孫杰，陳梁，婁波，白彥兵，汪釗

（1.億帆鑫富藥業(yè)股份有限公司博士后科研工作站，浙江臨安311300；2.浙江工業(yè)大學生物工程學院，浙江杭州310014）

催化蔗糖-6-乙酸酯合成的微生物篩選和培養(yǎng)條件優(yōu)化

孫杰1，2，陳梁1，婁波1，白彥兵1，汪釗2

（1.億帆鑫富藥業(yè)股份有限公司博士后科研工作站，浙江臨安311300；2.浙江工業(yè)大學生物工程學院，浙江杭州310014）

三氯蔗糖是目前最優(yōu)秀的功能性甜味劑之一，其合成的關(guān)鍵步驟是蔗糖-6-乙酸酯的合成。從土壤中分離到一株能夠在有機溶劑中催化合成蔗糖-6-乙酸酯的桿狀細菌，命名為WZS01。對該菌株的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了初步優(yōu)化，在2.5%葡萄糖，1%蛋白胨，0.1%酵母粉培養(yǎng)基中，以聚氨酯泡沫作為菌體固定化基質(zhì)，30℃培養(yǎng)18 h。將吸附有菌體的聚氨酯泡沫干燥后作為催化劑，在2%底物濃度下，在二甲基甲酰胺/叔丁醇反應(yīng)介質(zhì)中催化18 h，蔗糖-6-乙酸酯的摩爾產(chǎn)率達到83.3%，并通過紅外和核磁確認了產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。

三氯蔗糖；蔗糖-6-乙酸酯；固定化細胞；聚氨酯泡沫

三氯蔗糖是一種基于蔗糖合成的新型甜味劑，具有甜度高、味質(zhì)好、儲存期長、無熱量和安全性高等優(yōu)點。三氯蔗糖合成的關(guān)鍵步驟是蔗糖-6-乙酸酯的合成。目前蔗糖-6-乙酸酯的合成以化學法為主，化學法反應(yīng)條件苛刻、區(qū)域選擇性較差、容易生成副產(chǎn)物，導(dǎo)致合成產(chǎn)物純度較低，影響了產(chǎn)品的質(zhì)量［1-2］。酶催化反應(yīng)因為具有區(qū)域選擇性強、反應(yīng)條件溫和等諸多優(yōu)點，成為了蔗糖酯選擇性合成中的研究熱點。能特異性酯化蔗糖6位羥基的脂肪酶菌種來源有假單胞菌［3］、米黑毛霉［4］和柔毛腐質(zhì)霉［5］，主要用于合成長鏈酯。能夠高效合成短鏈的蔗糖-6-乙酸酯的脂肪酶種類還較少。王等［6］使用諾維信公司固定化脂肪酶Lipozyme TLIM，以乙酸乙烯酯作為?；w，二甲基亞砜（DMSO）作為蔗糖助溶劑，合成的蔗糖-6-乙酸酯得率將近90%。上述Lipozyme TLIM脂肪酶來自于疏棉狀嗜熱絲孢菌，是目前報道的催化蔗糖合成蔗糖-6-乙酸酯效果最好的商品化脂肪酶。但是商品化脂肪酶成本較高，無法應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。

本課題組篩選得到了一株能夠以二甲基甲酰胺（DMF）作為蔗糖助溶劑合成蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)酶菌株，編號為WZS01。在三氯蔗糖合成過程中，蔗糖-6-乙酸酯合成之后，需要在DMF存在下進行氯化反應(yīng)，因而DMF無需去除。進一步通過單因素法對該菌株的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行了初步優(yōu)化，以提高其產(chǎn)酶活性。蔗糖-6-乙酸酯的合成需要在無水的有機相中進行，我們使用固態(tài)基質(zhì)在培養(yǎng)過程中對細胞進行了固定化，為制備高效、專一的生物催化劑及其以后的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試劑

蔗糖-6-乙酸酯標品購于Sigma公司；三丁酸甘油酯、叔丁醇、4?分子篩購于上海阿拉丁生化公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基（W/V）：酵母提取物0.5%，蛋白胨0.1%，氯化鈉0.1%。115℃滅菌30min。

液體富集培養(yǎng)基（W/V）：橄欖油3.0%，Tween-80 0.5%，（NH4）2SO40.50%，K2HPO40.35%，KH2PO40.10%，NaCl 0.25%，MgSO4·7H2O 0.05%。

初篩平板培養(yǎng)基（W/V）：三丁酸甘油酯2.0%，（NH4）2SO40.50%，K2HPO40.35%，KH2PO40.10%，NaCl 0.25%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂粉1.5%。115℃滅菌30min。滅菌后，在100mL培養(yǎng)基中，加入0.1 g溴百里酚藍作為酸堿指示劑，混勻，60℃左右倒平板，冷卻凝固。

初始培養(yǎng)基（W/V）：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉0.1%。115℃滅菌15min。（注：在每批培養(yǎng)基優(yōu)化實驗中，均保留了0.1%的酵母粉，是為了保留其中所含的微生物生長發(fā)育所需的生長因子）。

1.3方法

1.3.1菌株篩選

將1 g采集的土樣溶于10 mL無菌水中，靜置后取0.1 mL上層液體接入5 mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜。取1 mL過夜培養(yǎng)物，加至20 mL液體富集培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。將富集菌液稀釋108倍，取100μL稀釋液涂布于初篩平板上，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一天。挑取菌落顏色變?yōu)辄S色的不同形態(tài)的單菌落，接種至含橄欖油的液體富集培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。

吸取1 mL上述菌液于離心管中，離心、烘干菌體，加入含10%蔗糖的DMF 0.2mL，叔丁醇0.8mL，乙酸乙烯酯0.056mL，30℃反應(yīng)1 h合成蔗糖-6-乙酸酯。該反應(yīng)過程中釋放乙醛，使用Zheng等［7］的顯色方法，可以對乙醛定量，從而反映出酶活力的大小。取20倍稀釋的反應(yīng)液100 μL，加入100μL 0.1%酚試劑，反應(yīng)10 min，再加入40μL 0.1 mol/L鹽酸配制的質(zhì)量分數(shù)為1%的NH4Fe（SO4）2·12H2O試劑，反應(yīng)30 min；酶標儀測定OD598。將OD值較高的菌種，培養(yǎng)后進行蔗糖-6-乙酸酯催化反應(yīng)，反應(yīng)24 h，液相測定產(chǎn)物譜。

1.3.2菌體細胞培養(yǎng)條件優(yōu)化

將菌株WZS01接種于5 mL的培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min恒溫搖床培養(yǎng)12 h。取0.5mL種子液，接入50mL的初始培養(yǎng)基中。采用單因素實驗的方法，分別從發(fā)酵碳源、氮源、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等方面研究不同因素對菌株WZS01產(chǎn)酶的影響，以探究菌株的最佳培養(yǎng)基配方和最適發(fā)酵產(chǎn)酶條件。如無特別說明，所有實驗均重復(fù)三次。

1.3.3菌體細胞固定化

聚氨酯泡沫是生活中常見的包裝和裝飾材料，本實驗使用聚氨酯泡沫作為固定化載體。將其切割成尺寸為1 cm3的小塊，在去離子水中煮沸后，烘箱干燥。向50mL培養(yǎng)基中加入0.4 g切成小塊的聚氨酯泡沫作為固定化基質(zhì)，115℃滅菌15min，冷卻后接種1%的WZS01種子液，30℃培養(yǎng)。

1.3.4生物轉(zhuǎn)化條件

發(fā)酵結(jié)束后，取出聚氨酯泡沫，擠凈培養(yǎng)基，干燥后取0.2 g作為催化劑，反應(yīng)體系包括底物蔗糖0.2 g，DMF 2 mL，叔丁醇8mL，乙酸乙烯酯0.56 mL，30℃反應(yīng)18 h。

1.3.5產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定與濃度測定

將1 g蔗糖溶于50 mL溶劑（V（DMF）∶V（叔丁醇）=1∶4）中，加入0.8 g吸附有WZS01菌的聚氨酯泡沫，2.8mL乙酸乙烯酯，32℃反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后離心，取上清。60℃低壓蒸餾去除叔丁醇，向得到的含有蔗糖6酯的DMF溶液中加入4倍體積的二氯甲烷，離心收集沉淀，即為蔗糖-6-乙酸酯粗品。

取0.4 g粗品用硅膠G層析柱純化，洗脫液為V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（水）=8∶1∶1，流速為0.8 mL/min，收集流出液，60℃下真空濃縮。

使用Bruker Tensor 27紅外光譜分析儀（KI壓片法）和Bruker VANCE III核磁共振儀（400 MHz），確定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。

使用Waters 2695高效液相色譜，測定蔗糖-6-乙酸酯含量，液相檢測條件為Diamonsil?C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）柱，流動相為V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（水）=8∶1∶1，流速1.0 mL/min，溫度35℃，示差檢測器。

2　結(jié)果與討論

2.1菌種篩選

在有機溶劑存在時，大多數(shù)微生物幾乎喪失代謝功能并停止生長，而且酶在有機溶劑中變性或失活，而脂肪酶對有機溶劑具有一定的耐受性，可以使用脂肪酶或者合成脂肪酶的微生物細胞作為催化劑，在非水相中進行酶促反應(yīng)。在本研究中，我們對300份土樣進行了大量的分離篩選工作，最終篩選出一株能夠催化合成蔗糖-6-乙酸酯的菌株，命名為WZS01。該菌株菌落為白色、半透明、光滑濕潤，革蘭氏染色菌體為紫色，為革蘭氏陽性菌，桿狀。下面進一步對該菌株的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行初步優(yōu)化。

2.2最適碳源及濃度的確定

碳源是微生物生存的一類基礎(chǔ)營養(yǎng)物，不同的碳源導(dǎo)致微生物生長發(fā)育狀態(tài)不同，產(chǎn)酶體系也隨之變化。在2%葡萄糖，2%蛋白胨，0.1%酵母粉培養(yǎng)基基礎(chǔ)上更改，本實驗根據(jù)實驗室現(xiàn)有的各種碳源進行了單因素實驗。分別以2%的乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、甘油作為碳源。菌株WZS01 30℃培養(yǎng)24 h，取0.5mL培養(yǎng)物干燥后進行反應(yīng)，5mL反應(yīng)體系，反應(yīng)30 min，按Zheng等［7］的方法，測定相對反應(yīng)初速度。

圖1（a）結(jié)果顯示：不同的碳源對菌體產(chǎn)脂肪酶的影響較大，麥芽糖、淀粉和甘油作為碳源時，酶活性較低；而以葡萄糖、乳糖或蔗糖為碳源時，菌體酶活性較好，其中葡萄糖最好。因此選擇葡萄糖作為最優(yōu)碳源。

進一步考察了葡萄糖濃度對菌株WZS01產(chǎn)酶的影響。從圖1（b）可以看出：隨著葡萄糖濃度的升高，菌株的產(chǎn)酶活性先升高后降低；當葡萄糖濃度達到2.5%時，反應(yīng)初速度達到了最大值；當葡萄糖濃度繼續(xù)提高至4.0%時，酶活顯著降低。分析這一現(xiàn)象的原因，可能是發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度過高，菌體生長代謝活動旺盛，容易引起菌種衰老，并且不利于菌體脂肪酶的合成。綜合以上因素，本實驗選擇2.5%的葡萄糖濃度作為最適碳源濃度。

2.3最適氮源及濃度的確定

氮源是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的重要營養(yǎng)來源，不同氮源和濃度對菌體的生長和發(fā)酵產(chǎn)酶有重要影響。在碳源為葡萄糖，濃度為2.5%條件下，本實驗選擇添加1%的有機氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米粉）或無機氮源（硫酸銨、硝酸鈉、氯化銨），考察不同氮源對菌株WZS01產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖2所示。圖2（a）顯示：該菌株對有機氮源的利用效果優(yōu)于無機氮源，以牛肉膏、蛋白胨或酵母粉為氮源時，產(chǎn)酶活性高；以蛋白胨作為氮源時，菌株合成蔗糖-6-乙酸酯的反應(yīng)初速度最大，即產(chǎn)酶效果最佳。因此，選擇蛋白胨作為最適氮源。

實驗進一步考察了蛋白胨濃度對菌株WZS01發(fā)酵及產(chǎn)酶的影響。由圖2（b）可知：當?shù)鞍纂藵舛葹?%時，酶活最高；蛋白胨濃度再提高，酶的活性也稍有降低。本實驗選擇1%蛋白胨作為最適氮源濃度。

2.4最適發(fā)酵溫度確定

發(fā)酵溫度對微生物生長和酶的活性具有顯著影響。溫度對發(fā)酵過程的影響及調(diào)節(jié)控制是影響微生物生長繁殖的重要因素之一。在以上實驗的基礎(chǔ)上，本實驗以2.5%的葡萄糖作為碳源，1%的蛋白胨作為氮源，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，分別以26、28、30、32、34和36℃恒溫培養(yǎng)24 h。之后取相同體積發(fā)酵液離心，烘干菌體，考察不同發(fā)酵溫度對菌株WZS01產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3所示。30℃培養(yǎng)時，單位體積發(fā)酵液的蔗糖-6-乙酸酯催化活性最高。

2.5細胞固定化

細胞固定化可以增強酶在有機溶劑反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性，提高底物轉(zhuǎn)化效率。將密度接近10、30和50 kg/m3的聚氨酯泡沫小塊與菌體30℃共同培養(yǎng)18 h。稱取干燥后的吸附有菌體的聚氨酯泡沫小塊0.2 g作為催化劑，反應(yīng)體系為蔗糖0.2 g，DMF 2mL，叔丁醇8mL，乙酸乙烯酯0.56mL，反應(yīng)時間18 h，在相同條件下以0.2 g干燥的游離菌體細胞作為對照進行反應(yīng)，蔗糖-6-乙酸酯產(chǎn)率如圖4所示。實驗結(jié)果表明：使用聚氨酯泡沫固定化菌體細胞，可以大幅度提高蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率；其中低密度聚氨酯泡沫吸附的菌體較高密度聚氨酯泡沫更多，因而催化蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率更高。以密度10 kg/m3的聚氨酯泡沫為固定化載體，放入培養(yǎng)基中與菌體一同培養(yǎng)不同時間，結(jié)果表明培養(yǎng)18 h得到的固定化細胞蔗糖-6-乙酸酯產(chǎn)率較其他時間更高（圖5）。

2.6蔗糖-6-乙酸酯的純化與鑒定

使用上述細胞固定化方法和催化條件，得到純度為86.1%的蔗糖-6-乙酸酯粗品。進一步取0.4 g粗品用硅膠G層析柱純化，真空濃縮后，得到0.15 g蔗糖-6-乙酸酯，純度為96%。

紅外光譜分析（KI壓片法）：3 392.81（-OH），2 924.90（烷烴飽和C-H），1 729.35（C=O），1 253.88（酯基C-O），1 046.28（C-O-C），927.97（α-糖苷鍵）。

核磁共振分析13C圖譜結(jié)果：13C NMR （C2D6SO，400 MHz）：170.85（-COCH2），103.91（C2′），91.58（C1），82.75（C5′），77.12（C3′），74.66（C4′），72.88（C3），71.63（C2），70.34（C5），70.17（C4），63.95 （C′），62.74（C6′），62.43（C1′），20.84（-COCH2）。

上述圖譜符合蔗糖-6-乙酸酯的結(jié)構(gòu)特征，與Yang等［8］的報道一致。

3　結(jié)論

在三氯蔗糖合成過程中，蔗糖-6-乙酸酯合成后，需要在DMF存在下進行氯化反應(yīng)。我們篩選得到了一株能夠以DMF作為蔗糖助溶劑合成蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)酶菌株，編號為WZS01。DMF可以在下一步氯化步驟中繼續(xù)使用，無需去除。在2.5%葡萄糖，1%蛋白胨，0.1%酵母粉培養(yǎng)基中，以聚氨酯泡沫作為菌體固定化基質(zhì)，30℃培養(yǎng)18 h。將吸附有菌體的聚氨酯泡沫干燥后，在0.2 g蔗糖，2 mL DMF，8 mL叔丁醇，和0.56mL乙酸乙烯酯的反應(yīng)體系中催化18 h，蔗糖-6-乙酸酯的摩爾產(chǎn)率達到83.3%。本研究為制備WZS01全細胞生物催化劑及其在三氯蔗糖制備過程中的應(yīng)用，打下了堅實的基礎(chǔ)。

［1］陳志剛，宗敏華，婁文勇.非水介質(zhì)中酶促糖酯合成研究進展［J］.分子催化，2007，21（l）：90-95.

［2］李鵬飛，袁冰，畢晨光，等.合成蔗糖-6-酯的研究進展［J］.化工中間體，2006（6）：1-3，19.

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［8］YANG Xu’e，ZHENG Pu，NI Ye，et al.Highly efficient biosynthesis of sucrose-6-acetate with cross-linked aggregates of Lipozyme TL 100 L［J］.Journal of biotechnology，2012，161 （1）：27-33.

（責任編輯：朱小惠）

Screening of strains for sucrose-6-acetate synthesis and optim ization of culture conditions

SUN Jie1，2，CHEN Liang1，LOU Bo1，BAIYanbin1，WANG Zhao2
（1.Postdoctoral Research Station of Yi Fan Xin Fu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Linan 311300，China；2.College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Sucralose is one of the best functional sweeteners currently.The key step of sucralose synthesis is preparation of sucrose-6-acetate.An organic solvent tolerant and rod-shaped bacterium WZS01，which can synthesize sucrose-6-acetate with sucrose as substrate was isolated. The media and culture conditions were optimized.The cells were immobilized on polyurethane foam after cultured 18 h in sterile medium containing glucose 2.5%，peptone 1%，and yeast extract 0.1%.The dried immobilized cells were used for sucrose-6-acetate synthesis in dimethyl formamide/tert butyl alcohol and the yield of sucrose-6-acetate reached 83.3%with 2%sucrose after 18 h reaction.The structure of sucrose-6-acetate was confirmed by IR and NMR.

sucralose；sucrose-6-acetate；immobilized cell；polyurethane foam

TQ92

A

1674-2214（2016）03-0147-05

2016-06-22

中國博士后基金項目（2014M561788）；浙江省2014年博士后科研擇優(yōu)資助項目

孫杰（1981—），男，內(nèi)蒙古包頭人，講師，博士，研究方向為生物催化，E-mail：jsun@zjut.edu.cn.通信作者：汪釗教授，E-mail：hzwangzhao@163.com.