王宇光，葉秋娟，吳冬梅，魏春

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

研究報(bào)告

生物催化法水解制備N-BOC-L-α-氨基丁酸

王宇光，葉秋娟，吳冬梅，魏春

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

利用實(shí)驗(yàn)室篩選得到的高立體選擇性脂肪酶產(chǎn)生菌株溜曲霉（Aspergillus tamarii WYC3）不對(duì)稱水解拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯得到N-BOC-L-α-氨基丁酸，對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行研究，確定其最優(yōu)反應(yīng)條件為：0.1mol/L pH 7.2的磷酸鉀緩沖液，反應(yīng)溫度30℃，底物濃度52.24 mmol/L，0.1 g菌粉，V（底物）∶V（丙酮）=1∶8，200 r/min恒溫水浴反應(yīng)6 h，可獲得產(chǎn)物N-BOC-L-α-氨基丁酸，此時(shí)e.e.s值達(dá)到99.95%，對(duì)映體選擇率E值為20.11，產(chǎn)率為36.21%。

N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯；N-BOC-α-氨基丁酸；Aspergillus tamarii WYC3；水解反應(yīng)；工藝優(yōu)化

N-BOC-DL-α-氨基丁酸酯是一種重要的生化試劑，用于合成多肽或模擬肽和保護(hù)氨基酸單體。N-BOC-DL-α-氨基丁酸酯可以通過化學(xué)水解獲得L-α-氨基丁酸。L-α-氨基丁酸不僅可以參與人體內(nèi)信息傳遞，對(duì)代謝具有積極的影響，還是重要的醫(yī)藥與化工原料的中間體。現(xiàn)今L-α-氨基丁酸在化工與醫(yī)藥業(yè)中的作用日趨增大，其需求量也在逐漸增多，以每年15%甚至更高的速率增長(zhǎng)［1］。由于L-α-氨基丁酸屬于非天然氨基酸，無(wú)法自然獲得，因此L-α-氨基丁酸的制備已成為研究熱點(diǎn)。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的制備L-α-氨基丁酸的主要方法包括化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法分化學(xué)合成法（有脫硫反應(yīng)法［2-6］、α-鹵代酸的氨解法［7-8］、丁酮酸還原法（外消旋）［9］和氨化水解反應(yīng)法［10］）和化學(xué)拆分法［11］。生物法分為生物酶法和生物發(fā)酵法，生物酶法催化制備手性氨基酸避免了化學(xué)合成法存在的大部分缺點(diǎn)，具有立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)成本低、污染少等優(yōu)點(diǎn)，慢慢取代一些化學(xué)法成為新的發(fā)展方向。生物酶法中尚無(wú)利用脂肪酶催化制備手性L-α-氨基丁酸的研究報(bào)道，但有通過其他酶法（氨基轉(zhuǎn)移酶催化法［12］、氨基?；覆鸱址ǎ?3］和氧化還原酶催化法［14］）來(lái)制備手性L-α-氨基丁酸的相關(guān)報(bào)道，可是其催化效果都不甚理想，一般需要兩步或兩步以上的催化反應(yīng)過程，有些還需要添加昂貴的催化劑或輔酶，不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要。與之相比，脂肪酶（EC 3.1.1.3）作為一類能夠催化三酰甘油酯水解成甘油、甘油單酯、甘油二酯和脂肪酸的反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好的生物催化劑［15］，具有多種催化能力，可以催化多種酯類化合物的酯化、轉(zhuǎn)酯化、醇解、水解以及酯類化合物的逆向合成反應(yīng)，且反應(yīng)過程快速，操作簡(jiǎn)便，因此在催化合成新型化合物中逐漸變得更有優(yōu)勢(shì)［16］。

本文以N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯為底物，在Aspergillus tamarii WYC3菌體作用下進(jìn)行脂肪酶不對(duì)稱水解拆分反應(yīng)，并通過對(duì)其反應(yīng)條件的優(yōu)化，得到光學(xué)純N-BOC-L-α-氨基丁酸。NBOC-L-α-氨基丁酸之后用鹽酸處理脫BOC基團(tuán)后即可得到L-α-氨基丁酸。反應(yīng)過程見圖1。

1　材料和方法

1.1菌株

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)低溫保藏的高立體選擇性脂肪酶產(chǎn)生菌株Aspergillus tamarii WYC3。

1.2主要試劑

實(shí)驗(yàn)室所需的N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯購(gòu)買自阿拉丁試劑有限公司，乙酸乙酯、丙酮等本實(shí)驗(yàn)使用的試劑均為市售的分析純。

1.3培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鉀1 g，蔗糖20 g，硝酸鈉3 g，硫酸亞鐵0.01 g，水1 000mL，pH 7.0。121℃滅菌20min。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，新鮮去皮后的土豆200 g，切成小塊，水中煮沸約半小時(shí)，紗布過濾，濾液加入20 g蔗糖，20 g瓊脂，補(bǔ)足水至1 000mL。121℃滅菌20min。

1.4菌粉制備

以1%的接種量將菌懸液接種到50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中。然后在恒溫?fù)u床中30℃、200 r/min培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)結(jié)束后，用紗布過濾發(fā)酵液獲得菌體，然后用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖溶液（pH 7.0）沖洗數(shù)次，將其懸浮于同樣的磷酸鉀緩沖溶液中。使用真空冷凍干燥機(jī)真空冷凍干燥得到Aspergillus tamari WYC3的凍干菌粉。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1氣相色譜分析方法

采取GC-2010氣相色譜儀來(lái)檢驗(yàn)N-BOCDL-α-氨基丁酸甲酯及其產(chǎn)物N-BOC-L-α-氨基丁酸。所選用的手性氣相色譜柱型號(hào)為BGB-175。載氣氣體：N2（70 kPa）；空氣流：300mL/min；尾吹氣流量：30 mL/min；進(jìn)樣量：1μL；進(jìn)樣口溫度：220℃；分流比50∶1；柱箱：初始溫度120℃保持2min后，以4℃/min的速度升溫至195℃，保持2 min；色譜柱恒定流量：1 mL/min；檢測(cè)器：FID，溫度為250℃。N-BOC-D-α-氨基丁酸甲酯和N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯分別在11.238min 和11.375 min出峰，水解產(chǎn)物BOC-D-α-氨基丁酸和BOC-L-α-氨基丁酸分別在20.712 min和20.946min出峰。

底物的對(duì)映體過量值簡(jiǎn)稱e.e.s、產(chǎn)物的對(duì)映體過量值簡(jiǎn)稱e.e.P、反應(yīng)轉(zhuǎn)化率C和產(chǎn)率由氣相色譜儀測(cè)定出的各物質(zhì)的峰面積計(jì)算［17］，對(duì)映體選擇性E值根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算。

1.5.2N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯水解反應(yīng)條件單因素實(shí)驗(yàn)

基本的反應(yīng)體系為菌體添加量為0.02 g/mL，加入5mL含有50μL底物N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯，pH 7.0的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖溶液，放入30℃的恒溫水浴搖床中，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/ min，反應(yīng)6 h。在此基礎(chǔ)上，控制變量，依次設(shè)置不同的單因素，pH值分別為6.0、6.4、6.8、7.0、7.2、7.6、8.0的磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L）；恒溫水浴溫度設(shè)置為15、20、25、30、35、40、45和50℃；底物N-BOC-α-氨基丁酸甲酯的濃度為26.12、52.24、78.36、104.48、130.60、156.72、182.85、208.97 mmol/L，通過實(shí)驗(yàn)確定最佳水解條件，每組單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)3次。

2　結(jié)果與討論

在無(wú)催化劑的情況下，底物N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的自發(fā)水解率非常低（8 h內(nèi)小于6%），幾乎可以忽略不計(jì)。因此，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)為減小誤差，一般將轉(zhuǎn)化時(shí)間控制在8 h以內(nèi)。

2.1緩沖溶液pH對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

緩沖液的種類和pH對(duì)水解制備N-BOC-L-α-氨基丁酸具有一定的影響，因?yàn)樗苡绊懙剿饷傅目臻g結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變底物的解離狀態(tài)，最后影響到酶活性中心和底物的結(jié)合效果。

緩沖溶液pH的平行對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示：在緩沖液體系中，隨著pH的逐漸增大，底物N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的e.e.s值、對(duì)映體選擇率E值和水解產(chǎn)率也逐漸增大；在pH 7.2略偏堿性的緩沖體系環(huán)境下，達(dá)到最大值；pH繼續(xù)升高，圖中的底物N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的e.e.s值、對(duì)映體選擇率E值和水解產(chǎn)率都有所下降。所以選擇pH 7.2的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液為酶催化反應(yīng)的最優(yōu)條件。在此條件下，底物e. e.s大于99%，E值為20.34，產(chǎn)物N-BOC-L-α-氨基丁酸的產(chǎn)率為36.31%。

2.2溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

通過溫度的平行對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，可得到圖3。從圖中可得：隨著溫度的逐漸升高，底物N-BOCDL-α-氨基丁酸甲酯的e.e.s值、對(duì)映體選擇率E值和水解產(chǎn)率也逐漸增大，在溫度達(dá)到30℃時(shí)達(dá)到最大值；溫度繼續(xù)升高，圖中的對(duì)映體選擇率E值和水解產(chǎn)率都從緩慢下降變?yōu)榧眲∠陆怠?/p>

因?yàn)闇囟壬呤沟孜锓肿拥臒徇\(yùn)動(dòng)加快，酶活性增強(qiáng)，從而酶促反應(yīng)速率也加快。而溫度繼續(xù)升高，出現(xiàn)水解產(chǎn)率先緩慢降低然后快速下降的狀況，這是因?yàn)闇囟鹊闹饾u升高使得酶變性，逐漸失去酶活力，使得酶促反應(yīng)速率大大降低甚至停止。從綠色經(jīng)濟(jì)高效的角度考慮，此催化反應(yīng)的最優(yōu)溫度為30℃。在此條件下，底物e.e.s大于99%，E值為19.78，產(chǎn)物N-BOC-L-α-氨基丁酸的產(chǎn)率為35.96%。

2.3底物濃度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響

確定菌粉質(zhì)量0.1 g不變，通過改變底物濃度的平行對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，可得到圖4。如圖所示：隨著底物濃度的逐漸升高，底物N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的e.e.s值一直維持在99%以上，但是所需反應(yīng)時(shí)間開始加長(zhǎng)，并且產(chǎn)率也有所下降；底物濃度為130.60mmol/L開始，即使延長(zhǎng)時(shí)間，底物也無(wú)法完全反應(yīng)，且產(chǎn)率也大幅下降；當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到208.97mmol/L后，產(chǎn)率達(dá)到最低。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛容^低，酶的活性中心未達(dá)到飽和，利用率較低。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時(shí)，抑制了酶催化活性中心的活性，使得酶的活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變甚至是失活，使得酶促反應(yīng)速率大大降低甚至停止。

所以選擇酶催化反應(yīng)的最佳底物濃度為52.24 mmol/L。此時(shí)底物e.e.s大于99%，E值為25.65，產(chǎn)物N-BOC-L-α-氨基丁酸的產(chǎn)率為35.58%。

2.4反應(yīng)時(shí)間曲線

由圖5所示：隨著反應(yīng)時(shí)間的加長(zhǎng)，底物NBOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的e.e.s值、對(duì)映體選擇率E值和水解產(chǎn)率也逐漸增大；在4 h以后，e.e.s值達(dá)到90%以上，5 h后達(dá)到98%，6 h后達(dá)到99%以上；在反應(yīng)開始1 h后就開始有水解產(chǎn)物N-BOC-α-氨基丁酸生成；隨著時(shí)間的加長(zhǎng)，其水解產(chǎn)物產(chǎn)率逐漸增大，并且在6 h時(shí)達(dá)到最高；6 h之后反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，但其e.e.s值、E值和水解產(chǎn)率幾乎維持不變，反應(yīng)達(dá)到飽和。為了高效率地水解拆分底物，選擇最優(yōu)時(shí)間是6 h。在此條件下，底物e.e.s大于99%，E值為20.22，產(chǎn)物N-BOCL-α-氨基丁酸的產(chǎn)率為36.21%。

3　結(jié)論

通過對(duì)Aspergillus tamarii WYC3菌體水解動(dòng)力學(xué)拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯反應(yīng)的底物濃度、pH、溫度和反應(yīng)時(shí)間的研究，最終確定最優(yōu)催化反應(yīng)條件為：0.1mol/L pH 7.2的磷酸鉀緩沖液中，反應(yīng)溫度30℃，底物濃度52.24mmol/ L，0.1 g菌粉，V（底物）∶V（丙酮）=1∶8，200 r/min恒溫水浴反應(yīng)6 h，可獲得產(chǎn)物N-BOC-L-α-氨基丁酸，此時(shí)e.e.s值達(dá)到99.95%，對(duì)映體選擇率E值為20.11，產(chǎn)率為36.21%。

本實(shí)驗(yàn)為獲得L-α-氨基丁酸提供了一種新的生物酶水解方法，該反應(yīng)條件溫和、毒性小、產(chǎn)物產(chǎn)率較高、光學(xué)純度高，對(duì)制備高效、專一的生物催化劑以及其進(jìn)一步的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Preparation of N-L-α-am inobutyric acid by biocatalytic hydrolysis

WANG Yuguang，YEQiujuan，WU Dongmei，WEIChun

（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Aspergillus tamarii strain WYC3 producing lipase was screened from soil samples，which showed high stereoselectivity and hydrolytic activity toward N-BOC-DL-α-amino butyric acidmethyl ester.The high enantiomeric excess（e.e.s）of 99.95%and enantiomeric ratio（E value）of 20.11 were achieved when the yield of N-BOC-L-α-amino butyric acid reached 36.21%.The reaction conditionswere optimized as follows：pH 7.2，temperature 30°C and 200 r/min，substrate concentration 52.24 mmol/L，biocatalyst powder 0.1g and V（substrate）∶V（acetone）=1∶8.

N-BOC-DL-α-amino butyric acid methyl ester；N-BOC-L-α-amino butyric acid；Aspergillus tamarii WYC3；asymmetric hydrolysis；process optimization.

TQ033

A

1674-2214（2016）03-0129-04

2016-03-08

王宇光（1972—），男，內(nèi)蒙古包頭人，副教授，博士，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)與生物制藥，E-mail：yuguangw@zjut.edu.cn.