朱悅紅 徐彬 李光璐 胡肖依 吳憂(yōu)?

姜黃素對(duì)小鼠帕金森病模型行為學(xué)的影響

朱悅紅 徐彬 李光璐 胡肖依 吳憂(yōu)?

目的 探討姜黃素對(duì)C57BL/6小鼠帕金森病模型行為學(xué)的影響及常用行為學(xué)測(cè)試的比較。方法 取30只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分成3組：MPTP模型組、姜黃素治療組和正常對(duì)照組；模型組、姜黃素組采用1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氫吡啶（ MPTP）腹腔注射造模，正常對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。姜黃素組予姜黃素腹腔注射，連續(xù)1周。各組小鼠在最后1次MPTP或0.9%氯化鈉注射液注射后7d予行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果 姜黃素能改善帕金森病模型小鼠行為學(xué)中曠場(chǎng)試驗(yàn)、懸掛試驗(yàn)等相關(guān)指標(biāo)（P＜0.05）。對(duì)爬桿試驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)無(wú)明顯改善作用。結(jié)論 姜黃素可改善帕金森病模型小鼠行為學(xué)變化。爬桿試驗(yàn)、懸掛試驗(yàn)較易受主觀因素影響，曠場(chǎng)試驗(yàn)是更為客觀的檢測(cè)方法。

1-甲基-4-苯基1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP） 帕金森病 姜黃素 行為學(xué)測(cè)試

帕金森病 （PD）是中老年人常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一，已嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康［1］。研究認(rèn)為，路易小體（Lewy bodies）中異常聚集的α-突觸核蛋白（α-Syn）與PD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2，3］。α-Syn寡聚體的形成在PD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［4～6］。姜黃素（curcumin）是一種多酚類(lèi)物質(zhì)，近年來(lái)其生物學(xué)活性受到廣泛關(guān)注［7～9］。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可能通過(guò)誘導(dǎo)自噬繼而促進(jìn)α-Syn的自噬性清除而發(fā)揮對(duì)PD的神經(jīng)保護(hù)作用［10～12］。2015年6月至9月作者通過(guò)試驗(yàn)研究，探討姜黃素治療C57BL/6小鼠帕金森病模型運(yùn)動(dòng)障礙的療效及常用行為學(xué)測(cè)試的比較。

1 材料和方法

1.1 材料 （1） 試驗(yàn)試劑：姜黃素、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）購(gòu)自Sigma公司。（2）試驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)健康C57BL/6小鼠，8～10周齡，18～22g，雄性；飼養(yǎng)條件：清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，正壓屏障系統(tǒng)，動(dòng)物可自由攝食飲水，以上試驗(yàn)動(dòng)物、設(shè)施、飼料等均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。

1.2 方法 （1）分組：將小鼠隨機(jī)分為3組，即MPTP模型組（10只）、姜黃素治療組（10只）和正常對(duì)照組（10只）。（2）MPTP小鼠PD模型建立：MPTP和姜黃素治療組予MPTP腹腔注射30mg/（kg·d），1次/d，一共注射7d，建立亞急性PD模型。正常對(duì)照組予腹腔注射0.9%氯化鈉注射液20ml/（kg·d），1次/d，連續(xù)7d。（3）姜黃素處理：姜黃素治療組在MPTP腹腔注射的同時(shí)予姜黃素（80mg/Kg）腹腔注射，1次/d。（4）行為學(xué)檢測(cè)：各組小鼠在最后1次MPTP 或0.9%氯化鈉注射液注射后7d進(jìn)行行為學(xué)指標(biāo)測(cè)試。

1.3 行為學(xué)測(cè)定指標(biāo)及方法 （1）一般狀態(tài)觀察：觀察小鼠的精神狀態(tài)、姿勢(shì)、皮毛色澤、活動(dòng)度等全身情況。（2）爬桿試驗(yàn)（Pole test）：按文獻(xiàn)方法［13］制作一長(zhǎng)60cm、粗0.8cm光滑不銹鋼桿，桿上纏上紗布以防滑，并將一大小適中的軟木球固定于桿頂端。將小鼠放至小球上，測(cè)定并記錄小鼠整個(gè)爬桿時(shí)間，每只小鼠測(cè)定3次，間隔30 min/次，取平均值［14］。試驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)其進(jìn)行爬桿訓(xùn)練，無(wú)法練習(xí)者予以剔除。（3）懸掛試驗(yàn) （ Traction test ）：根據(jù)Wang W等［15］的試驗(yàn)方法將小鼠的前爪懸掛在一條水平電線(xiàn)上。小鼠若兩只后肢均能抓住電線(xiàn)記為3分，一只后肢能抓住電線(xiàn)記為2分，兩只后肢均不能抓住電線(xiàn)記為1分，計(jì)算每只小鼠得分情況。試驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)其進(jìn)行懸掛訓(xùn)練，無(wú)法練習(xí)者予以剔除。（4）曠場(chǎng)試驗(yàn)（OFT ）：將試驗(yàn)小鼠放在1個(gè)長(zhǎng)寬均為80cm、高40cm、四壁底面為黑色，底面為白線(xiàn)劃分為面積相等的25塊立方形敞箱的安靜環(huán)境中，頂部中央安置攝像機(jī)。沿墻格為外周區(qū)域，其余為中央?yún)^(qū)域。在進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)前，先將各組小鼠放置于測(cè)試試驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境10min，隨后試驗(yàn)操作者將小鼠輕放入曠場(chǎng)箱的中央?yún)^(qū)內(nèi)，開(kāi)始同步計(jì)時(shí)錄像，每只試驗(yàn)小鼠測(cè)定1次，測(cè)定時(shí)間為15min。記錄小鼠的平均速度及運(yùn)動(dòng)總距離。試驗(yàn)均于上午9～12點(diǎn)進(jìn)行［16］，試驗(yàn)前徹底清理上次試驗(yàn)留下的小鼠糞便、尿液等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般形態(tài)觀察結(jié)果 造模前各組小鼠毛色、進(jìn)食等方面均無(wú)明顯差異。造模結(jié)束后模型組小鼠逐步變?yōu)榫氲　⒚l(fā)枯黃散亂、煩躁、易激惹、震顫、運(yùn)動(dòng)減少、步態(tài)不穩(wěn)、豎尾豎毛等表現(xiàn)；與模型組比較，姜黃素組毛色有明顯好轉(zhuǎn)，進(jìn)食可，活動(dòng)頻率增加。

2.2 爬桿試驗(yàn) C57BL/6小鼠在爬桿試驗(yàn)中能夠迅速轉(zhuǎn)向并爬到底端，則耗時(shí)越短，表明運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)能力越強(qiáng)。結(jié)果MPTP模型組、姜黃素組爬桿時(shí)間與正常對(duì)照組比較顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），模型組及治療組未見(jiàn)差異。見(jiàn)表1。

2.3 懸掛試驗(yàn) 將C57BL/6小鼠后爪抓住電線(xiàn)的情況，按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。分值越高，小鼠抓住電線(xiàn)越牢固，表明小鼠肢體運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)情況越好；反之，則表明小鼠震顫、肌強(qiáng)直等情況嚴(yán)重。結(jié)果MPTP模型組、姜黃素治療組與正常對(duì)照組的分值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。姜黃素治療組與MPTP模型組分值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 曠場(chǎng)試驗(yàn) 正常對(duì)照組在曠場(chǎng)試驗(yàn)15min活動(dòng)總距離及行動(dòng)平均速度均明顯大于MPTP模型組和姜黃素治療組（P＜0.01），但姜黃素組與MPTP模型組比較，15min活動(dòng)總距離及平均速度明顯改善（P＜0.01）。見(jiàn)表1。小鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)活動(dòng)軌跡：正常對(duì)照組活動(dòng)的范圍和量遠(yuǎn)高于模型組及治療組，但姜黃素組相對(duì)于MPTP模型組，活動(dòng)的范圍和量明顯提高，進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)增多。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠礦場(chǎng)試驗(yàn)活動(dòng)軌跡

表1 各組小鼠行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表1 各組小鼠行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別爬桿時(shí)間（s）懸掛試驗(yàn)分值曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果活動(dòng)總距離（cm）平均速度（cm/s）姜黃素治療組14.36±0.45*2.3±0.67*△15823.8±987.8**△△17.58±1.09**△△MPTP模型組14.86±0.51*1.5±0. 53**13885.2±987.3**15.43±0.34**正常對(duì)照組12.09±0.313.0±0.0019964.7±1581.322.18±1.76

3 討論

運(yùn)動(dòng)障礙是帕金森病患者的主要臨床表現(xiàn)之一，主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)減少、運(yùn)動(dòng)困難和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力降低。C57BL/6小鼠在注射MPTP后，可以產(chǎn)生與臨床PD患者十分相似的病理及生化改變，明顯誘導(dǎo)出帕金森病的癥狀［16］。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)1周的造模后，模型組小鼠普遍出現(xiàn)震顫、運(yùn)動(dòng)減少、步態(tài)不穩(wěn)、豎尾豎毛等表現(xiàn)，表明MPTP造模小鼠符合帕金森運(yùn)動(dòng)障礙表現(xiàn)。姜黃素組一般狀況明顯好轉(zhuǎn)，表明姜黃素起到干預(yù)調(diào)節(jié)的作用。

爬桿試驗(yàn)是帕金森病模型小鼠運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)中十分常用的方法之一，具有便捷、易操作的特點(diǎn)而被廣泛使用。本資料顯示，模型組及治療組爬桿時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因MPTP損傷使小鼠四肢震顫、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)出現(xiàn)不能抓桿甚至直接落地的現(xiàn)象。部分小鼠在試驗(yàn)中缺乏爬下桿的趨勢(shì)，因而導(dǎo)致爬桿時(shí)間非正常延長(zhǎng)，影響試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。且爬桿法容易受主觀因素（如試驗(yàn)人員的不同）影響，不易進(jìn)行客觀評(píng)分［17］。

懸掛試驗(yàn)主要用于測(cè)試小鼠四肢抓力及協(xié)調(diào)能力，操作性強(qiáng)，評(píng)分較客觀。本資料顯示，MPTP模型組、姜黃素治療組與正常對(duì)照組的分值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明姜黃素可改善帕金森小鼠模型運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。但懸掛試驗(yàn)極易受個(gè)體差異影響，需要擴(kuò)大樣本量才能提高試驗(yàn)的可靠性。

曠場(chǎng)試驗(yàn)是評(píng)價(jià)小鼠在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種常用方法，操作簡(jiǎn)便，方法可靠，且高效客觀［18］。特別是計(jì)算機(jī)技術(shù)和相應(yīng)圖像處理技術(shù)的引入，使動(dòng)物行為分析的檢測(cè)指標(biāo)大為增加［19］。本資料中，MPTP模型組15min運(yùn)動(dòng)總長(zhǎng)度及平均速度比正常對(duì)照組減少，進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)減少，表明小鼠自主活動(dòng)能力和探究能力明顯下降。但姜黃素組情況較之有明顯好轉(zhuǎn)，表明姜黃素能改善小鼠上述行為改變。

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Objective To observe the curative effect of Curcumin on C57BL/6 mice behavioral manifestation in PD models，and to compare three behavioral tests which are often used in PD models. Methods 30 C57BL/6 mice were randomly divided into three groups as control group，MPTP+Curcumin group and model group. Mice in MPTP+Curcumin group and model group received intraperitoneal injection with MPTP to establish PD models，and mice in control group received intraperitoneal injection with the same amount of saline solution for 1 week. Mice in MPTP+Curcumin group received intraperitoneal injection with Curcumin the same time. Animal behavior detections were carried out on the 7th day after injection. Results Curcumin could improve the general condition and behavioral manifestation in open fi eld test and traction test （P＜0.05），while the effect on pole test was not signifi cant. Conclusions This study for behaviors of mice in the three groups further confi rmed that Curcumin could treat PD model mice behavior to some degree. Subjective factor was inclined to be involved in pole test and traction test. Open fi eld test is a more objective ethological method for MPTP model mice of Parkinson's disease.

1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine（MPTP） Parkinson's disease Curcumin Behavioral test

浙江省中醫(yī)藥青年人才基金項(xiàng)目（No. 2015ZQ017）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)（朱悅紅 李光璐 胡肖依）

310005 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 （徐彬 吳憂(yōu)）