陳　佳，　邵鄰相，　麻艷芳，　張璐敏，　曾　杰

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華　321004）

佛手葉揮發(fā)油誘導HeLa細胞凋亡與壞死*1

陳佳，邵鄰相，麻艷芳，張璐敏，曾杰

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

研究了佛手葉揮發(fā)油對HeLa細胞凋亡與壞死的影響.用單細胞凝膠電泳、DNA梯度電泳檢測DNA損傷，流式細胞術檢測細胞周期和DNA含量的變化，Western Blot檢測凋亡相關蛋白PARP的表達.結果顯示：200μg/m L佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞，彗星頭縮小，熒光強度減弱且染色不均勻，出現(xiàn)彗尾，G2/M期細胞數(shù)量增加，PARP蛋白幾乎全部被切割；400μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞，DNA梯度條帶明顯，表明大多數(shù)細胞處于晚期凋亡階段；800μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞，無大分子條帶，DNA完全斷裂.表明200μg/mL和400μg/mL佛手葉揮發(fā)油可誘導HeLa細胞凋亡，800μg/mL佛手葉揮發(fā)油誘導HeLa細胞壞死.

佛手葉；揮發(fā)油；HeLa細胞；凋亡；壞死

佛手為蕓香科柑桔屬，具有止咳化痰、疏肝理氣、和胃止痛的功效，是我國重要的抗腫瘤中藥［1］.近年來，佛手揮發(fā)油的抗菌消炎作用被廣泛關注.王建英等［2］研究發(fā)現(xiàn)，佛手揮發(fā)油具有抗炎消腫的功效.郭衛(wèi)東等［3］研究表明，佛手揮發(fā)油能有效抑制枯草桿菌、大腸桿菌等的增殖.本實驗室前期研究表明，佛手揮發(fā)油可有效抑制體外培養(yǎng)的MDA-MB-435人乳腺癌細胞增殖并誘導其凋亡［4］.但目前有關佛手葉揮發(fā)油抗腫瘤方面的研究較少.魏玉君等［5］研究發(fā)現(xiàn)，佛手葉揮發(fā)油對Hep3B等6種癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用.本文著重探討了佛手葉揮發(fā)油對HeLa細胞凋亡與壞死的影響，為開發(fā)治療腫瘤的天然藥物提供實驗依據(jù).

1　材料與方法

1.1佛手葉揮發(fā)油的制備

實驗方法參照文獻［6］.

1.2主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為Gibco公司產(chǎn)品；新生牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；溴化乙錠（EB）購于Sigma公司；Caspase-3抗體、PARP抗體、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗均購自Santa Cruz公司.DNA Ladder試劑盒和ECL試劑盒均購于碧云天生物技術有限公司.

1.3細胞培養(yǎng)和細胞活力檢測

實驗方法參照文獻［6］.應用SPSS 19.0軟件計算IC50值，進行細胞活力檢測.

1.4單細胞凝膠電泳檢測DNA損傷

佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞6 h，收集細胞.實驗方法參照文獻［7］.

1.5DNA梯度電泳檢測DNA斷裂

佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞24 h，收集細胞.DNA Ladder試劑盒提取DNA，電泳，拍照.

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡

佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞6 h，收集細胞，預冷的無水乙醇4℃固定過夜，PI（碘化丙啶）染色.流式細胞儀檢測，CELL Quest軟件進行結果分析.

例如，教學《營養(yǎng)要均衡》一課時，以學校中學生身體狀況問卷為基礎，分析描述大部分同學的胖瘦除了遺傳因素以外，飲食是一個重要的因素。教師可要求學生對照均衡膳食“寶塔”并根據(jù)自身的實際情況制定相應的“生活作息表”或者“健康食譜”，選擇食物均衡身體所需要的營養(yǎng)。并嚴格督促學生將自己所制定的健康目標運用到自身實踐之中，這樣不僅能培養(yǎng)學生良好的生活習慣，還能促使學生課外活動以及生活方式都朝著良性健康的方式轉(zhuǎn)變。

1.7Western Blot檢測蛋白表達

佛手葉揮發(fā)油處理24 h，收集細胞，提取總蛋白.SDS（十二烷基硫酸鈉）-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉.一抗、二抗孵育.ECL試劑盒發(fā)光，X-光片曝光，顯影，定影，拍照.

1.8統(tǒng)計分析

應用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05為統(tǒng)計學顯著性差異.

圖1　單細胞凝膠電泳檢測佛手葉揮發(fā)油對HeLa細胞DNA損傷的影響

2　結果

2.1佛手葉揮發(fā)油對HeLa細胞活力的影響

佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞，細胞活力明顯降低.不同劑量的佛手葉揮發(fā)油（31.25，62.50，125.00，250.00，500.00和1 000.00μg/mL）分別處理HeLa細胞6，12和24 h的IC50值依次為146.50，145.84和101.39μg/mL.增殖抑制率隨藥物作用時間的延長和藥物濃度的增加而增大.

2.2佛手葉揮發(fā)油對HeLa細胞DNA損傷的影響

由圖1可見：對照組細胞DNA未損傷，彗星頭為光滑圓形，熒光強度較強，顏色均一；200 μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞，彗星頭明顯縮小，熒光強度較弱，染色不均一，出現(xiàn)彗尾，表明DNA已損傷.

2.3佛手葉揮發(fā)油對HeLa細胞DNA斷裂的影響

由圖2可見：與對照組相比，不同劑量的佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞均出現(xiàn)DNA梯度條帶；400μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理后條帶最明顯，表明多數(shù)細胞發(fā)生晚期細胞凋亡；200μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理后條帶較弱，表明多數(shù)細胞處于中期凋亡階段，少數(shù)細胞進入晚期凋亡階段；800 μg/mL佛手葉揮發(fā)油使大多數(shù)HeLa細胞壞死.

2.4流式細胞儀檢測HeLa細胞凋亡

由圖3可見：對照組細胞存在二倍體和四倍體峰，細胞周期正常；與對照組相比，200μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞，G0/G1期細胞數(shù)量減少，G2/M期細胞數(shù)量增加.表明佛手葉揮發(fā)油將細胞周期停滯于G2/M期，從而誘導細胞凋亡.

圖2　DNA梯度電泳檢測佛手葉揮發(fā)油對HeLa細胞DNA斷裂的影響

圖3　流式細胞儀檢測佛手葉揮發(fā)油對HeLa細胞凋亡的影響

圖4　佛手葉揮發(fā)油對HeLa細胞凋亡相關蛋白PARP表達的影響

2.5Western Blot檢測細胞凋亡相關蛋白的表達

由圖4可見：對照組和陰性對照組，PARP蛋白以116 kDa的形式存在；5-氟尿嘧啶組和200 μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞，PARP蛋白幾乎完全被切割成89 kDa；400μg/mL佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞，PARP蛋白部分被切割成89 kDa.PARP蛋白的切割失活依賴于Caspase-3的激活.由此表明，佛手葉揮發(fā)油誘導HeLa細胞凋亡可能依賴于Caspase介導的PARP途徑.

3　討論

細胞死亡的2種主要方式為細胞凋亡和細胞壞死.多聚ADP核糖聚合酶（PARP）是一種非組蛋白染色體蛋白質(zhì)，具有保持染色體結構完整的功能，在維持基因組穩(wěn)定和細胞死亡過程中發(fā)揮重要的作用.研究表明，當 DNA受損斷裂時，PARP被激活，作為DNA損傷的分子感受器先占據(jù)DNA缺口位點，保護裸露的DNA末端免遭核酸酶水解，此外還引導DNA修復酶與缺口接觸，進行修復［8］.PARP是凋亡過程中Caspase-3和其他半胱氨酸蛋白酶降解的底物，被認為是細胞凋亡的一個早期分子標志.Caspase-3將PARP剪切成24 kD和89 kD兩種片段，繼而PARP的聚ADP和核糖化作用喪失，導致PARP失活，降解核小體DNA，引起凋亡.大量的研究表明，通過刺激Caspase家族激活，從而裂解其底物PARP，導致細胞凋亡［9-10］.

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞，PARP切割失活.彗星電泳出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，DNA Ladder梯度條帶明顯.這與張璐敏等［7］研究野艾蒿揮發(fā)油處理HeLa細胞后的實驗結果相類似.表明佛手葉揮發(fā)油誘導HeLa細胞凋亡的機制可能是依賴Caspase介導的PARP凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑.本實驗中，高劑量（800μg/mL）佛手葉揮發(fā)油處理HeLa細胞，由于大量蛋白質(zhì)外泄，很難從培養(yǎng)基中提取出相關蛋白，因而在Western Blot中未檢測到β-actin和PARP蛋白條帶.

綜上所述，低劑量（200μg/mL）和中劑量（400μg/mL）佛手葉揮發(fā)油誘導HeLa細胞凋亡；高劑量（800μg/mL）佛手葉揮發(fā)油誘導HeLa細胞壞死.

［1］農(nóng)東紅，劉威，韋艷梅，等.不同種質(zhì)佛手五種微量元素含量的比較分析［J］.北方園藝，2012（21）：165-166.

［2］王建英，施長春，朱婉萍，等.金華佛手揮發(fā)油抗炎及急性毒性的實驗研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2004，18（2）：46-48.

［3］郭衛(wèi)東，鄭建樹，鄧剛，等.佛手揮發(fā)油抑菌活性的研究［J］.中國糧油學報，2009（8）：103-107.

［4］麻艷芳，邵鄰相，張均平，等.佛手揮發(fā)油對MDA-MB-435人乳腺癌細胞體外增殖的影響［J］.中國藥學雜志，2010（22）：1737-1741.

［5］魏玉君，邵鄰相，麻艷芳，等.佛手葉揮發(fā)油的成分分析及生物活性研究［J］.浙江師范大學學報：自然科學版，2014，37（3）：329-333.

［6］成文召，麻艷芳，邵鄰相，等.佛手葉揮發(fā)油對HeLa細胞形態(tài)與結構的影響［J］.浙江師范大學學報：自然科學版，2013，36（3）：331-336.

［7］張璐敏，呂學維，邵鄰相，等.野艾蒿揮發(fā)油誘導HeLa細胞凋亡與壞死［J］.中藥材，2013（12）：1988-1992.

［8］王淑榮，申存周.ATP，PARP，Caspase-3與細胞凋亡和脹亡［J］.中國微循環(huán)，2009，13（6）：638-640.

［9］Benchoua A，Couriaud C，Guegan C，etal.Active caspase-8 translocates into the nucleus of apoptotic cells to inactivate poly（ADP-ribose）polymerase-2［J］.JBiol Chem，2002，277（37）：34217-34222.

［10］Guégan C，Sola B.Early and sequential recruitment of apoptotic effectors after focal permanent ischemia in mice［J］.Brain Research，2000，856（1/2）：93-100.

（責任編輯薛榮）

Essential oil from fingered citron leaves induces apoptosis or necrosis of HeLa cells

CHEN Jia， SHAO Linxiang， MA Yanfang， ZHANG Lumin， ZENG Jie
（College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China）

Effects of essential oil from fingered citron leaves on apoptosis or necrosis of HeLa cellswere investigated.DNA damagewas detected by single cell gel electrophoresis and DNA agarose gel electrophoresis，cell cycle and DNA content changes were analyzed by flow cytometry assay，the expression of protein PARP was examined by Western Blot analysis.The results revealed that treated with 200μg/mL essential oil from fingered citron leaves，a comet featurewas showed with a very small head and awide tail，the fluorescence intensity reduced with uneven dying，the quantity of G2/M period cells increased，the cleavage of PARPwas inactived.The DNA-Ladder stripe was the brightest which indicated the high percentage of apoptosis occured in 400μg/mL group.There was no obvious stripe in 800μg/mL group as DNA was badly damaged.The results showed that low dose（200μg/mL）and middle dose（400μg/mL）essential oil from fingered citron leaves could induce apoptosis.However，high dose（800μg/mL）essential oil from fingered citron leaves led to necrosis of HeLa cells.

fingered citron leaves；essential oil；HeLa cells；apoptosis；necrosis

R285

A

1001-5051（2016）02-0215-04

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.02.015

*收文日期：2015-04-27；2015-09-17

浙江省科技廳項目（2008C22023）

陳佳（1991-），女，浙江衢州人，碩士研究生.研究方向：細胞生物學.

邵鄰相.E-mail：shaolinxiang@zjnu.cn