瞿　佳, 趙玲俠, 孫曉宇, 陳　銳, 路鵬鵬，沈衛(wèi)榮

(陜西省微生物研究所 微生物資源中心，西安　710043)

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一株抗鉛細(xì)菌的分離鑒定與抗鉛性能研究

瞿佳, 趙玲俠, 孫曉宇, 陳銳, 路鵬鵬，沈衛(wèi)榮

(陜西省微生物研究所 微生物資源中心，西安710043)

為獲得可應(yīng)用于農(nóng)田土壤重金屬污染治理的鉛(Pb)降解功能菌株，從陜西商洛鉛鋅礦區(qū)周邊農(nóng)田土壤中分離篩選出1株抗鉛細(xì)菌，命名為PS8，對其形態(tài)特征、生理生化、16S rDNA同源性及抗鉛性能進行研究。結(jié)果表明，菌株P(guān)S8為革蘭氏陰性細(xì)菌，菌落呈圓形、淡黃色；最適生長溫度為30 ℃，最適pH為7.0；可還原亞硝酸鹽，氧化酶、接觸酶反應(yīng)呈陽性；與糞產(chǎn)堿菌Alcaligenesfaecali高度同源；在Pb2+濃度為0.5和1.0 mmol/L時，去除率分別為99.08% 和97.24%。菌株P(guān)S8對重金屬鉛具有高抗性和較強降解能力，是高效、環(huán)境友好的土壤重金屬鉛污染微生物修復(fù)菌株。

抗鉛微生物；產(chǎn)堿菌；鑒定；抗鉛性能

土壤作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可替代的環(huán)境因子，也是食品安全和人體健康的重要保障。土壤修復(fù)在環(huán)境保護和維持生態(tài)平衡中具有重要作用[1-2]，隨著礦產(chǎn)資源的開發(fā)利用，重金屬污染物通過多種途徑在土壤中積累，使土壤肥力下降，從而降低作物產(chǎn)量及品質(zhì)。因此，重金屬污染土壤的改良和修復(fù)，已成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和土壤改良的研究熱點[3-4]。鉛(Pb)是一種典型的有毒、有害重金屬。近年來，隨著工業(yè)和科技的迅速發(fā)展，大量的鉛被釋放至土壤，造成土壤、水源等污染，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境安全形成極大的潛在威脅[5]。陜西商洛地區(qū)鉛鋅礦產(chǎn)資源豐富，但因前期規(guī)劃布局不合理，大量開采及尾礦處理不當(dāng)，造成嚴(yán)重的土壤重金屬污染和環(huán)境破壞。因此，針對當(dāng)?shù)劂U鋅礦區(qū)土壤和重金屬污染修復(fù)研究迫在眉睫。

目前，國內(nèi)外有關(guān)重金屬耐受性微生物的分離修復(fù)應(yīng)用研究較常見，如Park等[6]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以固定土壤中的鉛；同時，分離自鉛污染水中的耐性菌株還可有效修復(fù)污染水體[7]。因此，利用活體微生物作為生物制劑進行土壤修復(fù)在重金屬土壤污染治理中應(yīng)用前景廣闊[8]。

本研究從陜西商洛某鉛鋅礦區(qū)周邊農(nóng)田土壤中分離獲得1株抗鉛細(xì)菌PS8，根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，初步鑒定為糞產(chǎn)堿菌Alcaligenesfaecalis，命名為AlcaligenesfaecalisPS8。該菌株對鉛的抗性顯著，可有效去除土壤中的鉛離子，是今后農(nóng)田土壤環(huán)境修復(fù)的重要研究材料。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

含鉛土壤樣品采自陜西省商洛市商州區(qū)黑龍口鎮(zhèn)鉛鋅礦區(qū)周邊農(nóng)田，取0～15 cm土樣25 g，裝入無菌樣品袋，帶回室內(nèi)4 ℃保存，備用。

LB培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g，酵母浸粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃、30 min濕熱滅菌；制備固體培養(yǎng)基需加入20 g/L瓊脂；所用試驗材料均購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

重金屬溶液：用去離子水將Pb(NO3)2配制成Pb2+濃度為2.0 mol/L的母液，待用，121 ℃、30 min滅菌[9]。

化學(xué)試劑購于天津天力化學(xué)試劑有限公司，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC15554由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

1.2主要儀器

隔水式培養(yǎng)箱GH500(北京科偉永興儀器有限公司)，搖瓶培養(yǎng)箱TS-2102(上海天呈實驗儀器制造有限公司)，立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50KBS(上海申安醫(yī)療器械廠)，高速冷凍離心機GL-20G-H(上海安亭科學(xué)儀器廠)，722型紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)，原子吸收光譜儀(Thermo Fisher iCE3000)，基因擴增儀(TProfessional Standard Gradient 96)。

1.3抗鉛微生物的分離篩選

取5 g土樣于45 mL生理鹽水，制成土壤懸液。取1 mL土壤懸液加入含2.0 mmol/L Pb2+的液體培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)3 d。取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新鮮含2.0 mmol/L Pb2+的液體培養(yǎng)基，如此轉(zhuǎn)接3次后獲得穩(wěn)定抗鉛微生物，在固體培養(yǎng)基上劃線純化，對分離純化的菌株進行編號。將分離純化的菌株分別劃線于Pb2+濃度為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mmol/L的固體培養(yǎng)基平板，觀察菌落生長狀況。

1.4抗鉛菌株的鑒定

將篩選得到的菌株劃線接種于固體培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)，并進行革蘭氏染色鑒定。

1.5生理生化鑒定

將篩選得到的菌株劃線接種于固體培養(yǎng)基平板，選取28、30、32、35、37、40 ℃作為培養(yǎng)溫度，觀察在不同培養(yǎng)條件下，菌株的最適生長溫度。分別檢測接種于pH為3、4、5、6、7、8、9的液體培養(yǎng)基，經(jīng)30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h的菌液的OD600值。參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》對篩選得到的菌株進行氧化酶、吲哚產(chǎn)生、脲酶、硝酸鹽利用、亞硝酸鹽利用、淀粉酶、明膠液化等試驗[10]，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC15554為對照。

1.6抗鉛細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

參照《分子克隆實驗指南》提取菌株P(guān)S8的基因組DNA[11]。16S rDNA基因 PCR 擴增引物為：27-F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′；1492-R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

基因擴增產(chǎn)物純化后由生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫已有細(xì)菌的16S rDNA序列進行Blast相似性比對分析，通過ClustalX 和 MEGA5 .1軟件的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12]。

1.7不同Pb2+濃度下抗鉛細(xì)菌生長曲線的繪制

選取篩選到的高抗鉛菌株P(guān)S8，將1 mL新鮮菌株種子液接種于100 mL Pb2+濃度分別為0、0.5、1.0 mmol/L的LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min離心，每隔4 h分別測定其OD600值，每組處理設(shè)置3個重復(fù)。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制不同Pb2+濃度菌株P(guān)S8的生長曲線。

1.8抗鉛細(xì)菌PS8去除鉛離子的性能研究

配制Pb2+濃度分別為0.5和1.0 mmol/L 的LB液體培養(yǎng)基，并分別將1 mL新鮮菌株種子液接種于100 mL培養(yǎng)基，對照組不接種菌。搖床培養(yǎng)3 d后，10 000 r/min離心5 min去除菌體，收集上清液，通過原子吸收儀測定樣品中鉛的濃度。每份樣品設(shè)3個重復(fù)。Pb2+去除率(P)計算公式：P= (C0-C)/C0× 100%，式中，C0為原培養(yǎng)液中Pb2+濃度(mmol/L)，C為菌體生長后培養(yǎng)液中Pb2+濃度(mmol/L)。

1.9數(shù)據(jù)處理與分析

采用ClustalX 1.83 和 MEGA5.1軟件進行細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析并構(gòu)建進化樹；采用SPSS 22.0軟件進行去除鉛離子性能分析和統(tǒng)計學(xué)分析；采用Microsoft Excel 2007軟件繪制細(xì)菌生長曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1抗鉛菌株的分離篩選

根據(jù)菌落形態(tài)，在含2.0 mmol/L Pb2+的培養(yǎng)基平板上挑選出生長良好的不同類型細(xì)菌53株。將以上菌株劃線接種于不同濃度梯度的培養(yǎng)基平板，其中能在3.0 mmol/L Pb2+培養(yǎng)基平板上生長的菌株27株，能在4.0 mmol/L Pb2+培養(yǎng)基平板上生長的菌株16株，能在4.5 mmol/L Pb2+培養(yǎng)基平板上生長的菌株8株，能在5.0 mmol/L Pb2+培養(yǎng)基平板上生長的菌株1株，即PS8。因此，選擇菌株P(guān)S8進行下一步研究。

2.2抗鉛菌株的鑒定

經(jīng)鑒定，在LB固體培養(yǎng)基上，PS8菌株菌落呈淡黃色、圓形、較小，表面不光滑，較粘稠，不透明，易挑取，菌落直徑5～10 mm。革蘭氏染色陰性，無芽孢，菌體大小約0.5～1.0 μm，桿狀或圓桿狀。

2.3生理生化特征分析

研究表明，抗鉛菌株P(guān)S8在28～37 ℃均可生長，最適溫度為30 ℃；當(dāng)溫度達(dá)到或超過37 ℃時，出現(xiàn)明顯的生長抑制作用。同時，菌株P(guān)S8在pH為5～9時可正常生長，最適pH為7.0。當(dāng)pH<5時，菌體基本不生長。

以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC15554為對照進行生理生化鑒定試驗。結(jié)果表明，菌株P(guān)S8與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC15554生理生化特性相同：氧化酶反應(yīng)呈陽性，接觸酶反應(yīng)呈陽性，糖發(fā)酵試驗、吲哚檢測試驗、脲酶檢測試驗、V-P試驗、M-R試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗均呈陰性(表1)。

表1　菌株P(guān)S8的生理生化特征

注：+為陽性；-為陰性。

Note：+ Positive；- Negative.

2.4抗鉛菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

將菌株P(guān)S8的16S rDNA 序列(擴增長度為1 411 bp)通過GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列分析和同源性比對，結(jié)果表明，菌株P(guān)S8序列與Alcaligenesfaecalis的16S rDNA序列同源性達(dá)99%(圖1)；結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，將其命名為AlcaligenesfaecalisPS8。序列已提交至 NCBI 的GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KM108309。

2.5不同 Pb2+濃度下菌株的生長曲線

菌株P(guān)S8培養(yǎng)于未加Pb2+的對照組(0 mmol/L Pb2+)時，最大OD600值為1.635；當(dāng)Pb2+濃度分別為 0.5、1 mmol /L時，菌株P(guān)S8生長曲線與對照組基本相同，僅在0～4 h表現(xiàn)出一定程度的延滯，最大OD600值分別為1.384和1.064(圖2)，表明菌株P(guān)S8生長沒有受到Pb2+影響。

2.6菌株鉛去除性能分析

經(jīng)菌株P(guān)S8處理后，Pb2+濃度由0.5和1.0 mmol/L分別降為(4.8±0.65) μmol/L和(27.66±0.41) μmol/L，去除率分別為99.08% 和97.24%，表明菌株P(guān)S8可以顯著去除土壤中的Pb2+。隨著Pb2+濃度的升高，菌株P(guān)S8對Pb2+的去除率呈逐漸下降趨勢，但均高于95%。

圖1　菌株P(guān)S8的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2　不同Pb2+濃度菌株P(guān)S8的生長曲線

3　結(jié)論與討論

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，因農(nóng)田灌溉、化肥農(nóng)藥的大量使用、固體廢棄物污染以及礦山開采等的影響，作為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)載體的土壤受到的重金屬污染日益嚴(yán)重[13]。傳統(tǒng)處理重金屬的方法包括化學(xué)沉淀、離子交換、溶劑提取等，然而這些技術(shù)在修復(fù)土壤重金屬的過程中存在效率低、成本高、易產(chǎn)生二次污染等缺點，不宜作為降解土壤重金屬的長效處理方法[13-14]。研究表明，利用微生物降解土壤中的重金屬離子主要有以下幾種方式：通過吸附作用、富集作用活化重金屬降解[15]；自身代謝產(chǎn)生有機酸、氨基酸、酶絡(luò)合或者氧化還原重金屬礦物、改變重金屬與土壤結(jié)合形態(tài)[16-17]；產(chǎn)生化學(xué)螯合劑、表面活性劑[18-19]，與環(huán)境植物協(xié)同作用[20]等。由于微生物具有生長周期短、繁殖力強、取材簡易等特點，近年來，利用環(huán)境友好型微生物處理土壤重金屬的技術(shù)發(fā)展迅速[21]。因而，有針對性的研究篩選抗重金屬菌種，可以為農(nóng)田土壤環(huán)境重金屬修復(fù)提供重要的試驗材料和理論依據(jù)[14, 22-23]。

本研究從陜西商洛鉛鋅礦區(qū)周邊農(nóng)田土壤中篩選出1株高抗鉛細(xì)菌PS8，該菌適宜生長溫度為28～37 ℃，最適溫度為30 ℃，適宜生長pH為5～9，最適pH為7.0。通過形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定其為糞產(chǎn)堿菌，命名為AlcaligenesfaecalisPS8。該菌株在不同Pb2+濃度下的生長曲線不同，且隨著Pb2+濃度的增大其生長雖受到一定程度的抑制，然而在高濃度Pb2+下，仍能進行正常的新陳代謝活動，表明其具有一定的抗鉛能力。且當(dāng)培養(yǎng)液中加入Pb2+時，菌株的適應(yīng)期延長，該作用與重金屬鉛對微生物的毒害作用有關(guān)[23]。雖然菌株P(guān)S8在生長初期受Pb2+抑制，隨后便表現(xiàn)出一定的耐受適應(yīng)性，穩(wěn)定生長。在液體培養(yǎng)條件下，菌株P(guān)S8對Pb2+具有極強的去除能力，可能是由于菌株細(xì)胞表面存在Pb2+吸附位點或陽離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，重金屬離子可以與菌體表面的轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)螯合降解或富集形成特定形態(tài)的重金屬化合物，使其不會重新被釋放至土壤，隨后可以通過收集菌體、洗滌、解析離心回收重金屬離子[24-25]。同時，也可結(jié)合微生物-植物共存體系，提高根系土壤重金屬富集量，通過植物代謝作用吸收重金屬離子，增加降解效率。

在利用微生物處理土壤重金屬的研究中，因環(huán)境氣候特征、土壤狀況、農(nóng)作物種類等的影響，微生物制劑在不同環(huán)境中降解土壤重金屬的應(yīng)用效力存在一定差異[18,21]。因此，研發(fā)高效、環(huán)境適應(yīng)性強的微生物菌劑并聯(lián)合植物降解土壤重金屬，還有待進一步研究。

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Corresponding authorSHEN Weirong, male, research fellow. Research area: environmental microbiology and applied microbiology. E-mail: shenweirong@21cn.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Isolation, Identification of a Lead-resistant Strain and Effect of Lead Removal

QU Jia, ZHAO Lingxia, SUN Xiaoyu, CHEN Rui,LU Pengpeng and SHEN Weirong

(Microbial Resource Center, Microbiology Insititute of Shaanxi, Xi’an710043, China)

In order to obtain resistant bacteria for removing heavy metal in polluted cultivated field, a lead-resistant strain, named PS8, was isolated from metal-polluted soil in a cultivated field near lead-zinc mining area in Shangluo, Shaanxi province. Based on 16S rDNA sequence analysis, PS8 was highly homologous toAlcaligenesfaecaliby studying the morphological, physiological-biochemical properties, the results showed that PS8 was gram negative, circle-shaped, yellow color and its most suitable growth condition was 30 ℃ pH 7.0. In addition, Nitrite reduction test, oxidase test and catalase test were all positive. The Pb2+removal effect of PS8 was 99.08% and 97.24% respectively in 0.5 mmol/L and 1.0 mmol/L lead concentrations. In conclusion, PS8 is an effective, environmental- friendly strain and have remarkable value to remediate heavy metal contaminated soil.

Lead resistant bacteria;Alcaligenes; Identification; Removal capacity

2016-02-02Returned2016-04-27

Shaanxi Youth Science and Technology Foundation (No. 2014k-34).

QU Jia, female, master,research assistant. Research area: environmental microbiology. E-mail: q_jia@163.com

2016-02-02

2016-04-27

陜西省科學(xué)院青年人才培養(yǎng)專項(2014K-34)。

瞿佳，女，碩士，研究實習(xí)員，從事資源環(huán)境微生物的研究與應(yīng)用工作。E-mail：q_jia@163.com

沈衛(wèi)榮，男，研究員，主要從事微生物菌種選育、發(fā)酵工程等研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)工作。 E-mail：shenweirong@21cn.com

Q939.1；Q789

A

1004-1389(2016)08-1195-06

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-07-14

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160714.1104.024.html