凌丹燕，　李永強，　路　梅，　郭衛(wèi)東

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華　321004）

短柄櫻桃干腐病病原菌的鑒定及其生物學特性*1

凌丹燕，李永強，路梅，郭衛(wèi)東

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

為了明確短柄櫻桃干腐病的病源，采用組織分離法和單孢分離法分離純化了病原菌，依據(jù)柯赫法則、形態(tài)特征及核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）序列對其進行了鑒定，同時檢測了其部分生物學特性.實驗結(jié)果表明：引起短柄櫻桃干腐病的病原菌為金黃殼囊孢菌（Cytospora chrysosperma；KR260904）；該病菌菌落生長和孢子萌發(fā)的最適pH為9，最佳光照條件為12 h黑暗/12 h光照，最適溫度為25℃；在供試的10種碳、氮源中，乳糖和蛋白胨利于該菌落的生長，葡萄糖和酵母有利于其孢子的萌發(fā).

短柄櫻桃；干腐??；金黃殼囊孢；鑒定；生物學特性

短柄櫻桃（Prunus pseudocerasus cv.Duanbing）為薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）落葉果樹，主產(chǎn)浙江，有自花結(jié)實性好、豐產(chǎn)性佳、適應(yīng)性強、果實大、成熟期早而集中等特點，是中國櫻桃的優(yōu)良栽培品種之一，現(xiàn)已成為中國南方櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點品種，并于1992年通過省級品種認定，為中國櫻桃中通過省級認定的少數(shù)品種之一［1］.但是，隨著種植面積的擴增，各種真菌病害也隨之普遍產(chǎn)生，主要有褐腐病、黑色輪紋病和枝枯病等.

干腐病是一種高發(fā)植物病害，在多種植物的栽培過程中皆有發(fā)生，危害嚴重.到目前為止，國內(nèi)外對大櫻桃、石榴、馬鈴薯、棕櫚和花椒等植物的干腐病進行了許多研究報道［2］.然而，對短柄櫻桃干腐病的相關(guān)研究尚未見報道.2013年春，筆者在金華市雅畈鎮(zhèn)的櫻桃種植基地發(fā)現(xiàn)疑似干腐病的短柄櫻桃病株：在植株的主干部有不規(guī)則形暗褐色病斑，病皮堅硬；切開表皮，木質(zhì)部呈黃褐色（見圖1），多株柔嫩植株整株死亡.本文對采集的疑似短柄櫻桃干腐病的病株材料進行了病原菌的分類鑒定及其生物學特性研究.本研究結(jié)果將對短柄櫻桃干腐病的發(fā)病機理與侵染機制研究，及對其病害的有效防治提供科學依據(jù).

圖1　短柄櫻桃干腐病的癥狀

1　材料與方法

1.1供試材料

短柄櫻桃干腐病枝條采自金華市雅畈鎮(zhèn)浙江省特色經(jīng)濟植物生物技術(shù)研究重點實驗室種植基地.

1.2短柄櫻桃干腐病病原菌的分離和培養(yǎng)

采集具有顯著病狀的病樣，采用常規(guī)植物組織分離法進行病原菌的分離.純化后的菌株在PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)和形態(tài)學觀察，同時進行斜面培養(yǎng)，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?］.

1.3短柄櫻桃干腐病病原菌的致病性檢測

采用柯赫氏法則對病原菌進行致病性檢測：將PDA培養(yǎng)5 d的病原菌用直徑5 mm打孔器打孔形成菌餅，接種到經(jīng)70%乙醇溶液表面消毒的健康短柄櫻桃枝條上，枝條用“十字法”造成傷口.設(shè)接種菌餅和接種PDA培養(yǎng)基2個處理，每個處理重復6次，在25℃保濕培養(yǎng)，每天觀察并記錄發(fā)病狀況，并對接種發(fā)病后的枝條進行病菌的再分離.

1.4病原菌的形態(tài)和生物特性研究

將菌種接種于PDA培養(yǎng)基中，置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，用滅菌打孔器從菌落邊緣打孔取直徑為5 mm的菌餅，用于以下實驗.

1.4.1培養(yǎng)性狀的觀察

配制4種培養(yǎng)基：PDA，Czapek，MYA（酵母浸膏1.5 g，麥芽浸膏1.5 g，瓊脂2.0 g，水100 mL）和SZ（櫻桃樹皮10 g，瓊脂2.0 g，水100 mL）［4］，接種菌餅至不同的培養(yǎng)基平板，7 d后觀察并記錄各菌落的生長狀態(tài).每個實驗均重復3次，且每次實驗均重復4次（下同）.

1.4.2碳氮源對菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

配制3%不同碳源（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和淀粉）及0.2%不同氮源（硫酸銨、草酸銨、酵母提取物、蛋白胨和硝酸銨）的查氏培養(yǎng)基平板，接種菌餅于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔24 h用十字交叉法測量菌落直徑，連續(xù)測量9 d，求其平均菌落直徑.

分別用0.5%的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、硫酸銨、草酸銨、酵母提取物、蛋白胨和硝酸銨溶液配制孢子懸浮液（1×105～1×106/mL），各取適量孢子懸液涂布于載玻片上，在9，12和24 h后觀察分生孢子的萌發(fā)情況，計算孢子萌發(fā)率.

1.4.3pH對菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

配制pH值分別為2，3，4，5，6，7，8，9，10，11 和12共11種PDA培養(yǎng)基.接種菌餅至不同pH值的培養(yǎng)基平板中央，置于28℃恒溫培養(yǎng).連續(xù)6 d測量菌落直徑，求其平均菌落直徑.

配制pH值為3，4，5，6，7，8，9，10，11和12的孢子懸浮液.取適量孢子懸浮液涂布于載玻片上，28℃恒溫培養(yǎng)，在9，12和24 h后觀察分生孢子的萌發(fā)情況，并計算孢子萌發(fā)率.

1.4.4光照對菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

設(shè)置完全光照、完全黑暗、12 h光照/12 h黑暗和12 h黑暗/12 h光照4種光照條件，菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑.

取適量孢子懸浮液涂布于載玻片上，在完全光照、完全黑暗、12 h光照/12 h黑暗和12 h黑暗/12 h光照4種條件下培養(yǎng)，9，12和24 h后觀察分生孢子的萌發(fā)情況，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率.

1.4.5溫度對菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

接種菌餅至PDA培養(yǎng)基中央，分別在5，10，15，20，25，30和35℃的恒溫條件下培養(yǎng)6 d，觀察菌落生長情況，連續(xù)6 d測量菌落直徑.

取適量孢子懸液涂布于載玻片上，在5，10，15，20，25，30和35℃的恒溫條件下培養(yǎng)，9，12和24 h后取出觀察分生孢子的萌發(fā)情況，并統(tǒng)計孢子萌發(fā)率.

1.5rDNA-ITS的PCR擴增與序列分析

1.5.1基因組DNA的提取

采用改良CTAB法［5］提取櫻桃干腐病病原菌DNA.

1.5.2PCR擴增

采用真菌通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增.25μL反應(yīng)體系包括10×PCR buffer 2.5μL，dNTP溶液（10 mmol/L）2.0μL，ITS1和ITS4引物溶液各1μL，模板DNA溶液2μL，5 U/μL Taq酶溶液0.5μL，超純水16μL.反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，36個循環(huán)；72℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基有限公司測序.

1.5.3rDNA-ITS序列同源性比較

對測得的供試菌株rDNA-ITS區(qū)段的序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫的BLAST進行序列比對分析，采用MAGA 4軟件構(gòu)建病原菌進化樹.

2　實驗結(jié)果與分析

2.1短柄櫻桃干腐病分離物的致病性

利用組織分離法從病健交界處的植物組織中分離得到8株疑似病原物（命名為DY1～8），分別進行了柯赫氏法則驗證.接種結(jié)果顯示，分離物DY3能夠引起與分離植株相同癥狀的病害.通過病原物的再分離，得到與DY3培養(yǎng)性狀相同的純菌株.實驗結(jié)果說明，分離物DY3是引起短柄櫻桃干腐病的病原菌之一.

2.2短柄櫻桃干腐病病原菌的形態(tài)學鑒定

將斜面保存的DY3菌株移至平板培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，取5 mm菌餅置于新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng).菌落圓形，菌絲灰白色，呈絨毛狀.1～5 d時，氣生菌絲旺盛，菌落周圍有一圈白色菌絲，中間出現(xiàn)深灰色基質(zhì)菌絲，呈放射狀，菌落直徑達70～80 mm；6～10 d時，菌絲迅速生長，深灰色的基質(zhì)菌絲明顯增加，甚至有些已經(jīng)出現(xiàn)少許孢子團，菌落周圍仍是灰白色菌絲；10～15 d時，灰白色氣生菌絲中形成黑色的孢子器，培養(yǎng)基中間和培養(yǎng)基邊緣同玻璃接觸處也有黑色的孢子器，孢子器逐漸增大且呈規(guī)則排列；15～20 d時，小顆粒狀物上可以吐出淡黃色的孢子粘液.分生孢子單胞、無色、臘腸形，其大小為（0.68～1.36）μm× （3.74～6.80）μm（見圖2）.

圖2　短柄櫻桃干腐病病原菌的形態(tài)

2.3短柄櫻桃干腐病病原菌rDNA-ITS序列分析

以分離物DY3的DNA為模板，用通用引物ITS1和ITS4對其核糖體rDNA-ITS進行PCR擴增，得到一個長度為 556 bp的擴增片段.用 BLAST軟件在GenBank中搜索同源序列，分離物DY3與Cytospora chrysosperma的同源性為97%.短柄櫻桃干腐病病原菌進化樹見圖3.結(jié)合上述菌落和孢子形態(tài)觀察結(jié)果，鑒定該病原菌為金黃殼囊孢菌（Cytospora chrysosperma）.

2.44種培養(yǎng)基中短柄櫻桃干腐病病原菌的生長狀態(tài)

從表1和圖4可以看出，短柄櫻桃干腐病病原菌DY3在不同培養(yǎng)基上的菌落顏色、生長速度與菌落形態(tài)都略有不同.就生長速度而言：在PDA培養(yǎng)基上，菌絲生長快速；在Czapek培養(yǎng)基上，菌絲生長緩慢；MYA和SZ培養(yǎng)基上介于兩者之間.

圖3　短柄櫻桃干腐病病原菌進化樹

圖4　短柄櫻桃干腐病病原菌DY3在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.5碳源對短柄櫻桃干腐病病原菌菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

圖5顯示了不同碳源對短柄櫻桃干腐病病原菌DY3菌絲生長的影響.實驗結(jié)果顯示，碳源不是菌絲生長的決定性物質(zhì)，即使在無碳源的情況下，DY3菌絲仍能夠生長，只是生長受到抑制，并且菌絲呈透明狀.在5種供試碳源中，最適菌絲生長的碳源為乳糖；最適合孢子萌發(fā)的碳源為葡萄糖，24 h萌發(fā)率接近70%，遠遠高于其他碳源中的孢子萌發(fā)率（見圖6）.

圖5　碳源對短柄櫻桃干腐病病原菌菌落生長的影響

圖6　碳源對短柄櫻桃干腐病病原菌孢子萌發(fā)的影響

2.6氮源對短柄櫻桃干腐病病原菌菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

根據(jù)圖7顯示，不同氮源對短柄櫻桃干腐病病原菌DY3菌絲生長的影響不同.就菌落生長速率而言，酵母提取物、蛋白胨＞無氮源＞草酸銨＞硫酸銨＞硝酸鈉.從菌落生長狀況看，無氮源培養(yǎng)基上雖然菌落生長速率不受影響，但菌絲顏色近透明，說明并不能滿足菌絲的正常生長.從產(chǎn)孢情況看，以蛋白胨、硝酸銨和硫酸銨為氮源的查氏培養(yǎng)基更有利于病原菌產(chǎn)孢，相比之下蛋白胨查氏培養(yǎng)基中孢子團長得更密集.在孢子萌發(fā)過程中，蛋白胨最能刺激孢子的萌發(fā)（見圖8），24 h孢子萌發(fā)率達到80%，其次是硝酸銨和硫酸銨，草酸銨最差.

圖7　氮源對短柄櫻桃干腐病病原菌菌落生長的影響

圖8　氮源對短柄櫻桃干腐病病原菌孢子萌發(fā)的影響

2.7pH對短柄櫻桃干腐病病原菌菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

不同酸堿度培養(yǎng)基對短柄櫻桃干腐病病原菌DY3菌絲生長和孢子萌發(fā)率的影響見圖9和圖10.在極端酸堿度條件下（pH=2，12），病原菌菌絲基本不生長；在pH 4～11條件下，病原菌的菌落長勢較快，其中pH值為8和9時長勢更好.從圖10可以看出：當pH值為5和9時，病原菌的孢子萌發(fā)率最高；以pH 7為中點向兩端變化，萌發(fā)率呈先遞增后遞減的趨勢.因此，適合短柄櫻桃干腐病病原菌孢子萌發(fā)的培養(yǎng)基酸堿度為pH 5 和pH 9.結(jié)合病原菌菌落生長狀況和孢子萌發(fā)率，最適合病原菌DY3生長的pH值為9.

圖9　pH對短柄櫻桃干腐病病原菌菌落生長的影響

圖10　pH對短柄櫻桃干腐病病原菌孢子萌發(fā)的影響

2.8光照對短柄櫻桃干腐病病原菌菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

從圖11不同光照處理對短柄櫻桃干腐病病原菌DY3菌絲生長的影響可以看出：全黑暗不利于該菌菌絲的生長；12 h光照/12 h黑暗處理下菌絲生長速率提高；12 h黑暗/12 h光照處理下菌絲的生長速率顯著提高，菌落直徑達8 cm，與全光照處理無顯著差異.12 h黑暗/12 h光照處理下菌絲的生長速率明顯高于12 h光照/12 h黑暗處理，說明菌絲的生長不僅受光照時間長短的影響，光暗交替的次序也是決定菌絲生長速率的因素之一.圖12顯示了隨著培養(yǎng)時間的延長，各光照處理孢子的萌發(fā)率均升高.培養(yǎng)24 h后，12 h黑暗/12 h光照處理的孢子萌發(fā)率顯著高于其他處理.由此可見，短柄櫻桃干腐病病原菌DY3孢子萌發(fā)的最佳光照條件為先12 h黑暗培養(yǎng)、再12 h光照處理.

圖11　光照對短柄櫻桃干腐病病原菌菌落生長的影響

圖12　光照對短柄櫻桃干腐病病原菌孢子萌發(fā)的影響

圖13　溫度對短柄櫻桃干腐病病原菌菌落生長的影響

圖14　溫度對短柄櫻桃干腐病病原菌孢子萌發(fā)的影響

2.9溫度對短柄櫻桃干腐病病原菌菌落生長和孢子萌發(fā)的影響

溫度對短柄櫻桃干腐病病原菌DY3菌落生長的影響較大.從圖13可以看出，不同溫度下菌落直徑大小為25℃＞20℃ ＞30℃ ＞15℃ ＞10℃＞35℃＞5℃，菌落直徑大小隨著溫度的升高先增大后減小，而25℃為菌落生長最適溫度.從圖14可知不同溫度對金黃殼囊孢菌孢子萌發(fā)的影響.25℃孢子萌發(fā)率最高，35℃和5℃孢子萌發(fā)率較低.結(jié)合菌落生長情況和孢子萌發(fā)率，25℃是培養(yǎng)短柄櫻桃干腐病病原菌的適宜溫度.

3　討論和結(jié)論

關(guān)于短柄櫻桃干腐病的分子鑒定和生物學特性研究尚未見有相關(guān)文獻報道.但是，由真菌侵染引起的植株干腐病卻是世界性的植物病害，對許多作物和觀賞植物構(gòu)成嚴重的威脅［6-7］.本研究首次對短柄櫻桃干腐病進行了研究，根據(jù)分離菌株的柯赫氏法則驗證和rDNA-ITS分子鑒定結(jié)果，確認引起短柄櫻桃干腐病的病原菌DY3為金黃殼囊孢菌（C.chrysosperma），其形態(tài)學特征與陳海燕［8］、楊明秀［9］的研究報道相似：菌落圓形，菌絲灰白色，呈絨毛狀；分生孢子單孢、臘腸形、無色.

金黃殼囊孢菌是引起樹木腐爛病的一類重要病害，分布廣泛，受害樹種種類多，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失，其危害對象主要包括楊樹、柳樹、核桃、櫻桃等.目前，國內(nèi)外對此病原菌的研究主要集中在楊樹干腐病.楊明秀等［10］通過對各地區(qū)楊樹干腐病病原菌遺傳多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，中國金黃殼囊孢菌（C.chrysosperma）能引起楊樹腐爛病，并且其致病性與地理來源不存在明顯的關(guān)系.由于缺少較為系統(tǒng)性的資料，金黃殼囊孢菌的鑒定較為困難.在形態(tài)學研究上主要根據(jù)Fotouhifar等［11］和Adams等［12］等對殼囊孢屬的形態(tài)學描述，鑒定的主要依據(jù)為子實體結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)及大小.本研究將分子生物學手段和傳統(tǒng)形態(tài)學方法相結(jié)合，提高了鑒定結(jié)果的準確性［13］.

本研究首次對引起短柄櫻桃干腐病的金黃殼囊孢菌的生物學特性進行了系統(tǒng)研究.研究發(fā)現(xiàn)：金黃殼囊孢菌在PDA，Czapek，MYA和SZ這4種不同的培養(yǎng)基上菌落顏色、形態(tài)、生長速度等都有一定的區(qū)別；在SZ培養(yǎng)基上產(chǎn)生同心圓輪紋，但是菌落氣生菌絲旺盛，這與張星耀等［4］的研究結(jié)果有所不同，推測可能是病原菌種來源不同所致.在不同的碳、氮源對菌絲生長和孢子萌發(fā)影響的研究中，發(fā)現(xiàn)：乳糖能促進菌絲最快生長，葡萄糖則最適于其分生孢子的萌發(fā)；酵母提取物和蛋白胨均利于其菌落生長，蛋白胨則最適于其孢子萌發(fā).這與冀瑞卿等［14］對金黃殼囊孢菌生物學特性的研究相一致.同時，冀瑞卿等［14］發(fā)現(xiàn)金黃殼囊孢菌培養(yǎng)的最適pH值為5～6，但本研究發(fā)現(xiàn)其最適pH值為9.

關(guān)于植物干腐病害病原菌鑒定已有很多報道.李曉琴等［15］發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f.sp）能夠引起維管束病害，導致唐菖蒲干腐病的發(fā)生；而王璇等［16］對山核桃干腐病的研究發(fā)現(xiàn)，引起山核桃干腐病發(fā)生的病原菌主要為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）.本文關(guān)于金黃殼囊孢菌引起短柄櫻桃干腐病的報道，是國內(nèi)外首次報道.通過病原菌分離鑒定及其生物學特性研究，為闡明短柄櫻桃干腐病的發(fā)生機理提供了實驗依據(jù).在今后的研究中，將開展有關(guān)藥劑毒理等實驗，為短柄櫻桃干腐病害的有效防治提供切實可行的技術(shù)指導.

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（責任編輯薛榮）

Identification and biological characteristic researches of rot pathogen isolated from Chinese cherry（Prunus pseudocerasus）

LING Danyan， LIYongqiang， LU Mei， GUOWeidong
（College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China）

To identify the pathogen causing Chinese cherry（Prunus pseudocerasus）rot，tissue separation and monospore isolation were used to isolate and purify the pathogen.The pathogen identification was carried out based on Koch＇s postulates，morphology and ribosomal internal transcribed spacer genes（rDNA-ITS）.And partial biological characteristics of the pathogen were tested in vitro at the same time.The results showed that the rot pathogen diseasewas caused by Cytospora chrysosperma（KR260904），and the optimum pH for itsmycelia growth and conidia germination was9，and the optimum illumination was12 h of illumination followed by 12 h of darkness，the optimum temperaturewas25℃.In 10 kinds of carbon and nitrogen source，lactose and peptone were better formycelia growth，while glucose and yeast promoted obviously conidia germination.The resultswould be helpful for the illumination of the pathogenesis and infection mechanism of the disease.

Chinese cherry；rot pathogen；Cytospora chrysosperma；identification；biological characteristics

Q945.8

A

1001-5051（2016）02-0200-07

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.02.013

*收文日期：2015-04-20；2015-06-05

浙江省重中之重學科“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)與作物病害防控”開放基金資助項目（2012KFJJ014）；浙江省自然科學基金資助項目（Y3110194）

凌丹燕（1990-），女，浙江海寧人，碩士研究生.研究方向：生物化學與分子生物學.

路梅.E-mail：lumei@zjnu.cn