以期建立定量檢測肉制品中羊肉的含量，為質(zhì)檢部門定量檢測肉源成分提供有力科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

生鮮羊肉、牛肉、豬肉、鴨肉和雞肉等肉樣，羊肉卷、小肥羊、羊肉串等羊肉制品購自鄭州某農(nóng)貿(mào)市場；蛋白酶K（20 mg/mL） 購自TAKARA公司；Tris-飽和酚購自索萊寶生物科技有限公司；組織裂解液（1 mol/L Tris-HCL、0.5 mol/L EDTA、10%SDS）、3 mol/L醋酸鈉、氯仿/異戊醇（24∶1）均為自配試劑；羊源性引物和探針由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

Bio-Rad QX200 ddPCR微滴生成儀美國Bio-Rad公司；HermLe Z36HK高速冷凍離心機(jī)HERMLE；DT500電子天平江蘇常熟長青儀器廠；BioSpecnano微量核酸蛋白儀島津企業(yè)管理（中國）有限公司；NTS-4000AM恒溫振蕩水槽Tokyo Tikakikai；Senso Quest LabCycler梯度PCR儀德國Senso公司。

1.2實驗方法

1.2.1肉樣制備取新鮮肉樣的肌肉組織，絞碎后于烤箱中80℃烘干72 h，于組織勻漿機(jī)中進(jìn)行勻質(zhì)處理，作為實驗的標(biāo)準(zhǔn)品［12］，并用于制作模擬混合樣品，勻質(zhì)過程中不同肉類分開處理，防止不同動物組織粉末交叉污染。

1.2.2DNA提取采用苯酚/氯仿法提取基因組DNA［12］。向樣品中加入700 μL組織裂解液和20 μL蛋白酶K（20 mg/mL），渦旋振蕩混勻于56℃水浴2 h，取上清用于苯酚/氯仿核酸提取，最后加入100 μL ddH2O溶解DNA，采用核酸定量儀測定提取肉樣的DNA含量，確保提取DNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3微滴式數(shù)字PCR檢測樣品中羊源性成分羊源性成分的引物和探針序列參考René K?ppel［3］合成，ovine-F：CCAACATGCCTTTAAACCCTCA，ovine-R：GGAACTGTAGCCTTCTGACTCG，ovine-Probe：5’-FAM-TGCCTTTCCTTCCCCGCCAGT CTC-BHQ-3’。

微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系為：ddPCRTM Supermix for Probes（No dUTP）10 μL，上下游引物各1.8 μL （900 nmol/L），探針0.5 μL（250 nmol/L），DNA模板4 μL，用雙蒸水補(bǔ)齊至20 μL。通過微滴發(fā)生器進(jìn)行微滴化處理，生成約20000個微滴后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min；94℃30 s，60℃1 min，98℃10 min，40個循環(huán)。最后用微滴分析器對微滴進(jìn)行分析。

為更好地保護(hù)中國投資者的海外投資利益，且鑒于公司國籍國實施外交保護(hù)的權(quán)威性，中國宜采取的方案是：將“一國對由于損害的原因按照公司國籍國法律終止存在的公司在合理期限內(nèi)未能提供外交保護(hù)”的情形，納入股東國籍國實施外交保護(hù)的范圍。

1.2.4羊肉的質(zhì)量與拷貝數(shù)換算公式的確定

1.2.4.1羊肉的質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系分別稱量10個質(zhì)量梯度的羊肉（質(zhì)量依次為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg）樣品，提取基因組DNA，運用核酸定量測定儀測定DNA含量。每個梯度重復(fù)3次。

1.2.4.2羊肉的DNA含量與拷貝數(shù)的關(guān)系將提取的羊肉樣品的DNA進(jìn)行系列稀釋，以10個濃度梯度的DNA含量（含量依次為25、50、75、100、125、150、175、200、225、250 ng/μL）進(jìn)行微滴數(shù)字PCR的檢測。每個梯度重復(fù)3次。

1.2.5模擬混合肉樣的檢測為驗證所建微滴數(shù)字PCR方法的準(zhǔn)確性以及多種肉樣混合時的抗干擾能力，以總質(zhì)量為50 mg，在羊肉樣品最低含量（10%）時添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的其他肉種，制成多肉樣混合樣品。按1.2.2的方法提取混合肉樣DNA，進(jìn)行10倍稀釋后，取4 μL進(jìn)行微滴數(shù)字PCR檢測。

1.2.6市售樣品的檢測分別從某市場中購買羊肉和羊肉制品（羊肉卷、孜然羊肉、小肥牛、羊肉串等），用建立的微滴數(shù)字PCR定量方法對其羊源性成分的質(zhì)量進(jìn)行分析，進(jìn)一步驗證所建方法的準(zhǔn)確性和實際應(yīng)用能力。

1.2.7數(shù)據(jù)分析所有結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，利用Excel進(jìn)行圖表編輯。

2　結(jié)果與分析

2.1羊源性引物和探針特異性

為驗證本實驗選用的羊源性引物和探針的特異性，選擇常見豬、牛、雞、鴨肉的DNA模板進(jìn)行數(shù)字PCR檢測，以水為空白對照，結(jié)果顯示選取的引物和探針對其他肉樣均無交叉反應(yīng)（圖1），表明引物和探針的特異性良好，能夠用于羊肉含量的檢測。

圖1　羊源性引物和探針體系的特異性檢測Fig.1　The specificity detections of ovine primer-probe system

為摸索不同羊肉質(zhì)量與提取DNA含量的關(guān)系，提取不同質(zhì)量梯度（質(zhì)量依次從5～50 mg）樣品的DNA，運用核酸定量測定儀檢測提取肉樣的DNA含量。通過3次批間重復(fù)，結(jié)果顯示羊肉的質(zhì)量與其所測定的DNA含量之間有明顯的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.9992（圖2）。表明羊肉的質(zhì)量在5～50 mg范圍內(nèi)與DNA含量有明顯的線性關(guān)系。

圖2　羊肉的質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系Fig.2　Linear relationship between meat quantity and nucleic acid content of ovine

2.3DNA含量與拷貝數(shù)的關(guān)系

圖3　不同含量DNA所測得的拷貝數(shù)Fig.3　The DNA copy number of ovine at different nucleic acid content

圖4　羊肉DNA含量與拷貝數(shù)的關(guān)系Fig.4　Linear relationship between nucleic acid content and the DNA copy number of ovine

為摸索羊肉DNA含量與拷貝數(shù)之間的關(guān)系，在數(shù)字PCR檢測最高核酸濃度范圍內(nèi)，將提取的羊肉DNA進(jìn)行10個梯度的系列稀釋（25～250 ng/μL），取4 μL模板進(jìn)行微滴數(shù)字PCR的檢測，以水為空白對照。結(jié)果顯示每個樣品的微滴生成均在15000個以上，滿足了絕對定量的要求，且生成的拷貝數(shù)隨著DNA含量的增加而增加（圖3），兩者之間有明顯的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.9990（圖4）。表明核酸的含量在25～250 ng/μL范圍內(nèi)與拷貝數(shù)呈明顯的線性關(guān)性。

2.4羊肉質(zhì)量與拷貝數(shù)關(guān)系的確定

根據(jù)羊肉的質(zhì)量與DNA含量之間的線性關(guān)系，及DNA含量與拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，選擇DNA含量作為中間換算值，得出羊肉的質(zhì)量與拷貝數(shù)之間的關(guān)系為M羊=0.03C+0.69，其中，C指每微升的拷貝數(shù)（copies/μL），M羊指肉樣的質(zhì)量（mg）。

2.5已知質(zhì)量混合肉樣的微滴數(shù)字PCR抗干擾實驗

為驗證所建方法的準(zhǔn)確性，分別對已知質(zhì)量的混合樣品提取DNA，進(jìn)行10倍稀釋后，取4 μL進(jìn)行數(shù)字PCR檢測，將測得的拷貝數(shù)值代入肉樣質(zhì)量與拷貝數(shù)關(guān)系式中計算原始肉樣質(zhì)量。結(jié)果顯示羊肉的含量在5 mg時，單獨與鴨肉、雞肉、豬肉和牛肉混合時測得的值分別是5.208、5.025、5.265、5.37 mg，與真實值基本一致。且隨著混合肉樣種類的增加，不同混合肉樣之間雖有一定的誤差，但是其含量偏差最大為1.52%，顯示該方法在混合肉樣中基本不受外源肉樣的干擾（表1），表明所建立的微滴數(shù)字PCR方法可以應(yīng)用于不同肉制品中羊源成分的定量檢測。

2.6市售樣品的檢測

市售樣品復(fù)雜多樣，含有多種成分，而DNA的提取過程往往會受到多種因素如組織成分、樣品處理方式等的影響，會使得測得的肉產(chǎn)品的質(zhì)量不能反應(yīng)真實值。因此，為檢測本研究建立的微滴數(shù)字PCR定量方法的市場應(yīng)用能力，針對目標(biāo)成分選取含有羊源成分的食品進(jìn)行檢測。結(jié)果如表2所示，不同的羊肉制品均檢出羊源性成分，并且對其含量進(jìn)行了初步的定量。其中，羊肉串樣品測得的羊源成分較低，而商品配料成分僅顯示羊肉及食品添加劑如食鹽、香精及孜然粉，故其含量低懷疑可能添加其他肉代替羊肉，結(jié)果有待進(jìn)一步驗證。通過一系列的市售食品的定量檢測，驗證了建立的羊源性成分微滴數(shù)字定量PCR檢測體系的實際應(yīng)用能力，可以定量分析市售羊肉制品中羊肉的含量，具有較高的實際應(yīng)用能力。

表1　已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的模擬混合肉樣的數(shù)字PCR定量分析Table 1　The results of quantification PCR samples with known concentrations

表2　市售樣品的數(shù)字PCR定量分析Table 2　The results of quantification PCR samples from the local supermarket

3　結(jié)論與討論

微滴數(shù)字PCR由于其高度的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，通過對陽性微滴進(jìn)行分析，確定DNA的拷貝數(shù)，可以直接對樣品進(jìn)行定量，在肉源成分檢測方面已經(jīng)取得一定的成績［8-12］。

本研究建立的檢測肉制品中羊源性成分微滴數(shù)字PCR定量檢測方法，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得羊肉質(zhì)量與拷貝數(shù)之間的關(guān)系為M羊=0.03C+0.69，因此，可以通過檢測樣品的拷貝數(shù)，直接計算出肉制品中羊源性成分的含量。對模擬混合肉樣的檢測發(fā)現(xiàn)無論在兩兩混合還是多肉樣混合的情況下，其含量偏差最大為1.52%，說明本方法具有較強(qiáng)的抗干擾能力。在對肉及肉制品的檢測中，樣品中的成分往往是多種多樣的，因此本研究對多種市售羊肉樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明本方法不但能夠檢測出不同樣品中羊肉含量，而且還發(fā)現(xiàn)市售樣品存在一定的摻假現(xiàn)象，說明該檢測方法能夠用于日常肉制品中羊源性成分含量的檢測。本實驗建立的微滴數(shù)字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分檢測方面具有較大的應(yīng)用潛力，為肉制品日常檢測及是否摻假提供有力的科學(xué)依據(jù)，是防止商家摻假牟利的有效手段。

本研究方法僅限于對羊源性成分含量的檢測，而市售的摻假肉制品往往不只含有一種肉源成分［15］，單一檢測某種肉樣成分的定量檢測體系不能準(zhǔn)確檢測出每種肉源成分的含量，存在一定的局限性，不能滿足市場中多肉樣定量檢測的需求，因此建立多重肉源成分?jǐn)?shù)字PCR定量檢測方法，達(dá)到一檢多得的目的是今后研究的方向。

綜上所述，本研究建立的羊源性微滴數(shù)字PCR定量檢測體系特異性強(qiáng)、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)，能夠用于肉及肉制品中羊源性成分含量檢測，為質(zhì)監(jiān)部門提供有力的科學(xué)依據(jù)，是防止商家摻假牟利的有效手段。

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Development of quantitative analysis of ovine products by droplet digital PCR

MIAO Li1，ZHANG Xiu-ping2，CHEN Jing2，LI Ke2，WANG Yong-jie2，BAI Jie2
（1.Central Quarantine Laboratory of Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhengzhou 450003，China；2.Identification Consulting Center of Henan Inspection and Quarantine，Zhengzhou 450003，China）

A quantitative method based on the droplet digital polymerase chain reaction（ddPCR）technique was developed to determine the weight of ovine in meat products.By using the ddPCR method，the relationships between the meat weight and DNA weight and between the DNA weight and DNA copy number were both close to linear within the dynamic range.The DNA weight was utilized as an intermediate value to establish the following formulae for calculating the original meat weight from the DNA copy number：Movine=0.03C+0.69.By examining the mixed meat samples of known composition，the final quantitative results were similar to the true meat weights，and the maximum content deviation was 1.52%.Analysis of commercial samples showed that ddPCR quantification system could determine the proportion and quantification of ovine and had a good practicability.Quantitative analysis indicated that ddPCR was highly precise in quantifying ovine in meat products and had the potential to be used in routine analysis and quality meat adulteration of various species.

droplet digital polymerase chain reaction；quantification；ovine products；adulteration

TS251

A

1002-0306（2016）04-0073-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.005

2015－07－28

苗麗（1971-），女，碩士，高級獸醫(yī)師，研究方向：分子生物學(xué)及食品微生物學(xué)。

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2014IK089）。