古秋莉，黃聰琳，姜　華甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；甘肅省中醫(yī)藥研究院

鐮形棘豆黃酮苷元對(duì)免疫抑制小鼠非特異免疫功能的影響*

古秋莉1，黃聰琳1，姜華2
1甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅省中醫(yī)藥研究院

目的：探討藏藥鐮形棘豆黃酮苷元對(duì)免疫抑制小鼠非特異性免疫功能的影響。方法：將60只昆明種小鼠隨機(jī)分為6組：正常組，模型組，鐮形棘豆黃酮苷元高、中、低劑量組（336、168、84mg/kg）和鹽酸左旋咪唑組（25mg/kg），每組10只。鐮形棘豆黃酮苷元高、中、低劑量組分別灌胃給予不同劑量的黃酮苷元，正常組和模型組灌服等體積5%吐溫-80溶液，共10天。第8天開始，以注射環(huán)磷酰胺制備免疫低下小鼠模型，除正常組腹腔注射生理鹽水外，其他各組分別腹腔注射環(huán)磷酰胺，共3天。采用巨噬細(xì)胞碳粒廓清實(shí)驗(yàn)、巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、免疫抑制小鼠器官指數(shù)的測定方法，觀察鐮形棘豆黃酮苷元對(duì)免疫抑制小鼠非特異性免疫功能的影響。結(jié)果：與模型組比較，鐮形棘豆黃酮苷元各劑量組能有效提高免疫抑制小鼠的吞噬百分率、廓清指數(shù)（K）和吞噬系數(shù)（α），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），增加免疫器官脾臟和胸腺的器官指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：鐮形棘豆黃酮苷元能夠增強(qiáng)環(huán)磷酰胺所致免疫功能抑制小鼠非特異性免疫功能。

鐮形棘豆；黃酮苷元；非特異性免疫；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；小鼠；環(huán)磷酰胺

鐮形棘豆（Oxytropis falcata B un g e）為豆科棘豆屬植物。具有清熱解毒、生肌愈瘡、澀脈止血、通便之功效，常用于疫癘、黃水病、便秘、炭疽等病的臨床治療。鐮形棘豆主要產(chǎn)于我國的青海、甘肅南部、四川西部?！毒е楸静荨芳啊吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（藏藥）》（第一冊(cè)）［1-2］均有收載。近年來，已有的研究成果表明，鐮形棘豆中黃酮類化合物是鐮形棘豆的主要活性成分之一，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛和提高機(jī)體免疫活性等功效［3-8］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)鐮形棘豆黃酮苷元具有治療慢性支氣管炎的生物活性［9］，有研究［10］報(bào)道了鐮形棘豆黃酮苷元對(duì)慢性氣管炎祛痰作用的良好療效這些生物活性是否與黃酮苷元對(duì)機(jī)體免疫功能有相關(guān)性，目前尚未證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠，觀察了鐮形棘豆黃酮苷元對(duì)受試小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，探討其對(duì)非特異性免疫功能的影響，為進(jìn)一步的藥效研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物鐮形棘豆：采自甘肅省甘南藏族自治州合作地區(qū)，經(jīng)鑒定為鐮形棘豆；鐮形棘豆黃酮苷元：由甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所制備；鹽酸左旋咪唑片（南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：120101）；環(huán)磷酰胺注射液（山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：0412076）。

1.1.2試劑二甲基亞砜（D M S O）（天津馬克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）、印度墨汁、補(bǔ)體（青島綠谷有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20140120）。雞紅細(xì)胞懸液制備：抽取雞血于燒杯中，立即用毛刷攪拌出纖維蛋白，慢慢倒入離心管中，加入生理鹽水搖勻，以1500 r/分鐘離心10分鐘，反復(fù)洗滌3次，用無菌生理鹽水配制成2%雞紅細(xì)胞懸液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3儀器A R II40/C電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司提供），U V-1800紫外可見分光光度計(jì)（日本島津分析儀器公司提供）。

1.1.4動(dòng)物昆明種小鼠，雌雄各半，20～22 g，購于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：S C X K（甘）2009-0004。實(shí)驗(yàn)前，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被分組放入塑料鼠籠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天（溫度23～25℃，濕度50%～60%），喂食普通鼠飼料和蒸餾水。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥取小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、左旋咪唑組、鐮形棘豆黃酮苷元（高、中、低）劑量組，每組10只?？瞻捉M：生理鹽水；模型組：5%吐溫-80溶液；左旋咪唑組：左旋咪唑（25mg/k g）；鐮形棘豆黃酮苷元組分別：336、168、84mg/k g，以5%吐溫-80制成混懸液；各組按劑量灌胃給予相應(yīng)藥物，1次/d，共10天。第8天開始，灌胃后，空白組腹腔注射生理鹽水，其他各組小鼠腹腔注射50mg/（k g·d）環(huán)磷酰胺注射液，1次/d，連續(xù)3天。

1.2.2小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能實(shí)驗(yàn)各組按“1.2.1”項(xiàng)劑量給藥，末次給藥l小時(shí)后，分別由尾靜脈準(zhǔn)確注入用生理鹽水稀釋5倍的印度墨汁10mL/k g，于2分鐘及20分鐘分別自眼眶后靜脈叢取血，吸取20μL，加入到0.1%碳酸鈉溶液2.5mL中，充分混勻，以0.1%碳酸鈉溶液為空白，紫外分光光度計(jì)在680 n m處測定光密度（OD），將采血后的小鼠處死，取其肝臟、脾臟，稱體質(zhì)量。計(jì)算廓清指數(shù)K和吞噬系數(shù)α值。K=（l g OD1-l g OD2）/ （t1-t2），α=K1/3W/W L S。其中W L S為肝脾合重，W為體質(zhì)量，t1、t2為注射墨汁采血后的時(shí)間，OD1、OD2為采血后分別所測的OD值。

1.2.3小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)各組按“1.2.1”項(xiàng)劑量給藥，第3天開始給藥后每只小鼠腹腔注射2%雞紅細(xì)胞懸液1.0 mL，1次/d，連續(xù)5天。末次給藥1小時(shí)后，摘眼球取血，并分離血清，取血清用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋血清1mL加2%雞紅細(xì)胞生理鹽水懸液，與10%補(bǔ)體0.5mL混勻，于37℃孵箱溫育30分鐘后，0℃冰箱終止反應(yīng)。離心，取上清液于分光光度計(jì)540 n m處比色，測定OD值，設(shè)不加血清的空白做對(duì)照，計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬率：

吞噬率（%）=（空白組OD值-吞噬后OD值）/空白組OD值×100%

1.2.4小鼠免疫器官指數(shù)的測定各組按“1.2.1”項(xiàng)劑量給藥，在給藥第 1、2、3、7天，除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射50mL/k g環(huán)磷酰胺注射液，誘導(dǎo)免疫功能低下模型。末次給藥l小時(shí)，稱體質(zhì)量后，脫頸處死大鼠，取胸腺和脾臟，用生理鹽水洗凈，除去筋膜稱體質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

器官指數(shù)=器官質(zhì)量/體質(zhì)量

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用S P SS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)均以（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1對(duì)免疫抑制小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響與空白組比較：模型組，左旋咪唑組，黃酮苷元高、中、低劑量組的廓清指數(shù)和吞噬系數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較：用藥各組廓清指數(shù)和吞噬系數(shù)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但黃酮苷元各組的作用沒有左旋咪唑組強(qiáng)。見表1。

表1　各組小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能測定結(jié)果（±s）

表1　各組小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能測定結(jié)果（±s）

注：*表示與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；△表示與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

組別　只數(shù)　廓清指數(shù)K（1×10-2）　吞噬系數(shù)α空白組　10　7.12±1.84　8.20±0.59模型組　10　3.10±1.21*　5.81±1.14*左旋咪唑組　10　6.62±1.57*△　7.76±0.99*△黃酮苷元高劑量組　10　5.90±0.61*△　7.16±0.94*△黃酮苷元中劑量組　10　5.17±0.90*△　6.82±1.02*△黃酮苷元低劑量組　10　3.94±1.12*△　6.39±0.72*△

2.2對(duì)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率的影響小鼠胃飼各組藥物后，與空白組和模型組比較，各組腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率均明顯提高，黃酮苷元高劑量組明顯高于中、低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　各組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能測定結(jié)果

2.3對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響與空白組比較：除左旋咪唑組外，模型組、黃酮苷元高、中、低劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較：黃酮苷元各組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3　各組小鼠免疫器官指數(shù)測定結(jié)果（±s）

表3　各組小鼠免疫器官指數(shù)測定結(jié)果（±s）

注：*表示與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；△表示與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

組別　只數(shù)　脾臟指數(shù)　胸腺指數(shù)空白組　10　5.92±1.00　5.48±0.80模型組　10　3.49±0.84*　3.24±1.12*左旋咪唑組　10　5.83±1.23△　5.32±0.92*△黃酮苷元高劑量組　10　5.54±1.01*△　4.88±0.82*△黃酮苷元中劑量組　10　4.61±1.16*△　4.13±1.11*△黃酮苷元低劑量組　10　3.98±0.87*△　3.67±1.25*△

3　討論

胸腺和脾臟是人體重要的免疫器官，免疫器官指數(shù)能很好地反映機(jī)體免疫器官的重量變化，且能將個(gè)體差異的影響降低到最低限度，常以藥物對(duì)免疫器官的增重作為衡量其免疫功能強(qiáng)弱的指標(biāo)之一。而網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)是機(jī)體最重要的防御系統(tǒng)，它具有強(qiáng)大而迅速的吞噬廓清異體顆粒和某些可溶性異物的能力，并能迅速清除體內(nèi)自身產(chǎn)生的有害物質(zhì)，在機(jī)體的免疫應(yīng)答中具有重要作用，其功能的強(qiáng)弱可由巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)直接反映。環(huán)磷酰胺為臨床上常用的化療藥物，應(yīng)用后可造成機(jī)體的免疫抑制。此實(shí)驗(yàn)中小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后，模型組與正常組相比，免疫器官各指標(biāo)均顯著降低，反映了免疫功能受到抑制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：鐮形棘豆黃酮苷元具有一定的免疫增強(qiáng)作用，可以促進(jìn)小鼠脾臟及胸腺細(xì)胞的增殖，增加小鼠抗體生成器官脾臟及胸腺的質(zhì)量，提高小鼠的吞噬活性以及吞噬指數(shù)，促進(jìn)小鼠雞紅細(xì)胞免疫后脾細(xì)胞血清溶血素的形成。此外，其免疫功能增強(qiáng)效應(yīng)與劑量呈正相關(guān)。

［1］ 羅達(dá)尚.中華藏本草［M］.北京：民族出版社，1997：139.

［2］ 中華人民共和國藥典委員會(huì).中華人民共和國藥品標(biāo)準(zhǔn)（藏藥）第一冊(cè)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：101.

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［6］ 楊光明，張芳芳，王棟，等.鐮形棘豆對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖及MMP-2表達(dá)的影響［J］.中國中藥雜志，2011，36（9）：1227-1230.

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The Im pactof Flavonoid G lycosides Extracted from LianXing JiDou on Nonspecfic Imm une Function of theM icew ith Imm unodepression

GU Qiuli1，HUANG Conglin1，JIANGHua2
1 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，China；2 Gansu Provincial Academy of Chinese Medicine

Objective：To explore the influence of flavonoid glycosides extracted from Tibetan medicine LianXing JiDou（Oxytropis falcata Bunge）on nonspecific immune function of them ice w ith immunodepression. Methods：Sixtym icewere random ized into six groups：the normalgroup，the controlgroup，high，moderate and low doses groups of flavonoid glycosides extracted from LianXing JiDou（336，168 and 84mg/kg）and levamisole hydrochloride group（25mg/kg），tenmice each group.High，moderate and low doses groups of flavonoid glycosides extracted from LianXing JiDou began to accept intragastric administration of flavonoid glycosides in different doses respectively，the mice in the normal group and the model group were drenched w ith the same amount of 5% tween-80 solutions，for ten days.Themicemodelswith immunodepression were prepared by injecting cyclophosphamide since the eighth day，except the normal group received peritoneal injection of physiological saline，other groups accepted peritoneal injection of cyclophospham ide for three days.The influence of flavonoid glycosides extracted from LianXing JiDou on nonspecific immune function of immunodepressionm icewas observed by adopting macrophage carbon clearance test，macrophage phagocytosis of chicken red blood cells and detecting organ indexes of immunodepressionm ice.Results：Compared w ith themodelgroup，differentdoses groupsof flavonoid glycosides extracted from LianXing JiDou could effectively improve phagocytic percentage，clearance rate index（K）and Phagocytic coefficient（α）the differencehad statisticalmeaning（P＜0.05），increaseorgan indexesof the spleen and thymusgland，and the difference showed statisticalmeaning（P＜0.05）.Conclusion：Flavonoid glycosidesextracted from Tibetan medicine LianXing JiDou could enhance nonspecific immune function of cyclophosphamide-induced immunodepressionmice.

LianXing JiDou；flavonoid glycosides；nonspecific immune function；animalexperiment；themice；cyclophospham ide

R285.5

A

1004-6852（2016）04-0014-03

2015-11-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)81260633）。

古秋莉（1964—），女，副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。