陳果果， 孫梅好

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華　321004）

球形紅細(xì)菌無機(jī)焦磷酸酶的寡聚化及酶活性分析*1

陳果果， 孫梅好

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

球形紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）是一種重要的微生物資源，其無機(jī)焦磷酸酶（PPase）屬于Ⅱ型可溶性焦磷酸酶.通過原核表達(dá)和純化，得到了正常型RsPPase和突變型RsPPasemono，進(jìn)一步進(jìn)行了寡聚化和酶活性分析.結(jié)果表明：突變型RsPPasemono為單聚體，在鈷離子存在條件下會導(dǎo)致谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione sulfotransferase，GST）標(biāo)簽進(jìn)行蛋白酶切，且去標(biāo)簽后的RsPPasemono催化效率較高（Kcat/Km（PPi）=12.64 L·μmol-1·min-1），相對于RsPPase-GST提高了12倍；在無鈷離子存在條件下仍能進(jìn)行蛋白酶切，且保持催化效率（Kcat/Km（PPi）=0.34 L·μmol-1·min-1）.

球形紅細(xì)菌；無機(jī)焦磷酸酶；寡聚化；鈷離子

無機(jī)焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase，PPase，EC 3.6.1.1）廣泛存在于各種類型的細(xì)胞內(nèi)，是一種必要的、普遍的金屬依賴性酶.無機(jī)焦磷酸（inorganic pyrophosphate，PPi）是各種生物合成反應(yīng)中的副產(chǎn)品［1］，其濃度影響細(xì)胞內(nèi)生理反應(yīng)的平衡.PPase能夠水解PPi生成2個(gè)無機(jī)正磷酸（inorganic ortho-phosphate，Pi）［2］，并釋放PPi中磷酸酐鍵的能量，促進(jìn)DNA和RNA聚合反應(yīng)、輔酶合成、硫酸鹽活化、氨基酸和脂肪酸活化等生化反應(yīng)［3-4］.已有研究表明，PPase對生物體的生長具有重要的作用［5］.當(dāng)PPase在植物體內(nèi)過量表達(dá)時(shí)，可影響光合成產(chǎn)物的分配，與非轉(zhuǎn)基因植物相比提高了可溶性糖的比例［6］.表明PPase具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會應(yīng)用價(jià)值.

無機(jī)焦磷酸酶（PPase）可分為4類：膜內(nèi)在焦磷酸酶（membrane-integral pyrophoshatase，mPPase）［7］；可溶性無機(jī)焦磷酸酶（soluble inorganic pyrophoshatase，sPPase）3個(gè)同源家族，即Ⅰ型（廣泛存在于在所有類型的生物體中）、Ⅱ型（迄今局限于細(xì)菌和古細(xì)菌，數(shù)量有限）和Ⅲ型（修飾鹵代烷脫鹵酶，僅存在于少數(shù)細(xì)菌中，尚未獲得其特性）［8-11］.目前研究者們專注于前3個(gè)PPase家族的研究，因?yàn)樗鼈兊拿腹δ艽蠖嗷蛲耆铝τ赑Pase催化［12］.該焦磷酸酶的第一個(gè)晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道于50多年前［13］.這表明對PPase結(jié)構(gòu)與功能的分析研究具有很大的空間及意義.

所有PPase都需要3或4個(gè)金屬二價(jià)陽離子作為輔助因子，不同的家族、pH值、PPi濃度下其催化效果不同［14-15］.該催化反應(yīng)包括基團(tuán)的去活化和親核體的產(chǎn)生，但不產(chǎn)生酶-磷酸中間體.表明催化均發(fā)生在無機(jī)金屬-磷酸鹽籠（inorganicmetal-phosphate cage）之內(nèi)，蛋白側(cè)鏈起輔助作用［16］.其中：mPPase催化常數(shù)最小（Kcat≈10 s-1）；家族Ⅰ型PPase的催化常數(shù)比mPPase大一個(gè)數(shù)量級（Kcat≈200 s-1）；家族Ⅱ型PPase的催化常數(shù)比家族Ⅰ型PPase的再大一個(gè)數(shù)量級（Kcat≈2 000 s-1）.因此，家族Ⅱ型PPase的催化效率較大，其經(jīng)濟(jì)意義和應(yīng)用前景也更大.

家族Ⅱ型PPase發(fā)現(xiàn)于1998年，僅出現(xiàn)在細(xì)菌、古細(xì)菌譜系（尤其是桿狀菌和梭狀芽孢桿菌）及一些人類病原體中.家族Ⅱ型PPase具有變構(gòu)調(diào)節(jié)（allosteric regulation）作用［17-18］，為同源二聚體蛋白質(zhì)，屬于DHH磷酸酯酶超家族（DHH phosphoesterase superfamily），其中DHH是指在N末端結(jié)構(gòu)域的保守序列Asp-His-His與金屬特異性結(jié)合.家族Ⅱ型PPase的活性位點(diǎn)位于N端的DHH和C端的DHHA2結(jié)構(gòu)域之間［2，5］.在過渡金屬離子（Mn2+或Co2+作為底物）存在下，家族Ⅱ型PPase與其結(jié)合（具有納摩爾級的親和力），顯示最高的催化活性；而其與Mg2+結(jié)合（具有微摩爾級的親和力）時(shí)，其活性降低［17］.因?yàn)檫^渡金屬傾向于軟配位體，如Cys或His.在催化過程中，C末端結(jié)構(gòu)域關(guān)閉了N末端結(jié)構(gòu)域，活性金屬離子從五配位體變?yōu)榱湮惑w，起到協(xié)調(diào)作用［19］.過渡金屬容忍這種變化的能力比Mg2+好.

已有研究表明，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異主要來自活性中心底物的有無［20］.在無底物的情況下，2個(gè)結(jié)構(gòu)域呈開放構(gòu)象（PDB：1K23）［21］.而在底物或者產(chǎn)物存在的情況下，2個(gè)結(jié)構(gòu)域呈閉合構(gòu)象（PDB：2HAW）［22］.筆者推測：當(dāng)酶與底物結(jié)合時(shí)，導(dǎo)致構(gòu)象閉合；當(dāng)酶釋放產(chǎn)物時(shí)，導(dǎo)致構(gòu)象開放［23］.本實(shí)驗(yàn)采用Co2+作為催化條件，對PPase進(jìn)行了相關(guān)活性測定，研究了其蛋白構(gòu)象與催化機(jī)理的關(guān)系.

球形紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）作為一種重要的微生物資源，具有解磷解鉀、活化土壤中的硅、鈣和鎂等中量元素、提高或延長肥效、提高作物抗逆性等功能，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活中具有廣泛的應(yīng)用，其PPase屬于家族Ⅱ型.國內(nèi)對其PPase的研究較少，其活性調(diào)控尚沒有報(bào)道.本研究利用定點(diǎn)突變技術(shù)和雙標(biāo)簽（6×His標(biāo)簽與GST標(biāo)簽）蛋白純化體系，原核表達(dá)、純化獲得了正常型蛋白RsPPase和突變型蛋白RsPPasemono，并進(jìn)行了寡聚化和活性分析，為球形紅細(xì)菌擴(kuò)大化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1　材料和方法

1.1試劑材料

蛋白純化試劑DTT，IPTG，溶菌酶、胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin A）為Amresco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶抑制劑（PMSF）為BBI公司產(chǎn)品；GSH購自Sigma公司；Ni-NTA His·Bind Superflow Resin為Novagen公司產(chǎn)品；PreScission Protease，Glutathione-Sepharose 4 Fast Flow，HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade為GE Healthcare公司產(chǎn)品；PrimeSTAR?HSDNA Polymerase，dNTPMixture為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Dpn I限制性酶為MBI公司產(chǎn)品.Millipore超濾管；Invitrogen EnzChek?磷酸檢測試劑盒；AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒.常規(guī)生化試劑及其耗材均購自國內(nèi)公司.

感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α及BL21（DE3）、由表達(dá)載體pGEX-6P-1改造的pSKB4-RsPPase（在PreS-cission Protease編碼區(qū)和Bam HⅠ識別位點(diǎn)之間加入NdeⅠ識別位點(diǎn)和6×His）.

1.2球形紅細(xì)菌PPase的定點(diǎn)突變

球形紅細(xì)菌PPase（RsPPase）是同源二聚體，由β折疊PIEITVR（107-113）和相鄰單體N端的PIEITVR（107-113）之間的相互作用形成.猜測破壞它們之間的相互作用有利于單聚體形成.因此，本實(shí)驗(yàn)將該β折疊PIEITVR突變?yōu)镽IRDTDR，形成突變蛋白P107R-E109R-I110D-V112D，即RsPPasemono.按照Stratagene的QuikChange?XL Site-Directed Mutagenesis Kit引物設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變PCR引物如下：

RsPPasemono-F：5＇-gggatcaagaccaagtcccgcatccgcgataccgatcgtccgctggcctgcacc-3＇.

RsPPasemono-R：5＇-ggtgcaggccagcggacgatcggtatcgcggatgcgggacttggtcttgatccc-3＇.

利用定點(diǎn)突變技術(shù)，PCR突變pSKB4-RsPPase，程序結(jié)束后取5～10μL樣品用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測.所有突變載體經(jīng)測序驗(yàn)證后用于原核表達(dá).

1.3球形紅細(xì)菌PPase及其突變體蛋白的原核表達(dá)與純化

將含有pSKB4-RsPPase和pSKB4-RsPPasemono的表達(dá)菌株BL21（DE3）擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到0.6～0.8.用0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)16 h后離心收集菌體.

用裂解液（50 mmol·L-1Hepes（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）緩沖液（pH 8.0），0.4 mol·L-1KCl，290μmol·L-1PMSF（苯甲基磺酰氟），1.5μmol·L-1Pepstatin A，0.1 mg/mL溶菌酶）懸浮菌體后，超聲波破碎菌體至菌液澄清，12 000 r/min離心，收集上清液.

利用目的蛋白帶有6×His和GST標(biāo)簽，先后過Ni-NTA His·Bind Superflow和Glutathione-Sepharose 2種親和色譜柱以獲得目的融合蛋白，加入PreScission Protease進(jìn)行酶切，重新上GST柱獲得純凈的目的蛋白并透析（25 mmol·L-1Hepes緩沖液（pH 8.0），100 mmol·L-1KCl，1.5 mmol·L-1DTT（二硫蘇糖醇），5%甘油），SDS（十二烷基硫酸鈉）-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）電泳分析不同純化階段的樣品純度.

在無Co2+情況下，得到RsPPase和RsPPasemono；在有Co2+情況下，所有緩沖液中加入0.1mmol·L-1CoCl2，得到RsPPase-GST和RsPPasemono.

1.4酸性蛋白的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

配制不含有SDS的5×Loading Buffer，并制備不含有SDS的5%濃縮膠和12%分離膠.將電泳槽置于冰中，整個(gè)電泳過程處于0～4℃條件下.

1.5分子篩色譜檢測

配制緩沖液（50 mmol·L-1Hepes（pH 8.0），50 mmol·L-1KCl），抽濾、脫氣處理后備用.清洗、平衡柱和系統(tǒng)后，用2mg/mL藍(lán)色葡聚糖測定外水體積（Vo）.將4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白（牛血清白蛋白67.5 kD，雞蛋清白蛋白44 kD，β-乳球蛋白32 kD和α-胰凝乳蛋白酶25 kD）按一定比例混合后低溫離心，取上清液上樣，測定波長280 nm處的吸光度，分別記錄洗脫體積Ve，并利用公式（2）計(jì)算Kav.繪制以Kav為橫坐標(biāo)，lg Mr為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線.測定2種純化所得蛋白RsPPase和RsPPasemono，根據(jù)其流出體積計(jì)算相對分子質(zhì)量.平行實(shí)驗(yàn)3次.

式（1）中：r表示柱子半徑；l表示柱子長度.

1.6球形紅細(xì)菌PPase及其突變體蛋白的酶活性測定

利用EnzChek?Phosphate Assay Kit測定焦磷酸酶的活性.依次向反應(yīng)體系（1×Reaction buffer，0.2 mmol·L-1MESG（2-氨基-6-巰基-7-甲基嘌呤核苷），2 U/mL PNP（嘌呤核苷酸磷酸化酶））中加入磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0，20，30，40，50，60，70，80μmol·L-1，測定波長360 nm處的吸光度，繪制磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線.

保持反應(yīng)條件和反應(yīng)體系相同，Co2+-PPase-GST終濃度為0.84μmol·L-1，反應(yīng)體系中焦磷酸的濃度分別為0，5，10，20，40，80，150和300μmol·L-1；無Co2+的PPase無酶活性；Co2+-PPasemono的終濃度為0.1μmol·L-1，反應(yīng)體系中焦磷酸的濃度分別為0，5，10，20，40，80，150和300μmol·L-1；無Co2+的PPasemono終濃度為1.4μmol·L-1，反應(yīng)體系中焦磷酸的濃度分別為0，5，10，20，40，80，150，300和600μmol·L-1，分別記錄各反應(yīng)液吸光度的變化速率.平行實(shí)驗(yàn)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出磷酸的生成速率，計(jì)算出4種焦磷酸酶的最大反應(yīng)速率（Vm）和米氏常數(shù)（Km）.

2　結(jié)果與分析

2.1球形紅細(xì)菌PPase的突變PCR

球形紅細(xì)菌PPase基因大小為918 bp，原核表達(dá)載體pSKB4大小約為5 000 bp，故pSKB4-RsPPase約為 5 900 bp.以 pSKB4-RsPPase為模板、突變引物為RsPPasemono-F 和RsPPasemono-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)并獲得預(yù)期大小的DNA片段，經(jīng)測序驗(yàn)證后用于原核表達(dá).

圖1　PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2RsPPase及RsPPasemono的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

用SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白的表達(dá)與純化效果，結(jié)果見圖2.目的蛋白RsPPase及RsPPasemono約為33 kD，標(biāo)簽蛋白GST約為28 kD，融合蛋白RsPPase-GST及RsPPasemono-GST約為61 kD.在Co2+存在的條件下，RsPPasemono可酶切除去標(biāo)簽，RsPPase不能去標(biāo)簽；在無Co2+的條件下，RsPPase 和RsPPasemono均能去標(biāo)簽.

圖2　無Co2+和有Co2+條件下RsPPase和RsPPasemono的酶切結(jié)果

2.3RsPPase及RsPPasemono的Native-PAGE凝膠電泳

非變性電泳是指在電泳過程中蛋白質(zhì)處于非變性狀態(tài)，其遷移率取決于蛋白質(zhì)的電荷和分子量.正常型RsPPase為二聚體蛋白，故RsPPase-GST的分子量約為122 kD；突變型RsPPasemono預(yù)期為單聚體，故RsPPasemono-GST的預(yù)期分子量約為61 kD.利用Native-PAGE凝膠電泳可以推測出正常型蛋白RsPPase-GST的分子量大于100 kD，突變型蛋白RsPPasemono-GST的分子量接近66 kD（見圖3）.

圖3　有Co2+條件下RsPPase和RsPPasemono酶切前后的Native-PAGE凝膠電泳圖

在有Co2+條件下進(jìn)行酶切，融合蛋白RsPPase-GST及RsPPasemono-GST均能除去GST標(biāo)簽（28 kD）后得到目的蛋白RsPPase（理論值66 kD）及RsPPasemono（預(yù)期值33 kD），但酶切不徹底，且不能準(zhǔn)確判斷分子量大小.為進(jìn)一步驗(yàn)證它們的分子量大小，進(jìn)行了凝膠過濾色譜.

2.4RsPPase及RsPPasemono的分子量測定

本研究中凝膠過濾柱體積（Vc）為120 mL.利用藍(lán)色葡聚糖2000測定外水體積（Vo）為45.13 mL.利用4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制葡聚糖凝膠過濾蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線.圖4為正常型RsPPase及突變型RsPPasemono的凝膠過濾譜圖，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果見表1.

圖4　RsPPase及RsPPasemono的凝膠過濾譜圖

表1　RsPPase及RsPPasemono凝膠色譜洗脫體積及其相應(yīng)的分子量

球形紅細(xì)菌PPase為二聚體，其理論分子量為66 kD；RsPPasemono預(yù)期為單聚體，故RsPPasemono的預(yù)期分子量約為33 kD.通過凝膠色譜測定，RsPPase及RsPPasemono的分子量分別為69.3 kD和46.0 kD.

2.5RsPPase及RsPPasemono的酶活性測定

球形紅細(xì)菌PPase正常蛋白RsPPase在Co2+存在條件下有活性，在無Co2+條件下RsPPase沒有活性，間接證明PPase是一種Co2+依賴性酶.突變型RsPPasemono在Co2+存在條件下的活性較大，在無Co2+條件下仍有活性.利用KaleidaGraph 3.5作圖軟件對各蛋白進(jìn)行了米氏方程擬合，所有蛋白的活性參數(shù)見表2.

表2　RsPPase及RsPPasemono的活性參數(shù)

3　討論

PPase是廣泛存在于自然界中以無機(jī)焦磷酸（PPi）為底物的磷酰基轉(zhuǎn)移酶（phosphoryl-transfer enzymes），水解生成無機(jī)正磷酸（Pi），調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的PPi濃度，在脂代謝（包括脂合成與分解）、鈣吸收及骨形成和DNA合成等生物化學(xué)轉(zhuǎn)化中扮演重要的角色［24］，對生物代謝具有重要意義.研究發(fā)現(xiàn)，PPase催化過程需要3個(gè)二價(jià)陽離子（Mg2+，Mn2+，Co2+或Zn2+），其中2個(gè)與酶活性中心結(jié)合，而第3個(gè)形成PPi-X2+復(fù)合體［16］.其中，鈷離子對維持RsPPase的活性具有重要的作用［18］.RsPPase屬于家族Ⅱ型，為同源二聚體.Celis等［25］的研究結(jié)果表明球形紅細(xì)菌PPase的Km和Kcat分別為0.35 mmol/L和80 s-1.

本研究通過RsPPase結(jié)構(gòu)模擬分析，對RsPPase進(jìn)行了定點(diǎn)突變，利用親和色譜技術(shù)、原核表達(dá)、純化得到了4種蛋白——Co2+-RsPPase-GST，Co2+-RsPPasemono，RsPPase和RsPPasemono，并對4種蛋白進(jìn)行了寡聚化和活性分析.

分析SDS-PAGE凝膠電泳圖得出：Co2+-RsPPase-GST只有少量能夠酶切；Co2+-RsPPasemono-GST，RsPPase-GST和RsPPasemono-GST均能酶切，但均不能完全酶切，其酶切條件優(yōu)化有待進(jìn)一步探討.

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，SDS-PAGE凝膠電泳圖中RsPPase和RsPPasemono酶切后的條帶在35 kD和44 kD之間.因此，利用Native-PAGE凝膠電泳和凝膠過濾色譜法進(jìn)一步測定了RsPPase和RsPPasemono的分子量.分析Native-PAGE凝膠電泳圖發(fā)現(xiàn)，RsPPase-GST和RsPPasemono-GST的分子量符合預(yù)期值.但分子篩結(jié)果均略大于預(yù)期值，推測是由于操作誤差和蛋白濃度等因素造成的.因此RsPPasemono為單聚體.

在閉合構(gòu)象狀態(tài)下（Co2+存在條件下），正常型蛋白N端的GST標(biāo)簽受到另一單體C端的影響而導(dǎo)致自由度變小，從而掩蓋了蛋白酶的識別位點(diǎn)，導(dǎo)致不能進(jìn)行酶切.此外，由于其C端結(jié)構(gòu)域不能打開釋放產(chǎn)物和結(jié)合底物，從而降低了融合蛋白 RsPPase-GST的活性 （Kcat/Km（PPi）=1.11 L·μmol-1·min-1）.突變型蛋白為單聚體，其N端的GST標(biāo)簽自由度不受影響，C端結(jié)構(gòu)域也能打開釋放產(chǎn)物和結(jié)合底物，故能進(jìn)行蛋白酶切，去標(biāo)簽后的RsPPasemono催化效率較高（Kcat/Km（PPi）=12.64 L·μmol-1·min-1），較前者增大了約12倍.

在開放構(gòu)象狀態(tài)下（無Co2+條件下），正常型蛋白N端的GST標(biāo)簽不受另一單體的影響而具有較大的自由度，占據(jù)對應(yīng)單體N端結(jié)構(gòu)域的空間，能夠經(jīng)酶切產(chǎn)生游離的RsPPase，但無鈷離子以維持其活性，即無活性.突變型蛋白同理也能進(jìn)行蛋白酶切得到RSPPasemono，但仍保持較低的催化效率（Kcat/Km（PPi）=0.34 L·μmol-1·min-1）.

RsPPase是一種金屬鈷離子依賴性酶，N端的GST標(biāo)簽和Co2+與活性位點(diǎn)的結(jié)合，均通過改變構(gòu)象影響其活性.本研究通過比較以上4種蛋白的酶切效果和催化效率，為分析鈷離子和GST標(biāo)簽影響其酶活的機(jī)制奠定了基礎(chǔ).

［1］王異星，李明啟.焦磷酸在植物細(xì)胞能量代謝中的作用［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，1997，5（4）：85-90.

［2］Sancha N D L，Coello-Couti?o M P，Valencia-turcotte L G，et al.Characterization of two soluble inorganic pyrophosphatases from Arabidopsis thaliana［J］.Plant Science，2007，172（4）：796-807.

［3］Hernández-domíguez E E，Valencia-turcotte L G，Rodríguez-sotres R.Changes in expression of soluble inorganic pyrophosphatases of phaseolus vulgaris under phosphate starvation［J］.Plant Science，2012，187（3）：39-48.

［4］Mohammed SA，Nishio S，Takahashi H，et al.Dynamic behavior of oligomeric inorganic pyrophosphatase explored by quasielastic neutron scattering［J］.Journal of Physical Chemistry B，2012，116（33）：9917-9921.

［5］Petersburg S，Kajander T，Kellosalo J，et al.Inorganic pyrophosphatases：one substrate，three mechanisms［J］.Febs Letters，2013，587（13）：1863-1869.

［6］張寧，司懷軍，柳娜，等.馬鈴薯無機(jī)焦磷酸酶基因cDNA在大腸桿菌中的表達(dá)及蛋白質(zhì)特征分析［J］.分子植物育種，2008，6（6）：1107-1110.

［7］Serrano A，Perez-Casti?eira JR，Baltscheffsky H，et al.Proton-pumping inorganic pyrophosphatases in some archaea and other extremophilic prokaryotes［J］.Journal of Bioenergetics and Biomembranes，2004，36（1）：127-133.

［8］Yan Xufan，Dong Qing，Zheng Minhui，etal.Characterization of a family I-liked alkaline-resistant inorganic pyrophosphatase from the hyperthermophilic archaeon pyrococcus furiosus for rapid determination of sugar nucleotidyltransferase at high temperature［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2013，98（9）：15-20.

［9］Hoelzle K，Peter S，Sidler M，et al.Inorganic pyrophosphatase in uncultivable hemotrophicmycoplasmas：identification and properties of the enzyme from Mycoplasma suis［J］.Bmc Microbiology，2010，10（1）：116-127.

［10］Perez-Castineira JR，Hernandez A，Drake R.A plant proton-pumping inorganic pyrophosphatase functionally complements the vacuolar atpase transport activity and confers bafilomycin resistance in yeast［J］.Biochemical Journal，2011，437（14）：269-278.

［11］Mohammed SA，Nishio S，Takahashi H，et al.Role of vacuolar H+-inorganic pyrophosphatase in tomato fruit development［J］.Journal of Experimental Botany，2012，63（15）：5613-5621.

［12］姬長合，王靖.釀酒酵母無機(jī)焦磷酸酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其意義［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，38（1）：70-74.

［13］Klemme J，Klemme B，Gest H.Catalytic properties and regulatory diversity of inorganic pyrophosphatases from photosynthetic bacteria［J］. Journal of Bacteriology，1971，108（12）：1122-1128.

［14］Hughes R C，Coates L，Blakeley M P，et al.Inorganic pyrophosphatase crystals from thermococcus thioreducens for X-ray and neutron diffraction［J］.Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications，2012，68（12）：1482-1487.

［15］茍萍，楊壽鈞.釀酒酵母胞內(nèi)無機(jī)焦磷酸酶的分離純化及性質(zhì)［J］.微生物學(xué)報(bào)，1998，38（3）：229-232.

［16］Harold FM.Inorganic polyphosphates in biology：structure，metabolism，and function［J］.Bacteriological Reviews，1966，30（4）：772-794.

［17］Merckel M，F(xiàn)abrichniy I，Salminen A，et al.Crystal structure of streptococcusmutans pyrophosphatase：a new fold for an old mechanism［J］. Structure，2001，9（4）：289-297.

［18］Gómez-García M R，Losada M，Serrano A.Comparative biochemical and functional studies of family Isoluble inorganic pyrophosphatases from photosynthetic bacteria［J］.Febs Journal，2007，274（15）：3948-3959.

［19］Liu Binbin，Bartlam M，Gao R，etal.Crystal structure of the hyperthermophilic inorganic pyrophosphatase from the archaeon pyrococcus horikoshii［J］.Biophysical Journal，2004，86（1）：420-427.

［20］黃園波，王艷興，戴夢瑤，等.球形紅細(xì)菌無機(jī)焦磷酸酶的原核表達(dá)、純化及初步分析［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：427-433.

［21］Fabrichniy IP，Lehti?L，Salminen A，et al.Structural studies ofmetal ions in family IIpyrophosphatases：the requirement for a Janus ion［J］. Biochemistry，2004，43（45）：14403-14411.

［22］Fabrichniy IP，Lehti?L，TammenkoskiM，etal.A trimetal site and substrate distortion in a family IIinorganic pyrophosphatase［J］.Journal of Biological Chemistry，2007，282（2）：1422-1431.

［23］Ahn S，Milner A J，F(xiàn)ütterer K，et al.The"open"and"closed"structures of the type-C inorganic pyrophosphatases from Bacillus subtilis and Streptococcus gordonii［J］.Journal of Molecular Biology，2001，313（4）：797-811.

［24］Salminen T，Kaepylae J，Heikinheimo P，et al.Structure and function analysis of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase：is a hydroxide ion the key to catalysis？［J］.Biochemistry，1995，34（3）：782-791.

［25］Celis H，F(xiàn)ranco B，Escobedo S，et al.Rhodobacter sphaeroides has a family IIpyrophosphatase：comparison with other species of photosynthetic bacteria［J］.Archives of Microbiology，2003，179（5）：368-376.

（責(zé)任編輯薛榮）

Oligomerization and enzyme activity analysis on inorganic pyrophosphatase from Rhodobacter sphaeroides

CHEN Guoguo， SUN Meihao
（College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China）

Inorganic pyrophosphatese from Rhodobacter sphaeroides（RsPPase）is one of the typeⅡ soluble PPase，and divalent cation Co2+is essential for its activity.Regulation of RsPPase activity and oligomerization had not been reported yet.RsPPase and RsPPasemono were prokaryotically expressed and purified.It was found that fusion glutathione sulfotransferase tagged GST-RsPPasemonos were monomers so that they were cleavable by PreScission Protease in presence of Co2+（Kcat/Km（PPi）=12.64 L·μmol-1·min-1）which was increased by 12 times compared to RsPPase-GST and non-Co2+（Kcat/Km（PPi）=0.34 L·μmol-1·min-1）.

Rhodobacter sphaeroides；inorganic pyrophosphatase；oligomerization；Co2+

Q556+.5

A

1001-5051（2016）02-0193-07

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.02.012

*收文日期：2015-05-06；2015-09-21

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30800019）

陳果果（1991-），女，浙江樂清人，碩士研究生.研究方向：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能.

孫梅好.E-mail：mhsun@zjnu.cn